Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis

Диссертация: Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Вакцинация — наиболее экономически целесообразный метод борьбы с распространением инфекционных заболеваний. Эпидемиологически обоснованное применение вакцин значительно снизило заболеваемость и смертность от таких наносящих значительный экономический ущерб болезней как корь, полиомиелит, дифтерия, пневмококковые инфекции и др. Триумфом вакцинации явилось искоренение оспы во всем мире. В рамках… Читать ещё >

Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Открытие V антигена, условия биосинтеза, выделение, очистка и физико-химические свойства
    • 1. 2. V Антиген как фактор патогености
      • 1. 2. 1. Регуляторная функция V антигена
      • 1. 2. 2. Иммуномодулирующая функция
      • 1. 2. 3. Функция контроля транслокацииУор эффекторов
    • 1. 3. Генетическое разнообразие и трехмерная структура белка ЬсгУ
    • 1. 4. Иммуногенная активность V антигена
    • 1. 5. V антиген и вакцинопрофилактика чумы

Актуальность проблемы. V антиген (LcrV) — полифункциональный фактор вирулентности и один из основных протективных антигенов иерсиний [224]. Он представляет собой полипептид с молекулярной массой 37 кДа [181], кодируемый геном IcrV, расположенным на плазмиде вирулентности (кальцийзависимости) патогенных для человека представителей рода Yersinia: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Установлено, что V антиген ингибирует хемотаксис нейтрофилов и запускает механизм супрессии провоспалительных цитокинов [230, 150]. Этот белок регулирует работу многокомпонентной системы секреции белков третьего типа (type 3 secretion systemT3SS) путем прямого влияния на собственно секрецию эффекторных белков Yop (Yersinia outer proteins) и опосредованно — на транскрипцию их генов, а также на перенос белков-эффекторов внутрь эукариотической клетки-мишени [35, 180].

Нуклеотидную последовательность гена IcrV из штамма Y. pestis KIM в 1989 г. опубликовал коллектив авторов из Университета Кентукки (США) [181]. Позднее шведские исследователи из Университета Умеа секвенировали аналогичный ген из штамма Y. pseudotuberculosis YPIII, а российские ученые из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи — из штамма Y. pseudotuberculosis 995 [35, 147].

По полиморфизму структуры гипервариабельной области на N-конце молекулы в пределах 40−61 а.о. (TLR2 — активный район) V антигены делят на семь классов. Первый из них составляют последовательности белка Y pestis и Y. pseudotuberculosis, остальные шесть вариантов найдены только у Y. enterocolitica, причем отдельные структурные варианты отличались по своей иммуносупрессионной активности [199].

V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis, то есть штаммах основного подвида subsp. pestis [20, 147]. Вариации в нуклеотидных последовательностях гена IcrV были описаны для штаммов неосновного подвида Y. pestis («полевочьи» штаммы): Pestoides F [20] и 91 001 [210, 244], циркулирующих в популяциях полевок в закавказском высокогорном очаге (Азербайджан, Грузия или Армения) и степях Внутренней Монголии (Китай), соответственно.

Большинство исследований V антигена, включая оценку его протективной активности [50, 224, 127, 143, 146], способности образовывать олигомеры [43, 53, 179, 220], иммуносупрессивной активности [179, 146, 201, 208] и определения трехмерной структуры [74] проведены с использованием молекул LcrV «классического» (описываемого нами как D) типа.

В тоже время единичные эксперименты по оценке свойств препаратов V антигена Y. pestis, отличающихся по аминокислотным последовательностям, свидетельствуют об отсутствии перекрестной протективности. Оба описанных серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [105, 190].

Анализ генетического и структурно-функционального полиморфизма V антигена возбудителя чумы с привлечением комплекса методов микробиологии, генной инженерии, биохимии, иммунологии и компьютерного моделирования позволит получить новые сведения о роли различных структурных вариантов V антигена в патогенезе и иммуногенезе чумы, а также о степени его изменчивости в ходе микроэволюции Y. pestis у представителей различных внутривидовых групп. Это создаст основу для разработки методологии получения технологичных штаммов-продуцентов с максимальным уровнем продукции высокопротективных вариантов V антигена, необходимую для конструирования экспериментальных вакцин нового поколения.

Цель исследования — структурно-функциональный и генетический анализ V антигена Y. pestis для рационального конструирования субъединичных противочумных вакцин.

Задачи исследования:

1. Изучить полиморфизм нуклеотидных последовательностей IcrV генов и аминокислотных последовательностей соответствующих им полипептидов у представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и оценить влияние структуры V антигена на избирательную вирулентность «полевочьих» штаммов возбудителя чумы.

2. Провести компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis.

3. Осуществить молекулярное клонирование генов различных структурных вариантов V антигена Y. pestis, провести выделение и очистку рекомбинантных белков.

4. Изучить иммуногенность различных структурных вариантов V антигена Y. pestis.

Научная новизна.

Приоритет в определении нуклеотидной последовательности, кодирующей им-муногенный полипептид LcrY (G113), вызывающий защитный иммунный ответ против Y. pestis, и в конструировании рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pETV 13 455 — продуцента иммуногенного полипептида LcrV (G113) защищен патентом на изобретение № 2 439 155 С1 РФ от 02.06.2010 г. Заявка № 2 010 120 197/10(28 733). Опубликовано 10.01.2012.

Выявлены три новых структурных типа V антигена Y. pestis. Показано, что LcrV типа D, характерный для эпидемически значимых штаммов Y pestis subsp. pestis, также широко распространен среди наиболее филогенетически древних штаммов различных биоваров subsp. microtus. Только 39% от изученных «полевочьих» штаммов обладают вариантными структурами LcrV (отличными от типа D).

Установлено, что структурный полиморфизм V антигена Y. pestis не является причиной избирательной вирулентности «полевочьих» штаммов.

Проведено компьютерное моделирование трехмерной структуры V антигена типа, А и проведена оценка влияния выявленного структурного полиморфизма V антигена Y. pestis на структуру молекулы.

Показано влияние полиморфизма по отдельным аминокислотным остаткам V антигена на способность белка к олигомеризации и его протективную активность.

Практическая ценность диссертации.

Депонированы в GenBank последовательности IcrV гена 18 штаммов Y. pestis (номера доступа: EF645809.1, DQ489557.1, EF645806.1, GQ468417.1, DQ489552.1, GQ468423.1, EF645807.1, EF645808.1, DQ489556.1, DQ489555.1, GQ468422.1, GQ468421.1, GQ468420.1, GQ468419.1, DQ489554.1, DQ489553.1, GQ468416.1, GQ468415.1) (международный уровень внедрения).

Депонирован в коллекции «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ охраноспособный штамм Е. coli BL21(DE3)pETV 13 455 — продуцент V антигена с повышенной способностью к агломерации и повышенной протективной активностью (федеральный уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинско-го государственного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ.

Препараты V антигена, выделенные из сконструированных нами продуцентов, были использованы для получения моноклональных антител сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Пущино) и лаборатории молекулярной биологии ГНЦ ПМБ, а также в качестве одного из компонентов экспериментальных чумных вакцин, разрабатываемых в рамках Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 1 200 905 859), № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 1 201 002 280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 1 201 174 793) с Роспотребнадзором и № Н/3/7/50ф-11-ДГОЗ от 15.04.2011 г. (№ гос. регистрации 1 201 162 945) с Министерством обороны. Кроме того, препараты V антигена применяются сотрудниками лаборатории биологических испытаний ГНЦ ПМБ для оценки динамики продукции антител у лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков и морских свинок), инфицированных Y. pes tin.

Основные положения, выносимые на защиту:

Избирательная вирулентность «полевочьих» штаммов не обусловлена структурной вариабельностью V антигена.

Аминокислотный тип D — широко распространенный и наиболее древний из структурных вариантов V антигена Y. pestis.

Рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV 13 455 — продуцент иммуногенного полипептида LcrV (G113), вызывающего защитный иммунный ответ против У. pestis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель — к.м.н. C.B. Дентовская) — проекта РФФИ № 08−04−405-а (научный руководитель — д.м.н., проф. А.П. Анисимов), договора № 74-Д от 31 декабря 2005 г. (НИР 001−2, № гос. регистрации 1 200 904 237, научный руководительд.м.н., проф. И.А. Дятлов) с Роспотребнадзором и Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 1 200 905 859), и № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 1 201 002 280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 1 201 174 793) с Роспотребнадзором (научный руководитель — д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с П. Х. Копыловым (ГНЦ ПМБ) и В. Л. Мотиным (Медицинское отделение Техасского университета, Галвестон, Техас, США). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Е. А. Панферцев и М. Е. Платонов. Компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена на основании определенных автором нуклеотидных последовательностей проводили B.W. Segelke и A. Zemla из Ливерморской национальной лаборатории им. Э. Лоуренса Министерства энергетики США (Ливермор, Калифорния, США).

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы к.м.н. С. В. Дентовской (ГНЦ ПМБ) и д.м.н., проф. А. П. Анисимова (ГНЦ ПМБ), осуществлявших научное руководство и оказывавших методическую помощь на всех этапах работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях' ' (Волгоград, 2005) — 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006) — NIAID Research Conference (Opatija, Croatia, 2006) — VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, Московская обл., 2006) — 9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, 2006) — научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России» (Ставрополь, 2007) — 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, 2007) — 9th Symposium of Analytical Microbiology (Beijing, People’s Republic of China, 2007) — NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop «Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification» (Тбилиси, Грузия, 2008) — IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград, 2008) — научно-практической конференции, посвященной 75-летию Иркутского НИПЧИ (Иркутск, 2009) — П-й научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Московская обл., Оболенск, 2009) — International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010), III-м съезде военных врачей «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации» (С-Петербург, 2010) — Ш-й научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Московская обл., Оболенск, 2011).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании ученого совета ГНЦ ПМБ 9 апреля 2010 г. протокол № 4 Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 21 от 27 декабря 2011 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, в том числе в двух статьях (в международных рецензируемых журналах, реферируемых ISI) и патенте на изобретение № 2 439 155 С1 от 02.06.2010 (РФ), список которых приведен в автореферате.

ВЫВОДЫ.

1. Генетический и структурно-функциональный анализ V антигена У. резИя позволил выявить пять типов структурных вариантов белка ЬсгУ (три типа впервые), которые отличаются по группо-специфичному полиморфизму в четырех «горячих точках» аминокислотных последовательностей. В состав отдельных аминокислотных типов входят варианты ЬсгУ с дополнительным штаммо-специфичным полиморфизмом аминокислотных последовательностей.

2. Показано, что вариантные структуры ЬсгУ свойственны лишь части «по-левочьих» штаммов возбудителя чумы, а ЬсгУ типа Б, наиболее близкий по структуре к ЬсгУ возбудителя псевдотуберкулеза, характерен для основного эпидемически значимого подвида и для наиболее филогенетически древних «полевочьих» штаммов.

3. Установлено, что изменчивость структуры V антигена не является причиной избирательной вирулентности «полевочьих» штаммов возбудителя чумы.

4. На основании компьютерного моделирования трехмерной структуры теоретически предсказано, что пять из выявленных нами вариантов аминокислотных замен в V антигене 7. реьНя, не приводят к изменению локальных химических свойств белка (гидрофобности, гидрофильности, амфипатичности, заряда) и, вероятно, оказывают минимальное влияние на его структуру. Замена триптофана в позиции ИЗ на глютаминовую кислоту либо глицин должна оказывать значительное влияние на региональную структуру и, возможно, на функции ЬсгУ возбудителя чумы.

5. Сконструирован набор продуцентов различных структурных вариантов V антигена, проведены выделение и очистка рекомбинантных белков.

6. Экспериментально показано, что замена в аминокислотной последовательности V антигена триптофана на глицин в положении 113 сопровождается повышенной способностью к олигомеризации (агломерации), коррелирующей с усилением протективной активности белка на пять порядков.

Благодарности.

Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.м.н., проф. А. П. Анисимову (ГНЦ ПМБ) и к.м.н. C.B. Дентовской (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим приятным долгом выразить благодарность всем моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации (профессору В. Л. Мотину из Техасского Университета (США), Dr. B.W. Segelke и Dr. A. Zemla из Ливерморской Национальной Лаборатории (США), к.б.н. Ф. А. Бровко из филиала Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Пущино), сотрудникам ФБУН ГНЦ ПМБ к.м.н. Е. А. Панферцеву, к.б.н. П. Х. Копылову, к.х.м. Н. В. Киселевой, к.б.н. С. А. Иванову, к.б.н. М. Е. Платонову, к.м.н. Г. М. Титаревой, к.м.н. И. В. Бахтеевой, Т. И. Комбаровой.

Глубоко признательна директору Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока д.м.н., проф. C.B. Балахонову и директору Ставропольского научно-исследовательского противочумного института д.м.н., проф. А. Н. Куличенко за предоставленные штаммы Y. pestis.

Благодарю директора ФБУН ГЕ1Ц ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. И. А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФБУН ГНЦ ПМБ.

Признательна и благодарна всем рецензентам настоящей работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Вакцинация — наиболее экономически целесообразный метод борьбы с распространением инфекционных заболеваний. Эпидемиологически обоснованное применение вакцин значительно снизило заболеваемость и смертность от таких наносящих значительный экономический ущерб болезней как корь, полиомиелит, дифтерия, пневмококковые инфекции и др. Триумфом вакцинации явилось искоренение оспы во всем мире. В рамках реализации глобальных программ Всемирной организации здравоохранения эпидемиологи намерены ликвидировать корь и полиомиелит. Быстрое развитие методологии молекулярной биологии и биотехнологии в сочетании с лучшим пониманием механизмов инициации и реализации иммунного ответа ознаменовали начало «Золотого Века» разработки вакцинных препаратов нового поколения [131]. После рассылки по почте спор возбудителя сибирской язвы в США в 2001 г. основное внимание разработчиков вакцинных препаратов обращено на профилактику сибирской язвы, чумы и туляремии, чьи возбудители считаются наиболее вероятными агентами биотерроризма.

Чума — типичный зооноз, а человек лишь случайный хозяин, хотя антропоноз-ное распространение инфекции воздушно-капельным путем может быть причиной серьезных эпидемий. Тем не менее, полная эрадикация чумы, как и любого другого зооноза, маловероятна [141], хотя исследования в этом направлении продолжают проводиться [66- 91].

Несмотря на проверку иммуногенной активности значительного количества белков, синтезируемых чумным микробом [132,133- 228] и доступность методик обратной (реверсивной) вакцинологии [187], только два из них — антигены Fl и V, выявленные еще в середине прошлого века [49], остаются в интактном или модифицированном виде основными компонентами молекулярных чумных вакцин [4].

Цель настоящей работы состояла в проведении структурно-функционального и генетического анализа V антигена Y. pestis для рационального конструирования субъединичных противочумных вакцин.

Для изучения полиморфизма IcrV rem Y. pestis и его продукта — V антигена необходим, прежде всего, набор природных изолятов, представляющий различные внутривидовые группы. В нашей работе мы использовали 12 штаммов subsp. pestis и 61 штамм subsp. microtus, причем наборы изолятов из кавказских и алтайского природных очагов были достаточно представительны. Анализ аминокислотных последовательностей позволил разделить все структурные варианты белка LcrV на пять типов в соответствии с проявлением основного группо-специфичного полиморфизма в четырех «горячих точках» с дополнительным пгтаммо-специфичным полиморфизмом, выявляемым у представителей отдельных групп. Как мы и ожидали, все штаммы основного подвида с универсальной вирулентностью обладали D типом V антигена, наиболее близким к V антигену прародителя чумного микроба — Y. pseudotuberculosis. При планировании диссертации мы собирались оценить влияние структурного полиморфизма V антигена на проявление избирательной вирулентности путем обмена плазмидами «вирулентности» между «полевочьими» штаммами и штаммами с универсальной вирулентностью. Однако воспринятое нами в первый момент выявления как артефакт присутствие в значительной части изолятов неосновного подвида V антигена типа D значительно упростило решение нашей задачи. С учетом того факта, что изменчивость аминокислотной последовательности либо является причиной избирательной вирулентности, либо нет, нам было достаточно сравнить вирулентность для мышей и морских свинок у «полевочьих» штаммов с различными типами V антигена. Результаты наших экспериментов однозначно свидетельствуют о том, что наличие в клетках «полевочьих» штаммов V антигена типа D недостаточно для высокой вирулентности возбудителя чумы в отношении морских свинок. Проблема избирательной вирулентности штаммов Y. pestis subsp. microtus по-прежнему ждет решения.

Работы по конструированию продуцентов V антигена проводили с учетом данных компьютерного моделирования трехмерной структуры LcrV и возможности влияния замен по отдельным аминокислотам на физико-химические, иммунохимические и про-тективные свойства белка. Наибольший интерес был проявлен к вариантам V (Wj V (Eii3) и V (gh3> т.к. полученные данные свидетельствовали о том, что из всех изученных в нашей работе замен аминокислот только одна — в позиции 113, наиболее вероятно, вносит серьезный вклад в формирование локальной структуры LcrV — замена триптофана на глютаминовую кислоту (Е113) или глицин (G113). Действительно, ре-комбинантный антиген V (gh3) резко отличался от других препаратов уже на стадии выделения. Так, при выделении V (wii3) и V (eu3) антигенов, на этапе анионообменной хроматографии целевой белок элюировали буферным раствором с низкой ионной силой (30−40 мМ NaCl), однако при элюции варианта V (G113) этот белок присутствовал в равных долях во фракциях как 30 мМ, так и 80 мМ, 150 мМ, а также 200 мМ NaCl.

Сравнительная оценка протективноети различных структурных вариантов V антигена, как и ожидалось, подтвердила преимущества высокоагрегированной формы антигена. Индекс иммунитета при использовании У (Сш) был на пять порядков выше, чем при иммунизации другими экспериментальными образцами белка.

Учитывая, что протективная активность V антигена в отношении разных видов животных отличается [127], а данные о формировании перекрестного иммунитета к вариантам LcrV, отличающимся по аминокислотным последовательностям, противоречивы [103- 147,143,146- 152- 190- 195], могут возникнуть сомнения в целесообразности использования V (oii3) антигена в составе вакцинных препаратов для иммунизации людей.

Очевидно, что клинические исследования невозможно заменить модельными экспериментами in vitro или даже на лабораторных животных. В то же время любой эксперимент несет в себе больший или меньший элемент риска для подопытного добровольца и должен проводиться с учетом основных этических и правовых принципов, регламентирующих порядок проведения клинических исследований. Эти принципы были сформулированы в Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации врачей, принятой 18-й Генеральной ассамблеей Всемирной ассоциации врачей в июне 1964 года [16]. Жизнь и здоровье испытуемых всегда превыше интересов науки и общества, поэтому биомедицинские исследования с участием людей в качестве субъектов не могут проводиться на законных основаниях, если риск для субъекта исследований непропорционально велик по сравнению с важностью целей эксперимента [3]. Соответственно при изучении протективноети чумных вакцин в отношении людей возможна только косвенная оценкаисследование эффективности пассивной иммунизации модельных лабораторных животных, зараженных чумой. С учетом того, что в наших экспериментах по активной иммунизации «полевочий» вариант V (Gii3) антигена значительно превосходил классический D тип LcrV из штаммов с универсальной вирулентностью, с высокой долей вероятности можно предположить, что и при пассивной иммунизации человеческими анти-V антителами он не уступит классическому V (wli3) антигену. Но даже такие косвенные данные можно будет получить только после успешного завершения доклинических испытаний.

Основным практическим итогом настоящей работы является именно конструирование рекомбинантного штамма бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV 13 455, несущего плазмидную ДНК pETV 13 455 с нуклеотидной последовательностью, кодирующей иммуногенный полипептид LcrV (GU3), вызывающий защитный иммунный ответ против 7 резНэ. После окончания выполнения экспериментальной части настоящей диссертационной работы оптимизация условий культивирования штамма — продуцента и выделения целевого белка, а также его использование в качестве компонента экспериментальных чумных молекулярных вакцин продолжается в рамках выполнения ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности российской Федерации (2009;2013 годы)» (Госконтракты № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 1 200 905 859), № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 1 201 002 280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 1 201 174 793) с Роспотребнадзором и № Н/3/7/50ф-11-ДГОЗ от 15.04.2011 г. (№ гос. регистрации 1 201 162 945) с Министерством обороны). Кроме того, препараты V антигена, выделенные из сконструированных нами продуцентов, были использованы для получения моноклональных антител сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Пущино) и лаборатории молекулярной биологии ГНЦ ПМБ, а также сотрудниками лаборатории биологических испытаний ГНЦ ПМБ для оценки динамики продукции антител у лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков и морских свинок), инфицированных 7. реяШ.

В заключение следует отметить, что вывод, к которому пришли физики, преодолевая в начале XX века кризис в этой науке, «Нет ничего практичнее хорошей теории» — сохраняет свою актуальность. Именно проведение фундаментальных исследований на первой стадии нашей работы, позволивших теоретически предсказать свойства исследуемых белков ЬсгУ, дали возможность обоснованно сократить объем исследований, и, самое главное, добиться конкретного практического результата.

Показать весь текст

Список литературы

  1. В.И., Палагин А. Ю., Веренков М. С. и др. Иммунобиологические свойства препаратов фибринолизина чумных микробов // Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1989. — С. 14−19.
  2. А.П. Правовые основы проведения клинических исследований лекарственных препаратов // Медицинское право. 2003, № 1, http://rudoctor.net/medicine2009/bz-kw/med-lmgur.htm
  3. Ю.А., Фёдорова В. А., Анисимов А. П. В борьбе за контролем над чумой. Прошлое и настоящее «Чёрного мора» // Вестник РАН 2011. — Т.80, № 1. — С.33−42.
  4. М.П. Чума (природная очаговость, эпизоотология, эпидемиологические проявления). М.: Медицина, 1979. — 192 с.
  5. A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Дисс.. докт. мед. наук. Саратов, 1995. — 392 с.
  6. A.M. Трансформирующая активность плазмид чумного микроба: Дисс.. канд. мед. наук. Саратов, 1983. — 183 с.
  7. Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания. Руководство по вакцинному и сывороточному делу. -М.Медицина, 1978, — С. 24−36.
  8. Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. -М.:Мир, 1984. 479 с.
  9. Ю.Мартиневский И. Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов. М.: Медицина, 1969. — 295 с.
  10. М.Е. Молекулярно-генетическое изучение разнообразия и микроэволюции Yersinia pestis: Дисс.. канд. биол. наук. Оболенск, 2011 — 142 с.
  11. М.Е., Евсеева В. В., Ефременко Д. В., Кузнецова И. В., Чиркова Е. В., Дентовская C.B., Куличенко А. Н., Анисимов А.П. DFR-типирование штаммов Yersinia pestis из природных очагов СНГ // Проблемы особо опасных инфекций. -2011. -№ 48.-С. 42−47.
  12. Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации: рекомендации для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях. // Клин, мед. 2000.-№ 9.-С. 13−14.
  13. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. — V. 96. — P. 14 043−14 048.
  14. Adair D.M., Worsham P. L, Hill K. K, Klevytska A. M, Jackson P. J, Friedlander A. M, Keim P. Diversity in a variable-number tandem repeat from Yersinia pestis II J Clin Microbiol. 2000. — V. 38.-P. 1516−1519.
  15. Airhart C. L, Rohde H. N, Hovde C. J, Bohach G. A, Deobald C. F, Lee S. S, Minnich S.A. Lipid A mimetics are potent adjuvants for an intranasal pneumonic plague vaccine // Vaccine. 2008. — V. 26. — P. 5554−5561.
  16. Alpar H.O., Eyles J.E., Williamson E.D., Somavarapu S. Intranasal vaccination against plague, tetanus and diphtheria // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. — V.51. — P. 173−201.
  17. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Crisantes J.D., Rigano M.M., Pinkhasov J., Walmsley A. M, Mason H.S., Cardineau G.A. Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice // Vaccine. 2006. — V. 24. — P. 2477−2490.
  18. Anderson D.M., Ciletti N.A., Lee-Levis H., Elli D, Segal J., DeBord K.L., Overheim K.A., Tretiakova M., Brubaker R.R., Schneewind O. Pneumonic plague pathogenesis and immunity in Brown Norway Rats // Am. J. Pathol. 2009. — V. 174. — P. 910 921.
  19. Anderson D.M., Ramamurthi K.S., Tarn C, Schneewind O. YopD and LcrH regulate expression of Yersinia enterocolitica YopQ by a posttranscriptional mechanism and bind to yopQ RNA // J. Bacteriol. 2002. — V.184. — C. 1287−1295.
  20. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Kopylov P.Kh., Segelke B.W., Zemla A., Telepnev M.V., Motin V.L. Amino acid and structuralvariability of Yersinia pestis LcrV protein // Infect. Genet. Evol. 2010. — V.10. — P. 137−145.
  21. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis II Clin. Microbiol. Rev. 2004. — V. 17. — P. 434−464.
  22. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V. Variability of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis II Adv. Exp. Med. Biol. 2007. — V.603. — P.23−27.
  23. Arlen P.A., Singleton M, Adamovicz J. J, Ding Y, Davoodi-Semiromi A, Daniell H. Effective plague vaccination via oral delivery of plant cells expressing Fl-V antigens in chloroplasts // Infect. Immun. 2008. — V. 76. — P. 3640−3650.
  24. Ben-Gurion R, Shafferman A. Essential virulence determinants of different Yersinia species are carried on a common plasmid. // Plasmid. 1981. — V. 5, N. 2 — P. 183 187.
  25. Birnboim H.C., Doly I.A. Rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucl.Acids Res. 1979. — V.7. — P. 1515−1523.
  26. Boyd AO, Sory M-P, Iriarte M, Cornelis GR. Heparin interferes with translocation of Yop proteins into HeLa cells and binds to LcrG, a regulatory component of the Yersinia Yop apparatus // Mol. Microbiol. -1998, — 27: 425−436.
  27. Broms J. Type III secretion the various functions of the translocon operon in bacterial pathogenesis: PhD thesis. Umea, Sweden, 2004. — 82 p.
  28. Broms JE, Edqvist PJ, Carlsson KE, Forsberg A, Francis MS. Mapping of a YscY binding domain within the LcrH chaperone that is required for regulation of Yersinia type III secretion // J. Bacteriol.- 2005. V. 187. — P. 7738−7752.
  29. Broms JE, Francis MS, Forsberg A. Diminished LcrV secretion attenuates Yersinia pseudotuberculosis virulence // J. Bacteriol. 2007. — V. 189. — P. 8417−8429.
  30. Brown D. R, Talkington D. F, Thacker W.L., Brown M.B., Dillehay D.L., Tully J.G. Mycoplasma microti sp. nov., isolated from the respiratory tract of prairie voles (Microtus ochrogaster) // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. — V. 51 (Pt 2). — P.409−412.
  31. Broz P, Mueller CA, Muller SA, Philippsen A, Sorg I, Engel, A. Function and molecular architecture of the Yersinia injectisome tip complex. // Mol. Microbiol.-2007,-V. 65.-P. 1311−1320.
  32. Brubaker R.R., Sample A.K., Zaborchak R.J., Hu P.C., Fowler J.M. Proteolisis of V antigen from Yersiniapestis II Microb. Patog. 1987. — V. 2.- P. 49−62.
  33. Brubaker RR, Surgalla MJ. The effect of Ca++ and Mg++ on lysis, growth, and production of virulence antigens by Pasteurella pestis. II J. Infect. Dis. 1964.-V. 114.-P. 13−25.
  34. Brubaker RR. Growth of Pasteurella pseudotuberculosis in simulated intracellular and extracellular environments // J. Infect. Dis.-1967. V. 117. — P. 403−17.
  35. Brubaker RR. Interleukin-10 and inhibition of innate immunity to Yersinias: roles of Yops and LcrV (V antigen) // Infect. Immun.- 2003, — V. 71, N.7. P.3673−3681.
  36. Brubaker RR. The V antigen of yersiniae: an overview // Contrib Microbiol Immunol. 1991.-V.12. — P. 127−133.
  37. Burrows T.W. An antigen determining virulence in Pasteurella pestis II Nature 1956. -V. 177.-P. 426−427.
  38. Burrows TW, Bacon GA. The effects of loss of different virulence determinants on the virulence and immunogenicity of strains of Pasteurella pestis II Brit. J. Exp. Pathol. 1958, — V.39. — P. 278−291.
  39. Burrows TW, Bacon GW. V and W antigens in strains of Pasteurella pseudotuberculosis II Brit. J. Exp. Pathol.- I960, — V. 41. P. 38−44.
  40. Carr S., Miller J., Leary S.E.C., Bennett A.M., Ho A., Williamson E.D. Expression of a recombinant form of the V antigen of Yersinia pestis, using three different expression systems // Vaccine.- 2000, — V. 18. P. 153−159.
  41. Caroline G., Eric F., Bohn Y.S., Sylvie E., Attree I. Oligomerization of PcrV and LcrV, protective antigens of Pseudomonas aeruginosa and Yersinia pestis I IJ Biol Chem. 2008. — V. 283. — P. 23 940−23 949.
  42. Carter PB, Zahorchak RJ, Brubaker RR. Plague virulence antigens from Yersinia enterocolitica // Infect. Immun. -1980.- V. 28. P. 638−640.
  43. Chichester J.A. Musiychuc K., Farrance C.E., Mett V., Lyons J., Yusibov V. A single component two-valent LcrV-Fl vaccine protects non-human primates against pneumonic plague // Vaccine. 2009. — V.27. — P.3471−3474.
  44. Cohen S.N., Chang A.C.Y. Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants // Proc. Natl. Acad. Sei. -1973.-V. 70.-P. 1293−1295.
  45. Cornelis C.A., Quenee I.E., Overheim K.A., Koster F., Brasel T.I., Elli D., Ciletti N.A., Schneewind O. Immunization with recombinant V10 protects Cynomolgus macaques from letal pneumonic plaque // Infect. Immun. 2008. — V.76. — P.5588−5597.
  46. Cornelis G. R, Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cell // Mol. Microbiol. 1997. — V.23, N5. — P. 861−867.
  47. Cornelis G.R. The Yersinia deadly kiss // J. Bacteriol. 1998. — V. 180. — P. 5495 -5504.
  48. Cornelis G.R. The Yersinia Ysc-Yop 'Type III1 weaponry // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2002.-V. 3. P.742−752.
  49. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P., Geuijen C., Iriarte M., Neyt C., Sory M., Stainier I. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genom // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. — V .62, N 4. — P.1315−1352.
  50. Cowan C, Philipovskiy A.V., Wulff-Strobel C.R., Ye Z., Straley S.C. Anti-LcrV antibody inhibits delivery of Yops by Yersinia pestis KIM5 by directly promoting phagocytosis // Infect. Immun. 2005. — V. 73. — P. 6127−37.
  51. Cross M.L., Fleming S.B., Cowan P.E., Scobie S., Whelan E., Prada D., Mercer A.A., Duckworth J.A. Vaccinia virus as a vaccine delivery system for marsupial wildlife // Vaccine. 2011. — V. 29, N.28. — P. 4537- 4543.
  52. DeBord KL, Lee VT, Schneewind O. Roles of LcrG and LcrV during type III targeting of effector Yops by Yersinia enterocolitica II J. Bacteriol.- 2001. V. 183. -P. 4588−4598.
  53. DeLeo FR, Hinnebusch BJ. 2005. A plague upon the phagocytes // Nat. Med. 2005. -V. 11.-P. 927−928.
  54. Derewenda U, Mateja A, Devedjiev Y, Routzahn K. M, Evdokimov A. G, Derewenda Z. S., Waugh D.S. The structure of Yersinia pestis V-antigen, an essential virulence factor and mediator of immunity against plague // Structure. 2004. — V.12. — P.301−316.
  55. Devignat R. Varietes de l’espece Pasteurellapestis: nouvelle hyphothese // Bull. W. H. O. 1951. -V. 4. — P. 247−263.
  56. Dower W., Miller J., Ragsdale C. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. //Nucl. Acids Res. 1988. — V.16. — P. 6127.
  57. DuBois A.B., Freytag L.C., Clements J.D. Evaluation of combinatorial vaccines against anthrax and plague in a murine model. // Vaccine. 2007. — V. 25. — P. 47 474 754.
  58. Elvin S.J., Eyles J.E., Howard K.A., Ravichandran E, Somavarappu S, Alpar H.O., Williamson E.D. Protection against bubonic and pneumonic plague with a single dose microencapsulated sub-unit vaccine. // Vaccine. 2006. — V. 24. — P. 4433−4439.
  59. Eppinger M., Guo Z., Sebastian Y., Song Y., Lindler L.E., Yang R., Ravel J. Draft genome sequences of Yersinia pestis isolates from natural foci of endemic plague in China // J. Bacteriol. 2009. — V. 191, N.24. — P. 7628−7629.
  60. Espina M., Ausar S.F., Middaugh C/R., Baxter M.A., Picking W.D., Picking W.L. Conformational stability and differential structural analysis of LcrV, PcrV, BipD, and SipD from type III secretion systems // Protein Sci. 2007. — V. 16. — P. 704−714.
  61. Eyles J.E., Butcher W.A., Titball R.W., Hill J. Concomitant administration of Yersinia pestis specific monoclonal antibodies with plague vaccine has a detrimental effect on vaccine mediated immunity // Vaccine. 2007. — V. 25. — P. 7301−7306.
  62. Eyles J.E., Elvin S.J., Westwood A, Lebutt C.S., Alpar H.O., Somavarapu S, Williamson E.D. Immunisation against plague by transcutaneous and intradermal application of subunit antigens. // Vaccine. 2004. — V. 22. — P.4365−4373.
  63. Eyles J.E., Bramwell V.W., Williamson E.D., Alpar H.O. Microsphere translocation and immunopotentiation in systemic tissues following intranasal administration // Vaccine. 2001. — V. 19 — P .4732−4742.
  64. Feodorova V.A., Corbel M.J. Prospects for a new plaque vaccines // Expert Rev.Vaccines. 2009 — V.8. — P. 1721 -1738.
  65. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis. II Infect. Immun. 1981. -V.31, N2. — P.839−841.
  66. Fernandez J.R., Rocke T.E. Use of rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. // J. Wildl. Dis. 2011. — V. 47, N 3. — P. 765−768.
  67. Fields K.A., Nilles M.L., Cowan C, Straley S.C. Virulence role of V antigen of Yersinia pestis at the bacterial surface // Infect. Immun. 1999. — V. 67. — P. 53 955 408.
  68. Fields K.A., Straley S.C. LcrV of Yersinia pestis enters infected eukaryotic cells by a virulence plasmid-independent mechanism. // Infect. Immun. 1999. — V. 67. -P. 4801−4813.
  69. Foligne B, Dessein R, Marceau M, Poiret S, Chamaillard M, et al. Prevention and treatment of colitis with Lactococcus lactis secreting the immunomodulatory Yersinia LcrV protein // Gastroenterology -2007. V. 133. — P. 862−874.
  70. Foligne B, Dessein R, Marceau M, Poiret S, Dewulf J, Pot B, Simonet M, Daniel C. Therapeutic potential of Yersinia anti-inflammatory components. v // Adv. Exp. Med. Biol. 2007, — V. 603 — P. 361−366.
  71. Gage K.L., Kosoy M.Y. Natural history of plague: perspectives from more than a century of research // Annu. Rev. Entomol. 2005. — V. 50. — P. 505−528.
  72. Garcia, E., D., Worsham, S. Bearden S., Malfatti D., Lang F., Larimer L., Lindler P., Chain. Pestoides F, an atypical Yersinia pestis strain from the former Soviet Union. // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. — V. 603 — P. 17−22.
  73. Garmory H.S., Griffin K.F., Brown K.A., Titball R.W. Oral immunisation with live aroA attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing the Yersinia pestis V antigen protects mice against plague // Vaccine. 2003. — V. 21. — P. 30 513 057.
  74. Gemski P, Lazere J.R., Casey T, Wohlhieter J.A. Presence of a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis. II Infect. Immun. 1980. — V.28, N.3. -P. 1044−1047.
  75. Gemski P., Lazere J.R., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. // Infect. Immun. 1980. — V.27, N.2. -P. 682 — 685.
  76. Gendrin C., Sarrazin S., Bonnaffe D., Jault J-M., Lortat-Jacob H., Dessen A. // PloS ONE.-2010 .- V. 5, N.12. el5242.
  77. Goure J, Broz P, Attree O, Cornells G. R, Attree I. Protective anti-V antibodies inhibit Pseudomonas and Yersinia translocon assembly within host membranes. // J. Infect. Dis. 2005. -V. 192. — P. 218−225.
  78. Griffin K.F., Conway B.R., Alpar H.O., Williamson E.D. Immune responses to V antigen of Yersinia pestis co-encapsulated with IFN-gamma: effect of dose and formulation // Vaccine -1998. V. 16. — P.517−521.
  79. Griffin K.F., Hill J., Murray K. et al. Protective efficacies of the V antigen variants in Yersinia II Medische Microbiologie (Nederlands Tijdschrift voor). 1998. — V. 6 (Suppl. II). — P. S35
  80. Hakansson S, Bergman T, Vanooteghem J.C., Cornelis G, Wolf-Watz H. YopB and YopD constitute a novel class of Yersinia Yop proteins. // Infect. Immun. 1993. -P. 61. -P.71−80.
  81. Hamad M.A., Nilles M.L. Roles of YopN, LcrG and LcrV in controlling Yops secretion by Yersinia pestis II Adv. Exp. Med. Biol. 2007. — V. 603. — P. 225−234.
  82. Hamad M.A., Nilles M.L. Structure-Function Analysis of the C-Terminal Domain of LcrV from Yersinia pestis II J. Bacteriol. 2007. — V. 189. — P.6734−6739.
  83. Heesemann J, Sing A, Trulzsch K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense // Curr Opin Microbiol. 2006. — V. 9. — P.55−61
  84. Hill J, Copse C, Leary S, Stagg A.J., Williamson E.D., Titball R.W. Synergistic protection of mice against plague with monoclonal antibodies specific for the Fl and V antigens of Yersinia pestis II Infect. Immun. 2003. — V. 71 — P. 2234−2238.
  85. Hill J, Eyles J.E., Elvin S.J., Healey G.D., Lukaszewski RA., Titball R.W. Administration of antibody to the lung protects mice against pneumonic plague // Infect. Immun. 2006. -V. 74. -P.3068−3070.
  86. Hill J, Leary S.E., Griffin K.F., Williamson E.D., Titball R.W. Regions of Yersinia pestis V antigen that contribute to protection against plague identified by passive and active immunization // Infect. Immun. 1997. — V. 65 — P.4476−4482.
  87. Holmstrom A., Olsson J., Cherepanov P, Maier E., Nordfelth R., Pettersson J., Benz R., Wolf-Watz H., Forsberg A.A. LcrV is a channel size-determining component of the Yop effector translocon of Yersinia. II Mol. Microbiol. 2001. — V. 39 — P.620−632
  88. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. — V. 62. — P. 379−433.
  89. Imaeda T. Deoxyribonucleic Acid Relatedness Among Selected Strains of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium microti, and Mycobacterium africanum // Int .J. Syst. Bacteriol. -1985. V.35.-147−150.
  90. Jones S.M., Griffin K.F., Hodgson I., Williamson E.D. Protective efficacy of a fully recombinant plaque vaccine in the guinea pig // Vaccine. 2003. — V.21. -P.3912−3918.
  91. Khan A.A., Babu J.P., Gupta G., Rao D.N. Identifying B and T cell epitopes and studing humoral, mucosal, and cellular immune responses of peptides derived from V antigen of Yersinia pestis II Vaccine. 2008 — V.26. — P. 316−322.
  92. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. — V. 227. — P. 680−685.
  93. Lawton W. D, Erdman R.L., Surgalla M.J. Biosynthesis and purification of V and W antigens in Pasteurellapestis // J. Immunol. 1963. — V. 91 -:P. 179−184
  94. Leary S.E., Griffin K.F., Garmory H.S., Williamson E.D., Titball R.W. Expression of an Fl/V fusion protein in attenuated Salmonella typhimurium and protection of mice against plague // Microb. Pathog. 1997. — V. 23 — P. 167−179.
  95. Leary S.E.C., Williamson E.D., Griffin K.F., Russell P., Eley S.M., Titball R.W. Active immunization with recombinant V antigen from Yersinia pestis protects mice against plague // Infect. Immun. 1995. — V.63, N.8 — P.2854−2858.
  96. Lee V.T., Tam C., Schneewind O. LcrV, a substrate for Yersinia enterocolitica type III secretion, is required for toxin targeting into the cytosol of HeLa cells // J. Biol. Chem. 2000. — V. 275. — P. 36 869−36 875.
  97. Levine M.M., Campbell J.D., Kotloff K.L. Overview of vaccines and immunisation. // Br. Med. Bull. 2002. — V. 62. — P. 1−13.
  98. Li B" Zhou D., Wang Z., Song Z., Wang H., Li M" Dong X., Wu M" Guo Z., Yang R. Antibody profiling in plague patients by protein microarray. // Microbes Infect. 2008b. — V.10, N.l. — P. 45−51.
  99. Marennc M.N., Journet L., Mota L.J., Cornelis G.R. Genetic analysis of the formation of the Ysc-Yop translocation pore in macrophages by Yersinia enterocolitica: role of LcrV, YscF and YopN // Microb. Pathog. 2003, — V. 35. -P. 243−258.
  100. Matson J.S., Nilles M.L. LcrG-LcrV interaction is required for control of Yops secretion in Yersinia pestis II J. Bacteriol. 2001. -V. 183 — P. 5082−5091.
  101. Miller J. H. Experiments in Molecular Genetics. 1972. — P. 280.
  102. Modisane B.M. Field services: eradication and control of animal diseases. Onderstepoort // J. Vet. Res. 2009. — V. 76, N.l. — P. 115−121.
  103. Mota LJ. Type III secretion gets an LcrV tip // Trends Microbiol. 2006. -V.14,N.5.-P. 197−200.
  104. Motin V. L, Nakajima R., Smirvov G.B., Brubaker R.R. Passive immunity to Yersiniae mediated by anti-recombinant V antigen and Protein A-V antigen fusion peptide // Infect. Immun.- 1994. V. 62 — P. 4192−201.
  105. Motin V.L., Kutas S.M., Brubaker R.R. Suppression of mouse skin allograft rejection by protein A-Yersinia V antigen fusion peptide // Transplantation. 1997. -V. 63.-P. 1040−1042.
  106. Motin V.L., Nedialkov Y.A., Brubaker R.R. V antigen-polyhistidine fusion peptide: binding to LcrH and active immunity against plague // Infect. Immun. 1996. -V.64- No. 10, — P. 4313−4318.
  107. Mueller C.A., Broz P, Muller S.A., Ringler P., Erne-Brand F., Sorg I., Kuhn M., Engel A., Cornelis G.R. The V-antigen of Yersinia forms a distinct structure at the tip of injectisome needles. // Science. 2005. — V. 310 — P. 674−676.
  108. Murzin, A.G., Brenner, S.E., Hubbard, T., Chothia, C., SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures // J. Mol. Biol. 1995. — V.247. — P. 536−540.
  109. Nakajima R., Brubaker R.R. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha // Infect. Immun. -1993. -V. 61. -P.23−31.
  110. Nakajima R., Motin V.L., Brubaker R.R. Suppression of cytokines by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization // Infect. Immun. 1995. — V. 63. N. 8. — P. 3021−3029.
  111. Nedialkov Y.A., Motin V.L., Brubaker R.R. Resistance to lipopolysaccharide mediated by the Yersinia pest is V antigen-polyhistidine fusion peptide: amplification of interleukin-10 // Infect. Immun. 1997. — V. 65 — P. 1196−1203
  112. Neubauer H., Aleksis S., Meyer H. Mapping of B-cell epitopes of the Fl capsular antigen of Y. pestis II Medische Microbiologie (Nederlands Tijdschrift voor). 1998. -V. 6 (Suppl. II).-P. SI0−11.
  113. Neyt C, Cornelis GR. Insertion of a Yop translocation pore into the macrophage plasma membrane by Yersinia enterocolitica: requirement for translocators YopB and YopD, but not LcrG I I Mol. Microbiol. 1999. — V. 33. — P. 971−981.
  114. NgoT. T., Lenhoff H.M. Enzyme-mediated immunoassay. // Plenum Press, New York, London, 1988.-444 p.
  115. Nilles M.L., Fields K.A., Straley S.C. The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on YopB and LcrG // J. Bacteriol. 1998. — V.180. — P. 3410−3420.
  116. Nilles ML, Williams AW, Skrzypek E, Straley SC. Yersinia pestis LcrV forms a stable complex with LcrG and may have a secretion-related regulatory role in the low-Ca2+ response. // J. Bacteriol. 1997. — V. 179. — P. 1307−1316.
  117. Novakova D., Pantucek R., Hubalek Z,. Falsen E., Busse H.J., Schumann P., Sedlacek I. Staphylococcus microti sp. nov., isolated from the common vole (Microtus arvalis) // Int. J. Syst .Evol. Microbiol. 2010. — V. 60(Pt 3). — P. 566−573.
  118. Overheim K.A., Depaolo R.W., Debord K.L., Morrin E.M., Anderson D.M., Green N.M., Brubaker R.R., Jabri B., Schneewind O. LcrV plague vaccine with altered immunomodulatory properties // Infect Immun. 2005- P. 73(8) — P. 51 525 159.
  119. Parent M.A., Berggren K.N., Kummer L.W., Wilhelm L.B., Szaba F.M.,. Mullarky I.K., Smiley S.T. Cell-mediated protection against pulmonary Yersinia pestis infection. // Infect. Immun. 2005. — V. 73. — P.7304−7310.
  120. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague. // Clin. Microbiol. Rev- 1997. — V. 10. — P.35−66.
  121. Perry R.D., Haddix P., Atkins E.B., Soughers T.K., Straley S.C. Regulation of expression of V antigen and outer membrane proteins in Yersinia pestis II Contrib. Microbiol. Immunol. 1987.-V. 9.-P. 173−178.
  122. Perry R.D., Harmon P.A., Bowmer W.S., Straley S.C. A low-Ca2+ response operon encodes the V antigen of Yersinia pestis II Infect. Immun. 1986. — V. 54 — P. 428−434.
  123. Pettersson J, Holmstrom A, Hill J, Leary S, Frithz-Lindsten, E von Euler-Matell, A. The V antigen of Yersinia is surface exposed before target cell contact and involved in virulence protein translocation // Mol. Microbiol. 1999. — V. 32 — P. 961 976.
  124. Pettersson J., Nordfeith R., Dubinina E., Bergman T., Gustafsson M., Wolf-Watz H. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact // Science. 1996.-V. 273.-P. 1231−1233.
  125. Philipovskiy A.V., Cowan C., Wulff-Strobel C.R., Burnett S.H., Kerschen E.J., Cohen D.A., Kaplan A.M., Straley S.C. Antibody against V antigen prevents Yop-dependent growth of Yersinia pestis II Infect Immun. 2005. — V. 73 — P. 1532−1542.
  126. Philipovskiy A.V., Smiley S.T. Vaccination with live Yersinia pestis primes CD4 and CD8 T cells that synergistically protect against lethal pulmonary Y. pestis infection. // Infect Immun. 2007. — V. 75 — P. 878−885.
  127. Piano G.V., Straley S.C. Mutations in yscC, yscD, and yscG prevent high-level expression and secretion of V antigen and Yops in Yersinia pestis II J. Bacteriol. -1995.-V. 177. P.3843−3854.
  128. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis. II J. Bacteriol. 1981. — V.148. — V.3. — P.877−883.
  129. Portnoy D.A., Moseley S. L, Falkow S. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis. // Infect Immun. -1981. V.31,N.2. -P.775−782.
  130. Portnoy DA, Wolf-Watz H, Bolin I, Beeder AB, Falkow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins // Infect. Lmmun.- 1984, — V. 43. P. 108 — 114.
  131. Pouliot K., Pan N., Wang S., Lu S., Lien E., Goguen J.D. Evalution of the role of LcrV-Toll-like receptor 2-mediated immunomodulation in the virulence of Yersinia pestis II Infect. Immun. 2007. — V. 75. — V. 3571−3580.
  132. Price S.B., Cowan C, Perry R. D, Straley S.C. The V antigen is a regulator protein necessary for the Ca2±dependent growth and the maximal expression of low Ca2+response virulence genes in Yersiniapestis II J. Bacteriol. 1991. — V. 173. — P. 26 492 657.
  133. Price S.B., Leung K.Y., Barve S.S., Straley S.C. Molecular analysis of lcrGVH, the V operon of Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1989. — V. 171. — P. 5646−5653.
  134. Pullen J.K., Anderson G.W., Jr., Welkos SL, Friedlander AM. Analysis of the Yersinia pestis V protein for the presence of linear antibody epitopes // Infect. Immun.- 1998. V. 66. — P. 521−527.
  135. Quenee L.E., Ciletti N., Beruhe B., Krausz T., Elli D., Hermanas T., Schneewind O. Plaque in guinea pigs and its prevention by subunit vaccines // Am. J. Pathol. -2011.-V.178. -P.1689−1700.
  136. Quenee LE, Schneewind O. Plague vaccines and the molecular basis of immunity against Yersinia pestis // Hum Vaccin. 2009. -V, 5. N. 12.- P. 817−23.
  137. Rappuoli R. Reverse vaccinology // Curr. Opin. Microbiol. 2003. V P. 445−450.
  138. Reithmeier-Rost D., Bierschenk .S, Filippova N., Schroder-Braunstein J., Sing A. Yersinia V antigen induces both TLR homo- and heterotolerance in an IL-10-involving manner // Cell Immunol.- 2004. V. 231.- P. 63−74.
  139. Reithmeier-Rost D., Hill J., Elvin S.J., Williamson D., Dittmann S., et al. The weak interaction of LcrV and TLR2 does not contribute to the virulence of Yersinia pestis II Microbes Infect. 2007. — V. 9 — P. 997−1002.
  140. Roggenkamp A., Geiger A.M., Leitrritz L et al. Passive immunity to infection with Yersinia spp. mediated by anti-recombinant V antigen is dependent on polymorphism of V antigen 11 Infect. Immun. 1997. — V. 65. — P. 446−451.
  141. Roggenkamp A., Leitritz L., Sing A., Kempf V. A, Baus K., Heesemann J. Antirecombinant V antigen serum promotes uptake of Yersinia enterocolitica serotype 08 by macrophages. // Med. Microbiol. Immunol. 1999. — V. 188 — P. 151−159.
  142. Russell P., Eley S.M., Hibbs S.E., Manchee R.J., Stagg A.J., Titball R.W. A comparison of Plague vaccine, USP and EV 76 vaccine induced protection against Yersiniapestis in a murine model // Vaccine. 1995. — V. 13. — P. 1551−1556.
  143. Sarker M.H., Sory M-P., Boyd A.P., Iriarte M" Cornelis G.R. LcrG is required for efficient translocation of Yersinia Yop effector proteins into eukaryotic cells // Infect. Immun. 1998. — V. 66. — P. 2976−2979.
  144. Sato H., Frank D.W. Multi-functional characteristics of the Pseudomonas aeruginosa type III needle-tip protein, PcrV- comparison to orthologs in other Gramnegative bacteria // Front Microbiol. 2011. — V. 2. — P. 142.
  145. Schmidt A., Schaffelhofer S., Muller K., Rollinghoff M., Beuscher H.U. Analysis of the Yersinia enterocolitica 0:8 V antigen for cross protectivity // Microb. Pathog.-1999.-V. 26.-P. 221−233.
  146. Sharma R.K., Sodhi A., Batra H.V. Involvement of TLR6/1 in rLcrV-mediated immunomodulation of murine peritoneal macrophages in vitro // Mol. Immunol. -2005.-V. 42.-P. 695−701.
  147. Sharp G. J, Eyles J. E, Williamson E.D., Brown M.R., Alpar H.O. Cellular and humoral responses to microencapsulated Yersinia pestis subunit vaccines following oral delivery // Biochem. Soc. Trans. 1997. — V. 25. — P. 338.
  148. Sing A., Roggenkamp A., Geiger A.M., Heesemann J. Yersinia enterocolitica evasion of the host immune response by V antigen-induced IL-10 production ofmacrophages is abrogated in IL-10-deficient mice // J. Immunol. 2002a. — V. 168. -P. 1315−1321.
  149. Skrzypek E., Straley S.C. LcrG: a secreted protein involved in negative regulation of the low calcium response in Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1993. — V. 175. — P. 3520−3528.
  150. Smiley S.T. Cell-mediated defense against Yersinia pestis infection // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. — V. 603 — P. 376−386.
  151. Smiley S.T. Current challenges in the development of vaccines for pneumonic plague // Expert .Rev. Vaccines. 2008. — V.7. — P. 209−210.
  152. Smiley S.T. Immune defense against pneumonic plague. // Immunol. Rev. 2008. -V. 225.-P. 256−271.
  153. Sodhi A., Sharma R.K., Batra H.V. Yersinia rLcrV and rYopB inhibits the activation of murine peritoneal macrophages in vitro // Immunol .Lett. 2005. — V. 99 -P. 146−152.
  154. Sodhi A., Sharma R.K., Batra H.V., Tuteja U. Mechanism of rLcrV and rYopB mediated immunosuppression in murine peritoneal macrophages // Mol. Immunol. -2004.-V. 4.-P. 767−774.
  155. Song Y., Tong Z., Wang J., Wang L" Guo Z., Han Y., Zhang J., Pei D., Zhou D., Qin H., Pang X, Han Y., Zhai J., Li M., Cui B., Qi Z" Jin L., Dai R, Chen F., Li S., Ye C., Du Z., Lin W., Wang J., Yu J., Yang H., Wang J., Huang P., P., Yang, R.
  156. Complete genome sequence of Yersinia pestis strain 91 001, an isolate avirulent to humans //DNA Res. 2004. — V.ll. — P. 179−197.
  157. Spiers I.D., Alpar H.O., Eyles J.E., Bozkir A., Miller J., Williamson E.D. Studies on the co-encapsulation, release and integrity of two subunit antigens: rV and rFl from Yersinia pestis. II J. Pharm. Pharmacol. 1999. -V. 51. — P. 991−997.
  158. Spivack M.L., Foster L., Larson A. et al. The immune response of the guinea pigs to the antigens of Pasteurellapestis // J. Immunol. 1958. — V. 80. — P. 132−141.
  159. Stainier I., Iriarte M, Cornelis GR. YscMl and YscM2, two Yersinia enterocolitica proteins causing downregulation of yop transcription // Mol. Microbiol. 1997.-V. 26 — P. 833−843
  160. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M., Beimain S.R., Bertherat E., Carniel E" Gage K.L., Leirs H., Rahalison L. Plague: past, present and future // PLoS Med. -2008,-5, e3.
  161. Straley S.C., Brubaker R.R. Cytoplasmic and membrane proteins of Yersinias cultivated under conditions simulating mammalian intracellular environment // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1981. — V. 78 .- P. 1224−1228.
  162. Sun W., Roland K.L., Branger C.G., Kuang X., Curtiss R.III. The role of relA and spoT in Yersinia pestis Kim5+ pathogenicity // PLoS One. 2009. -N.4. — e6720.
  163. Sun W., Roland K.L., Curtiss III R. Developing live vaccines against Yersinia pestis II J. Infect. Dev. Ctries. 2011. — V.5, N.9. — P.614−627.
  164. Sun W., Roland K.L., Kuang X., Branger C.G., Curtiss R.III. Yersinia pestis with regulated delayed attenuation as a vaccine candidate to induce protective immunity against plague // Infect. Immun. 2010. — V.78. — P. 1304−1313.
  165. Towbin H., Staehlin T., Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrylamid gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. — V.76.- P. 4350−4354.
  166. Trebesius K., Harmsen D., Rakin A., Schmelz J., Heesemann, J. ha3bahhe ct //J. Clin. Microbiol 1998. — V. 36 — P. 2557−2564
  167. Uddowla S., Freytag L.C., Clements J.D. Effect of adjuvants and route of immunizations on the immune response to recombinant plague antigens // Vaccine. -2007.-V. 25.-.P. 7984−7993.
  168. Une T, Brubaker R.R. Roles of V antigen in promoting virulence and immunity in Yersiniae II J. Immunol. -1984. V. 133. — P. 2226−2230.
  169. Une T, Nakajima R, Brubaker R.R. Roles of V antigen in promoting virulence in Yersinia. // Contrib. Microbiol. Immunol. 1987.- V. 9. — P. 179−185.
  170. Vernazza C., Lingard B., Flick-Smith H.C., Baillie L.W.J., Hill J., Atkins H.S. Small protective fragments of the Yersinia pestis V antigen // Vaccine 2009.- V.27.-P.2775−2780.
  171. Wang S., Helman D" Liu F" Giehl T" Joshi S., Huang X., Chou T.H., Goguen J, Lu S. A DNA vaccine producing LcrV antigen in oligomers is effective in protecting mice from letal mucosal challenge of plague // Vaccine. 2004. — V.22. — P. 33 483 357.
  172. Weeks S., Hill J., Friedlander A., Welkos S. Anti-V antigen antibody protects macrophages from Yersinia pestis -induced cell death and promotes phagocytosis // Microb. Pathog. 2002. — V. 32. — P.227−237.
  173. Welkos S., Friedlander A, McDowell D, Weeks J, Tobery S. V antigen of Yersinia pestis inhibits neutrophil chemotaxis. // Microb. Pathol. 1998. — V. 24. — P. 185−196
  174. Williamson E.D. Plaque vaccine research and development // J. Appl.Microbiol. -2001. V .91. — P. 606−608.
  175. Williamson E. D, Eley S. M, Stagg A. J, Green M., Russell P., Titball R.W. A subunit vaccine elicits IgG in serum, spleen cell cultures and bronchial washings andprotects immunized animals against pneumonic plague // Vaccine 1997, — V. 15. -P.1079−1084.
  176. Williamson E.D., Flick-Smith H.C., Waters E" Miller J., Hodgson I., Le Butt CS, Hill J. Immunogenicity of the rFl+rV vaccine for plague with identification of potential immune correlates // Microb. Pathog. 2007. — V. 42. — P. 11 -21.
  177. Williamson E.D., Sharp G.J., Eley S. M, Vesey P.M., Pepper T.C., Titball R.W., Alpar H. O. Local and systemic immune response to a microencapsulated sub-unit vaccine for plague//Vaccine. 1996.-V. 14. — P.1613−1619.
  178. Wolf-Wotz H., Portnoy D.A., Bolin I., Falkow S. Transfer of the virulens plasmid of Yersinia pestis to Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun .- 1985 V.48. — P. 241−243.
  179. Worsham P.L., Hunter M. Characterization of pestoides F, an atypical strain of Yersinia pestis // Medische Microbiologie (Nederlands Tijdschrift voor). 1998. -V. 6 (Suppl. II). — P. S34−35.
  180. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, a Yersinia pestis strain lacking plasminogen activator, is virulent by the aerosol route // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. — V.529. -P. 129−131
  181. Zav’yalov V.P., Denesyuk A.I., Zav’yalova G.A. et al. Molecular modeling of the steric structure of the envelope Fl antigen of Yersinia pestis II Immunol. Lett. 1995. -V. 45. — P. 19−22.
  182. Zemla A. LGA: a method for finding 3D similarities in protein structures // Nucleic Acids Res. 2003. — V.31. — P. 3370−3374.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!