Влияние лизосомотропных соединений на функциональную активность лизосомного аппарата клетки

Актуальность проблемы.

Открытие в 1955 году бельгийским ученым Кристианом Де Дювом нового типа внутриклеточных органелл, названных лизосомами, положило начало новому фундаментальному направлению клеточной биологии, связанному с изучением эндоцитоза и катаболизма макромолекул (Ое Биуе, 1963). Лизосомный компартмент обеспечивает основной внутриклеточный механизм катаболизма эндогенных и экзогенных макромолекул. Лизосомы играют важную роль в аккумуляции и сегрегации клетками, как неорганических ионов, так и органических соединений, в частности, некоторых антибиотиков, алкалоидов и катионных красителей. Важным этапом в развитии исследований функций лизосом явилось формирование Де Дювом и соавторами концепции о лизосомотропных соединениях — веществах, которые селективно захватываются и концентрируются в лизосомах, независимо от их химической природы и механизма поступления в клетку (Бе Эиуе е1 а1., 1974). Ряд слабых оснований, благодаря их высокой растворимости в липидах в недиссоциированной форме, проникают через мембрану клетки путем неионной диффузии. Внутри клетки слабые основания ионизируются и аккумулируются в виде катионов в кислых вакуолярных компартментах клетки. Поддержание низкого уровня рН во внутрилизосомном пространстве обеспечивается за счет активного транспорта протонов с помощью вакуолярной Н±АТФазы. Лизосомотропные соединения широко используются как в научных исследованиях, так и в практической медицине. Большое значение имеет применение сегрегационной функции лизосом для направленного введения в клетку ряда веществ, использующихся в качестве лекарственных препаратов (Булычев, 1991).

При аккумуляции в лизосомах лизосомотропные вещества оказывают влияние на локализованные в них ферменты. В результате могут возникнуть нарушения в функционировании одной и более лизосомных гидролаз, что приводит к патологическим состояниям, сходным с лизосомными болезнями накопления. Большинство таких болезней является следствием мутаций в генетической структуре одной или более лизосомных гидролаз и проявляется в накоплении в лизосомах недеградированных макромолекул (Мапат е1 а1., 2000;

Winchester et al., 2000). Предполагается, что изменение функционирования ft лизосом под влиянием лизосомотропных соединений является результатом не только повышения внутрилизосомного рН при их накоплении, но и их непосредственного взаимодействия с молекулами ферментов (Булычев, 1991).

Четвертичные бензо[с]фенантридиновые алкалоиды — сангвинарин и хелеритрин — характеризуются высокой биологической активностью, которая проявляется в их бактерицидном, противогрибковом и противоопухолевом действии. Важной особенностью этих алкалоидов является многонаправленность их влияния на эукариотические клетки. Они относятся к группе природных ДНК-интеркаляторов, модифицирующих структуру молекул ДНК и, таким образом, воздействующих на ДНКи РНК-зависимые метаболические реакции. Другой мишенью их действия являются митохондрии, аккумуляция алкалоидов в которых вызывает нарушение синтеза АТФ. Показано также, что сангвинарин и хелеритрин способны взаимодействовать с SH-группами различных классов ферментов, ингибируя их активности (Фаддеева, Беляева, 1997). Предполагается,.

• что аналогичный механизм может лежать в основе ингибирования сангвинарином многих ферментативных процессов. Однако влияние бензофенантридиновых алкалоидов на активность лизосомных ферментов к настоящему времени мало изучено. В задачу данной работы входило исследование динамики поступления в клетку, внутриклеточного распределения сангвинарина и хелеритрина, а также изучение их влияния на функциональную активность ключевых ферментов лизосом.

Многие биологически активные соединения (БАС) поступают в клетку путем эндоцитоза. Фагоцитоз, при котором происходит поглощение клеткой крупных частиц (более 5 мкм), является частным случаем эндоцитоза. Слияние фагосом с лизосомами (СЛФ) происходит на завершающем этапе фагоцитоза. Молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса, во многом остаются невыясненными. Показано, что кроме целого ряда белков-регуляторов везикулярного транспорта (Luzio et al., 2000), на процесс СЛФ влияют знак заряда на поверхности мембран, текучесть мембранных липидов, состояние компонентов цитоскелета (Kielian, Cohn, 1980; Булычев, Моженок, 1996). В связи с этим большое значение имеет изучение влияния на СЛФ различных химических агентов и БАС. Данные, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что такие вещества, как эпидермальный фактор роста, природные полиамины спермин, спермидин и путресцин), антибиотики рифампицин и даунорубицин, а также ряд противотуберкулезных агентов стимулируют СЛФ. Многие химические соединения и биологически активные вещества являются ингибиторами СЛФ. К их числу относятся хлористый аммоний, сурамин, декстран сульфат, маннансульфат, синтетические полиамины (Булычев, Моженок, 1996). Важную роль в процессе фагоцитоза и, в частности, при СЛФ играет актиновый цитоскелет (Desjardins et al., 1994 а, бБулычев, Моженок, 1996; Allen, Aderem, 1996, May, Machesky, 2001). В связи с этим также было изучено действие веществ, влияющих на цитоскелет, на СЛФ и содержание Ф-актина в перитонеальных макрофагах мыши (Моженок и др., 1992).

В целях развития данного направления в настоящей работе было исследовано влияние бензофенантридинового алкалоида хелеритрина, антрациклинового антибиотика фарморубицина и желчного пигмента билирубина на СЛФ и содержание Ф-актина в перитонеальных макрофагах мыши и на.

• состояние мембран лизосом в гепатоцитах мыши. Несмотря на то, что эти вещества относятся к различным классам химических соединений, их общим свойством является высокая биологическая активность и способность взаимодействовать с клеточными мембранами.

В настоящее время направленный перенос генов в клетки млекопитающих широко используется в исследованиях по клеточной и молекулярной биологии, а также как перспективный метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний. Вопрос о роли лизосом в процессе доставки экзогенного генетического материала мало изучен. Наиболее эффективными невирусными системами доставки функциональных генов в клетки являются катионные векторы, в том числе катионные липиды, полипептиды и катионные полимеры. Большинство авторов предполагает, что комплексы плазмидной ДНК с поликатионами, в основном, поглощаются путем эндоцитоза (Farhood et al., 1995; Zabner et al., 1995; Wattiaux et al., 2000). После интернализации комплексы поступают в эндосомы, а затем, в результате слияния поздних эндосом (фагосом) с лизосомами — в лизосомы. Слияние поздних эндосом с лизосомами играет важную роль в процессе эндоцитоза ДНК-комплексов, поскольку при попадании в лизосомный компартмент они могут в значительной степени подвергаться деградации или выходить в цитозоль.

Показано, что, используя лизосомотропные соединения, можно регулировать эффективность трансфекции в клетках. Было исследовано влияние ряда лизосомотропных агентов, таких как, хлорохин, поливинилпирролидон и сахароза на эффективность трансфекции (Mumper et al., 1996; Wagner et al., 1998; Ciftci and Levy, 2001). Эти вещества, аккумулируясь в лизосомах, способны инактивировать лизосомные ферменты, а также ингибировать слияние поздних эндосом с лизосомами. Одним из перспективных подходов для повышения эффективности трансфекции комплексов плазмидной ДНК с поликатионами является изучение механизмов действия на этот процесс различных ингибиторов и стимуляторов слияния.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование клеточных и • молекулярных механизмов действия лизосомотропных веществ на функциональную активность лизосом, в том числе на активность ферментов лизосом, слияние лизосом с фагосомами, а также роли лизосомного аппарата в процессе трансфекции экзогенного генетического материала в клетки млекопитающих.

Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем:

1. Охарактеризовать динамику поступления в фибробласты мыши сублинии LSM и аккумуляцию в них бензофенантридиновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, а также исследовать внутриклеточное распределение сангвинарина и хелеритрина в этих клетках.

2. Изучить влияние аккумулированных в лизосомах веществ на активность ряда лизосомных ферментов в гомогенатах фибробластов мыши сублинии LSM.

3. Изучить влияние сангвинарина на активность ферментов очищенной фракции лизосом, полученной из печени крыс, и провести сравнительное исследование действия сангвинарина, блокаторов SH-групп — пара-хлормеркурибензойной кислоты (ХМБК) и АА-этилмалеимида, а также восстановителя Б-Б-связей в белках — дитиотреитола (ДТТ), на активность маркерных ферментов лизосом.

4. Исследовать влияние биологически активных соединений — хелеритрина, билирубина и фарморубицина — на фузогенные свойства лизосом, используя метод регистрации слияния лизосом с фагосомами, метод определения содержания Ф-актина и метод исследования состояния мембраны лизосом с помощью флуоресцентных зондов.

5. Изучить влияние катионных векторов трансфекции в комплексе с плазмидной ДНК на состояние лизосом (методом регистрации слияния лизосом с фагосомами) в перитонеальных макрофагах мыши и в макрофагах линии 1774.

6. Исследовать действие известных лизосомотропных соединенийдекстран сульфата и сурам и на — на эффективность трансфекции плазмидной ДНК в комплексе с катионными векторами в клетках млекопитающих.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые изучена динамика поступления биологически активных растительных алкалоидов сангвинарина и хелеритрина в клетки млекопитающих. Методом субклеточного фракционирования в градиенте сахарозы показано, что одним из основных внутриклеточных компартментов, в котором накапливаются эти алкалоиды, является эндосомо-лизосомный компартмент. Впервые продемонстрировано, что активность ключевых лизосомных ферментов — Л^-ацетил-/?,/)-глюкозаминидазы (К-АГА), кислой фосфатазы (КФ) и /?-галактозидазы (ГАЛ) — зависит от состояния БН-групп и ингибируется сангвинарином, восстановителем Б-Б-связей в белках — ДТТ и блокаторами 8Н-групп — А^-этилмалеимидом и ХМБК. Ранее среди лизосомных ферментов такая зависимость была показана только для кислой липазы.

В работе впервые исследовано влияние хелеритрина и других биологически активных веществ на фузогенную активность лизосом, содержание Ф-актина и состояние лизосомных мембран в клетках млекопитающих. Кроме того, показано, что при трансфекции комплексы плазмидной ДНК с катионными векторами накапливаются в лизосомах и снижают их фузогенную активность.

Теоретическое и практическое значение работы.

В результате проведенного исследования внесен значительный вклад в выяснение клеточных и молекулярных механизмов действия лизосомотропных веществ на функциональную активность лизосомного аппарата клетки. Проведенное в работе детальное исследование фармакодинамики бензофенантридиновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, а также их влияния на активность лизосомных ферментов, чувствительных к модификациям БН-групп, будет способствовать оптимизации их использования в клинической практике и поиску перспективных подходов лечения заболеваний, связанных с нарушением функционирования лизосом. Эти данные представляют интерес также для изучения механизмов индукции апоптоза в клетках млекопитающих и человека, в частности, при нарушении окислительно-восстановительного баланса клетки.

Обнаружение способности лизосомотропных веществ, таких как сурамин и декстран сульфат, влиять на эффективность трансфекции комплексов плазмидной ДНК с поликатионами может быть использовано для разработки новых методических подходов для повышения эффективности этого процесса.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Эндоцитоз.

В последнее время большое внимание уделяется изучению функциональной роли вакуолярного аппарата клетки в связи с его участием в процессах внутриклеточного транспорта, сортинга белков и других соединений, а также в процессах сегрегации биологически активных веществ, необходимых для нормального функционирования и дифференцировки клеток эукариот. Одной из важнейших функций, осуществляемых вакуолярным аппаратом клетки, является эндоцитоз, то есть процесс поглощения клеткой макромолекулярного материала из окружающей среды и распределение его между внутриклеточными компартмента-ми. Термин «эндоцитоз» был предложен Де Дювом в 1963 году на первом Международном симпозиуме по лизосомам для объединения различных форм фагоцитоза и пиноцитоза (Ое Бцуе, 1963). Эндоцитоз обеспечивает защитные и иммунные реакции, транспорт макромолекул, передачу различных сигналов, питание клеток и другие функции, регулируя, таким образом, метаболизм клетки в целом. В наиболее широком определении эндоцитоз объединяет различные способы поглощения экзогенного материала клеткой, включая фагои пиноцитоз, клатрин-зависимый рецептор-опосредованный эндоцитоз и клатрин-независимый эндоцитоз (МикЬег^ее е! а1., 1997). Эндоцитоз необходим для поддержания клеточного гомеостаза, постоянного состава плазматической мембраны, а также физиологического равновесия на уровне многоклеточного организма посредством контроля множества функций, которые клетка выполняет как элемент клеточного сообщества (Шестова и др., 2001).

К настоящему времени наиболее детально изучен клатрин-зависимый рецептор-опосредованный эндоцитоз. Современные представления об эндоцитозе связаны с участием в этом процессе рецепторов, которые на начальном этапе взаимодействуют с соответствующими лигандами. В результате образуются ли-ганд-рецепторные комплексы, способные перемещаться в липидном бислое мембраны. Данные о механизме рецептор-опосредованного эндоцитоза были получены, в основном, при использовании в качестве лигандов различных белков плазмы (трансферрин, асиалогликопротеины, липопротеины низкой плотности и др.), гормонов (инсулин, пролактин и др.), ростовых факторов (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов и др.), токсинов и вирусов (Никольский и др., 1987).

При рецептор-опосредованном эндоцитозе рецепторы, в основном, концентрируются на специфических участках плазматической мембраны — окаймленных ямках, образуя скоплениякластеры. Впервые окаймленные клатрином ямки и пузырьки были обнаружены более 30 лет назад Ротом и Портером при изучении поглощения белков желтка ооцитами москитов. Авторы предположили, что через окаймленные ямки осуществляется селективное поглощение внеклеточного материала не только в ооцитах, но и в других типах клеток. В соответствии с этой гипотезой, окаймление выполняет как механическую роль при образовании окаймленных ямок и везикул, так и обеспечивает селективность адсорбируемых лигандов (Roth, Porter, 1964). Количество окаймленных ямок различно в зависимости от типа клеток, в среднем оно составляет около 2% от поверхности плазматической мембраны (Anderson et al., 1977).

Схема 1. Общая схема эндоцитозного пути в неполяризованной клетке (по МикЪефе ^ а1. 1997). СР — окаймленные ямки, СУ — окаймленные пузырьки. БЕ — сортирующие эн-досомы, Я С — рециклирующие эндосомы. N — ядро, ТСМ — сеть транс-Гольджи, МУВ — мульти везикулярные тела, ЬЕ — поздние эндосомы, ЬУ — лизосомы, Т — компоненты клатрина.

Методы очистки и выделения окаймленных пузырьков позволили установить, что основной составляющей окаймления является белок клатрин (РеагБе, 1975). Клатрин образует структуру в виде решетки на цитоплазматической поверхности окаймленных ямок. В нативной форме клатрин состоит из трех тяжелых (-190 к! Эа) и трех легких полипептидных цепей двух классов (23 кДа) и (27 кДа), образующих трискелион — основную структурную единицу клатриновой решетки (Ungewickell et al., 1981). Тяжелые цепи формируют каркас клатриновой решетки, роль легких цепей до конца не выяснена. По-видимому, они являются регуляторами сборки и разборки клатринового комплекса, так как функционирование АТФ-азы Hsc 70 (heat shock cognate 70), обеспечивающей удаление окаймления, зависит от их присутствия, по крайней мере, in vitro (Schmid et al., 1984). Способность клатрина к самосборке была показана in vitro у млекопитающих, дрожжей и растений (Hirst, Robinson, 1998). Такие факторы, как понижение рН цитозоля, снижение концентрации ионов К+, гипертоническая среда, препятствуют полимеризации клатрина и формированию клатриновой решетки, что вызывает ингибирование эндоцитоза (Булычев, Моженок, 1996).

Сборка клатрина на окаймленных ямках происходит вслед за присоединением комплекса белков, называемых АР-2 адаптерами. Адапторные комплексы связываются с цитоплазматическими доменами таких мембранных рецепторов как рецепторы липопротеина низкой плотности (ЛНП), трансферрина, асиалог-ликопротеина и эпидермального фактора роста (ЭФР), и способствуют их концентрации в окаймленных ямках (Whitney et al., 1995; Hirst, Robinson, 1998). N-концевой домен клатрина непосредственно взаимодействует с адапторами, которые, в свою очередь, связываются с мембраной (Hirst, Robinson, 1998). Окаймленные клатриновые пузырьки образуются и в секреторном пути после присоединения второго адапторного комплекса (АР-1) к комплексу trans-Гольджи. Они осуществляют транспорт вновь синтезированных лизосомных компонентов в эн-досомы. Существует также два других типа комплексов окаймления, которые опосредуют транспорт молекул между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи (Whitney et al., 1995).

После отделения от плазматической мембраны пузырьки с клатриновым окаймлением перемещаются от периферии к центру клетки. В этом процессе участвуют элементы цитоскелета: окаймленные пузырьки транспортируются вдоль микротрубочек к перинуклеарным эндосомам, с которыми они сливаются (Swanson, Silverstein, 1988). Перемещение окаймленных пузырьков сопровождается отделением клатриновой оболочки и их превращением в гладкие пузырьки. Клатриновое окаймление стабилизирует окаймленные пузырьки и препятствует их слиянию между собой и с другими мембранными структурами. Отделение клатриновой оболочки необходимо для последующего слияния с эндосомами. Этот процесс происходит при участии специфической АТФ-азы (clathrin uncoating ATP-ase), относящейся к семейству белков-шаперонов Hsp70 (Robinson, 1994). Комплексы рецепторов с лигандами, интернализованные в процессе эндоцитоза, доставляются в эндосомы, где они сортируются. В основном, комплексы диссоциируют в ранних эндосомахлиганды передаются в поздние эндосомы и лизо-сомы, а рецепторы рециклируют в плазматическую мембрану (Kornfeld, Mellman, 1989; Trowbridge et al., 1993). В связи с этой функцией ранние эндосомы были также названы сортирующими (Dunn et al., 1989). Большая часть таких рецепторов, как рецептор трансферрина, возвращается к поверхности клетки через очень короткое время. Оставшаяся фракция аккумулируется в мембранных трубчатых структурах, расположенных вблизи центра организации микротрубочек. Поскольку, эти органеллы получают материал, не предназначенный для попадания в поздние эндосомы и лизосомы, а их pH несколько выше, чем pH ранних эндосом, то они были определены как отдельная популяция эндосом — рециклирующие эндосомы (Hopkins, 1983; Yamashiro et al., 1984). В то время считалось, что его функция ограничивается лишь аккумуляцией и хранением рециклирующих в плазматическую мембрану рецепторов. Дальнейшие исследования показали, что рециклирующие эндосомы играют значительно более сложную роль во внутриклеточных транспортных процессах (Mukherjee et al., 1997).

Ранние и поздние эндосомы различаются по внутриклеточной локализации, морфологии, физическим характеристикам и уровню pH. Различия также наблюдаются в составе белков, включая специфические рецепторы и Rab-ГТФ-азы (Gruenberg, Maxfield, 1995).

В настоящее время нет единого мнения о происхождении эндосом, существуют две основные гипотезы:

1. Гипотеза созревания: ранние эндосомы образуются de novo путем слияния пузырьков, образующихся из плазматической мембраны. Состав этих пузырьков затем меняется, некоторые компоненты рециклируют к поверхности клетки, другие добавляются из сети комплекса Гольджи. Происходит созревание ранних эндосом и их превращение в поздние эндосомы (Murphy, 1991; Dunn, Maxfield, 1992).

2. Гипотеза о предсуществующих компартментах: ранние и поздние эндосомы являются предсуществующими структурами. Связь между ними осуществляется с помощью везикул, которые отделяются от ранних эндосом и сливаются с поздними эндосомами, а затем и лизосомами (Griffits, Gruenberg, 1991). Каждая модель по-разному описывает транспорт белков, ответственных за сортировку и транспортную активность эндосом. Высокая селективность мембранного транспорта предполагает присутствие специфических рецепторов на мембране каждого компартмента. Например, окаймленные пузырьки, образующиеся из плазматической мембраны, сливаются с ранними, а не с поздними эндосомами. Следовательно, на их мембране должны присутствовать специфические рецепторы. В соответствии с гипотезой созревания, эти рецепторы должны быть инактивированы и далее удалены путем рециклирования или деградации в лизо-сомах в процессе созревания. В гипотезе о стабильных компартментах предполагается, что некоторые белки, включая эти рецепторы, могут оставаться постоянными компонентами мембраны ранних эндосом (Gruenberg, Maxfield, 1995).

Фагоцитоз и рецептор-опосредованный эндоцитоз имеют много сходных черт. В обоих процессах принимают участие рецепторы. При фагоцитозе происходит обмен материалом с эндосомами, а также селективное отпочковывание и слияние везикул, характерное и для рецептор-опосредованного эндоцитоза. Существуют и значительные различия: по сравнению с фагоцитозом и пиноцитозом рецептор-опосредованный эндоцитоз отличается высокой скоростью, селективностью и специфичностью. Это позволяет осуществлять поглощение лигандов, характеризующихся низким содержанием во внеклеточной среде, таких как гормоны, кофакторы (Короленко, 1990; Булычев, Моженок, 1996; Tjelle et al., 2000).

При фагоцитозе происходит поглощение клеткой крупных частиц (более 5 мкм). Впервые этот термин был введен Мечниковым в 1893 году. Этот процесс может осуществляться в различных типах клеток, но, главным образом, происходит в специализированных клетках — «профессиональных» фагоцитах, таких как макрофаги, полиморфноядерные нейтрофилы, моноциты, которые играют важную роль в иммунных процессах. Хотя «профессиональные» фагоциты привлекают наибольшее внимание исследователей, уже давно известно, что эпителиальные клетки, фибробласты и другие клетки способны захватывать частицы in vivo и особенно в культуре (Goldman, 1977). Например, эпителиальные клетки щитовидной железы и мочевого пузыря фагоцитируют эритроциты in vivo (Wakefield, Hicks, 1974; Zeligs, Wollman, 1977), а многие патогены, преимущественно поглощаемые макрофагами in vivo, могут инфицировать другие типы клеток в культуре (Moulder, 1985; Falkow et al., 1992). Основное различие между «профессиональными» и «непрофессиональными» фагоцитами заключается в более ограниченном наборе частиц, которые поглощают «непрофессиональные» фагоциты. Это определяется отсутствием эффективных рецепторов фагоцитоза, таких как рецепторы для иммуноглобулинов и комплемента, имеющихся в специализированных фагоцитарных клетках (Rabinovich, 1995).

Процесс фагоцитоза может быть разделен на несколько этапов: связывание частиц с поверхностью клетки, распространение псевдоподий вокруг частиц, образование эндоцитозных везикул — фагосом, созревание фагосом, слияние поздних фагосом с лизосомами с образованием фаголизосом, в которых происходит деградация поглощенных частиц. Процесс индуцируется сигналами, идущими от рецепторов, вовлеченных в связывание частиц. Взаимодействие между рецепторами и лигандами на поверхности частиц запускает события сигнальной трансдукции, которые приводят к полимеризации актина и созреванию фагосом (Tjelle et al., 2000). При фагоцитозе такие крупные частицы, как бактерии, обычно узнаются несколькими рецепторами (Rabinovich, 1995; Mukherjee et al., 1997). Эти рецепторы могут взаимодействовать напрямую с мишенями через структурные детерминанты, присутствующие на поверхности мишеней (неопсонизированный эндоцитоз) или непрямым путем через опсонины клетки-хозяина. Наиболее характерными рецепторами из группы опсонинов являются рецепторы Fe, относящиеся к иммуноглобулинам G (FcyR) и рецептор комплемента 3 (CR3), который связывает белок комплемента 3bi (Tjelle et al., 2000).

Поглощение бактерий, вирусов и инертных частиц приводит к образованию фагосом, образующихся из впячиваний плазматической мембраны (псевдоподий) вокруг захваченного материала. Основной моделью, предложенной для объяснения процесса поглощения частиц при фагоцитозе, является, так называемая, модель молнии («zipper model») (Griffin et al., 1975, 1976). Сущность этой модели заключается в том, что при образовании псевдоподий происходит последовательное привлечение поверхностных рецепторов фагоцитов, взаимодействующих с нативными белками или опсонинами на поверхности частиц. Показано, что псевдоподии распространяются только до тех пор, пока на поверхности частицы имеются лиганды, связывающиеся с рецепторами плазматической мембраны, аналогично зубцам молнии. Ограничение распространения псевдоподий приводит к тому, что фагоцитоз одной частицы не вызывает поглощения других, находящихся рядом частиц (Griffin et al., 1975, 1976). Процесс формирования псевдоподий сопровождается реорганизацией кортикального актинового цитоскелета, которая происходит в ответ на внутриклеточные сигналы (Greenberg, 1995).

Ранее считалось, что после образования фагосомы быстро сливаются с ли-зосомами (Kielian, Cohn, 1980; 1982 a, b). Дальнейшие исследования показали, что первоначальный состав мембран фагосом практически не отличается от состава плазматической мембраны, далее в результате слияния с ранними и поздними эн-досомами они постепенно приобретают и утрачивают большое количество белков, что приводит к образованию фаголизосом (Desjardins et al., 1994а, 19 946, 1995; Alvarez-Domingez et al., 1997). Три основных процесса участвуют в биохимической трансформации фагосом: молекулы удаляются из фагосом в результате рециклирования, новые белки попадают в фагосомы из цитоплазмы биосинтетическим путем или при слиянии с мембранными органеллами эндоцитозного пути. С помощью двумерного гель-электрофореза и масс-спектрометр и и было идентифицировано более 140 белков, присутствующих в фагосомах и их мембранах (Garin et al., 2001). Для этих экспериментов использовали фагосомы, выделенные из макрофагов мыши (линия J774) и содержащие латексные частицы. В процессе трансформации фагосомы приобретают гидролитические ферменты, интегральные мембранные белки семейства Lamp (lysosome associated membrane proteins), белки, участвующие в слиянии, и ГТФ-азы семейства Rab, выполняющие регуля-торные функции. Гидролитические ферменты поступают в фагосомы постепенно на разных этапах биогенезиса. Например, содержание таких гидролаз, как катеп-син, А (экзопептидаза, необходимая для работы других гидролаз) и /?-гексозаминидаза максимально уже в ранних фагосомах, а количество катепсина S и катепсина D возрастает лишь на более поздних стадиях. Некоторые ферменты (катепсин Z) присутствуют лишь в составе ранних фагосом. Предполагается, что они участвуют в процессинге пептидов на ранних стадиях созревания фаголизо-сом. Постепенное поступление гидролитических ферментов в фагосомы, по-видимому, обеспечивает правильную последовательность процессинга макромолекул, поступающих в фагосомы (Garin et al., 2001).

Кроме гидролитических ферментов, в состав фагосом постепенно включаются актин-связывающие белки — а-актинин и аннексин-VI и белки семейства Hsp70 (heat shock proteins), которые участвуют в транспорте цитозольных белков в эндосомы и лизосомы в клетках дрожжей и млекопитающих (Desjardins et al., 1994b). Большое значение имеет приобретение фагосомами вакуолярных протоь-ных Hf-АТФаз, обеспечивающих понижение (не выше 5.0), рН от исходного нейтрального до кислого в поздних эндосомах (5.5−6.0) и лизосомах для работы гидролитических ферментов в этих органеллах. Рецепторы, такие как рецептор ман-нозо-6-фосфата, Fc (опсонин-зависимый рецептор фагоцитоза) и рецептор транс-феррина, исчезают из состава фагосом в течение 30 минут после их образования (Pitt et al., 1992). Изменения происходят не только в белковом, но и в фосфоли-пидном составе фагосом: на макрофагах мыши линии J774 было показано, что соотношение сфингомиелина к фосфатидилхолину меняется от 0.47 в ранних фа-госомах до 1.51 в поздних фагосомах. Фосфолипидный состав ранних фагосом по многим показателям близок к составу плазматической мембраны, в то время как соотношение фосфолипидов в поздних фагосомах сходно с их соотношением в мембране лизосом (Desjardins et al., 1994b).

Биохимические изменения в составе фагосом, по-видимому, связаны с их способностью сливаться с органеллами, богатыми гидролитическими ферментами. Несомненно, что изменение состава полипептидов, фосфорилированных белков и фосфолипидов фагосом является ключевым процессом в регуляции слияния фагосом с лизосомами и протеолитической деградации при бактериальных инфекциях (Desjardins et al., 1997).

Существует несколько различных гипотез образования фаголизосом. Гипотеза Рабиновича с соавторами (Rabinowitz et al., 1992) предполагает, что вновь образованные фагосомы однократно сливаются с прелизосомным компартментом, соответствующим поздним эндосомам. При этом происходит полное и синхронное перемешивание содержимого обеих органелл и их мембранных компонентов. Данные других авторов указывают на то, что образование фаголизосом, скорее всего, включает серию множественных кратковременных взаимодействий-слияний фагосом с эндоцитозными органеллами. Дежарден с соавторами предложили так называемую «kiss and run» гипотезу (Desjardins, 1995; Storrie, Desjardins, 1996), по которой фагосомы при многочисленных взаимодействиях не полностью сливаются с эндоцитозными органеллами и при этом селективно приобретают вновь синтезированные и эндоцитированные молекулы. Такое взаимодействие фагосом с эндосомами и лизосомами ограничивает смешивание мембранных компонентов этих органелл, обеспечивая свободный обмен содержимым. Ограниченное использование мембран позволяет сохранить их для процесса рециклирования и способствует поддержанию относительно стабильного размера органелл (Duelos et al., 2000). В результате слияния фагосомы также приобретают молекулы, необходимые для уничтожения микробов, интернализованных путем фагоцитоза. Среди них протонные АТФ-азы, участвующие в понижении рН фагосом, а также гидролазы, осуществляющие деградацию их содержимого. Хотя гидролазы присутствуют в разных популяциях эндосом, основная часть этих ферментов содержится в поздних эндосомах и лизосомах. Слияние фагосом с такими органеллами является важным свойством фагоцитарных клеток, обеспечивающим ограничение распространения инфекций (Duelos et al., 2000).

Последовательность слияния фагосом с эндоцитозными структурами, а также молекулярные и морфологические аспекты их взаимодействия в настоящее время мало изучены. Дежарден с соавторами, используя систему слияния in vivo фагосом, содержащих частицы латекса, и эндосом, включающих частицы коллоидного золота, обнаружили, что присоединение определенных полипептидов, в частности, низкомолекулярных ГТФаз — Rab5, Rab7 и Rabi, в процессе созревания фагосом, по-видимому, регулирует особенности мембранных взаимодействий фагосом с эндосомами и лизосомами (Desjardins et al., 1994а- 1997). Биохимический анализ показал изменения в уровне Rab-белков, связывающихся с фагосомами при их созревании, в то время как другие белки слияния, включая синаптобревин 1 и 2, оставались на постоянном уровне. Ранние фагосомы, в основном содержащие белок Rab5, участвуют в слиянии с ранними эндосомами, также содержащими Rab5. Последующее слияние фагосом с поздними эндосомами может быть связано с приобретением фагосомами молекул Rab7. Изменение свойств фагосом, например, понижение pH, может вызывать потерю белка Rab5 и приобретение Rab7 из цитозольного пула (Desjardins et al., 1997).

Семейство Rab состоит из более 40 белков ГТФ-аз, регулирующих и координирующих везикулярный транспорт при эндоцитозе и экзоцитозе, а также участвующих в процессах слияния мембранных органелл с органеллами-мишенями. В целом Rab-белки в настоящее время рассматриваются как основные регуляторы внутриклеточного мембранного транспорта, которые обеспечивают интеграцию молекулярных взаимодействий на каждом этапе транспортного пути (Rodman, Wandinger-Ness, 2000). Органеллы секреторного и эндоцитозного пути характеризуются определенными наборами Rab-белков, связанными с их мембранами. Специфичность локализации Rab-белков обеспечивается структурными детерминантами, уникальными для каждого члена семейства, которые, по-видимому, распознаются различными группами белков на поверхности клетки. Rab-белки имеют две конформации: активные Rab-белки связаны с ГТФ (гуанозинтрифосфатом) — после гидролиза ГТФ, одновременно или сразу после слияния мембран, они переходят в неактивную ГДФ-связанную форму. Таким образом, транспортные везикулы содержат Rab-белки в ГТФ-связанной форме, а мембраны-мишени получают Rab-белки в ГДФ-связанной форме (Pfeffer et al., 1995).

Функционально активные Rab-белки связываются с эффекторными белками, которые участвуют во многих процессах в клетке от отпочковывания и стыковки мембранных органелл до взаимодействий с цитоскелетом (McLauchlan et al., 1998; Christoforidis et al., 1999; Echard et al., 1998; Nielsen et al., 1999). Недавно было показано, что один из наиболее хорошо охарактеризованных Rab-белков эндосом — Rab-5 в активной форме специфически связывается с большим количеством (более 20) цитозольных белков (Christoforidis et al., 1999). Специфическое связывание носит скорее временный характер: Rab-5 участвует в определенных циклах для задействования максимального числа эффекторов. Предполагается, что эффекторные белки Rab-ГТФаз действуют совместно, выполняя общие функции. Например, Rab-5 после активации комплексом Rabaptin-5/Rabex-5 может стимулировать фосфоинозитол-3 киназы, обеспечивающие локальное образование фосфоинозитол-3 фосфата. Наличие фосфоинозитол-3 фосфата и активной формы Rab-5 необходимо для связывания белка ЕЕА1 (early endosomal antigen), участвующего в стыковке органелл с мембраной эндосом (Mu et al., 1995). ЕЕА1 непосредственно взаимодействует с белком семейства SNARE, syntaxin 13, с образованием олигомерного комплекса, который служит основой для поры слияния (McBride et al., 1999). Эта модель может объяснить, каким образом эндосомы не теряют структурной и функциональной целостности при активном обмене мембранными компонентами с другими органеллами. Предполагается, что Rab-белки вместе с набором эффекторов участвуют в компартментализации мембранных структур в клетке. Функциональная организация молекулярных комплексов в виде мембранных доменов повышает эффективность и координацию процессов, контролирующих доставку транспортных везикул, сортинг белков и взаимодействия с цитоскелетом (McBride et al., 1999; Sonnichsen et al., 2000).

Ранее считалось, что фаголизосомы являются конечным этапом фагоци-тозного пути, но в последнее время появились данные об изменениях, происходящих в составе и динамике фаголизосом (Desjardins et al., 1994аBerthiaume et al., 1995). Так, например, было показано, что макромолекулы внутри фаголизосом могут распределяться по размеру: более крупные молекулы прямо транспортируются в лизосомы и задерживаются в них, а продукты их гидролиза могут перемещаться в обратном направлении и рециклировать к плазматической мембране. Таким образом, небольшие молекулы способны перемещаться через органел-лы эндоцитозного пути в двух направлениях и рециклировать к плазматической мембране без участия специфических органелл. Разделение молекул по размеру происходит на разных этапах эндоцитоза: во время их поглощения, при транспорте в фаголизосомы, в процессе СЛФ и внутри фаголизосом (Berthiaume et al., 1995). Предполагается, что при слиянии фагосом с эндосомами и лизосомами образуется так называемый комплекс слияния, лимитирующий размер молекул, перемещающихся между органеллами (Duelos et al., 2000).

Одна из недавних работ посвящена изучению влияния химической природы частиц, поглощенных макрофагами, на внутриклеточный транспорт фагосом (Oh, Swanson, 1996). В экспериментах с использованием различных типов фагоцитируемых частиц показано, что от их химической природы зависят функциональные характеристики фаголизосом: степень взаимодействия с лизосомным компартментом, продолжающееся после образования фаголизосом, и время внутриклеточной деградации ассоциированных с частицами белков (Oh, Swanson,.

1996).

Важную роль в регуляции различных этапов эндоцитоза играют фосфати-дилинозитол-3-киназы (ФИ-З-киназы), катализирующие фосфорилирование ино-зитольных колец фосфатидилинозитолов (Shpetner et al., 1996; Mukherjee et al.,.

1997). Эти молекулы также влияют на ход фагоцитоза, в частности, на процесс образования и созревания фагосом (Gillooly et al., 2001).

Ферменты семейства ФИ-З-киназ вовлечены в процессы сигнальной трансдукции, реорганизации цитоскелета, сортинга белков и мембранного транспорта. Мишенями их действия являются эффекторные и адапторные белки, выполняющие многочисленные функции в клетке. К настоящему времени описаны пять классов ФИ-З-киназ, различающихся по субстратной специфичности, структурной организации и регуляции. Наиболее хорошо изучен и широко распространен класс гетеродимерных р85/р110 ФИ-З-киназ (ФИ-З-киназы класса I), состоящих из двух субъединиц: каталитической с молекулярной массой 110 кД (р110) и регуляторной (р85) (Шпаков, 1999). Эксперименты по селективному удалению генов, кодирующих специфические субъединицы ФИ-З-киназ, продемонстрировали, что ФИ-З-киназы класса I необходимы для фагоцитоза крупных частиц, но не участвуют в процессе созревания фагосом. В отличие от них ФИ-З-киназы класса III задействованы на этапе образования фаголизосом, то есть при слиянии фагосом с эндосомами и лизосомами (Vieira et al., 2001).

В клетках млекопитающих ФИ-З-киназы участвуют в транспорте рецепторов в процессе эндоцитоза (Rameh, Cantley, 1999). В экспериментах по изучению функций этих ферментов использовался продукт метаболизма грибов Penicillium fumiculosum, вортманнин. Связываясь с каталитической субъединицей ФИ-З-киназы, вортманнин ингибирует активность фермента, оказывает влияние на процесс эндоцитоза поверхностных рецепторов, а также блокирует транспорт ин-тернализованных рецепторных комплексов фактора роста тромбоцитов (ФРТ) и ЭФР в поздние эндосомы и их последующую деградацию в лизосомах (Shpetner et al., 1996; Железнова и др., 2001). Обработка клеток вортманнином в концентрации 30−100 нм снижает скорость, с которой интернализованный рецепторный комплекс трансферрина транспортируется из ранних эндосом в компартмент рециклирования, а также блокирует гомотипическое слияние эндосом in vitro (Backer, 2000). На клетках эпидермоидной карциномы человека (линия А431) было показано, что вортманнин блокирует сортировку ЭФР-рецепторных комплексов, нарушая транспорт из ранних эндосом в поздние. Эффект вортманнина проявляется более сильно при низких концентрациях ЭФР (до 1−10 нм), при которых функционирует специфическая система сортировки, зависящая от тирозинкиназ-ной активности рецептора. Активация тирозинкиназы рецептора приводит к ау-тофосфорилированию остатков тирозина в его цитоплазматическом домене, которое делает возможным их взаимодействие с 8Н2-доменами белков, инициирующих реакции сигнальной трансдукции. При увеличении концентрации ЭФР-рецепторных комплексов сортировка происходит с меньшей эффективностью и не зависит от активности тирозинкиназы (Железнова и др., 2001).

С другой стороны, активация ФИ-З-киназы рецепторами тирозинкиназ приводит к увеличению скорости эндоцитоза, усилению поглощения рецепторно-го комплекса и рециклирования рецептора трансферрина (Corvera, Czech, 1998). ФИ-З-киназы класса р85/р 110 активируются рецепторами тирозинкиназ при связывании регуляторной субъединицы, содержащей 8Н2-домены, с тирозиновыми сайтами фосфорилирования киназ, или их субстратов (Шпаков, 1999, Backer, 2000). Кроме того, вортманнин вызывает изменения в морфологии эндосом, содержащих рецепторные комплексы трансферрина, ЭФР и маркеры жидко-фазного эндоцитоза. Иммунофлуоресцентный анализ выявил изменения в морфологии ранних эндосом, содержащих ЭФР-рецепторные комплексы. Инкубация клеток с вортманнином приводит к концентрации ранних эндосом в околоядерной области и увеличению их размеров (Железнова и др., 2001). Была обнаружена корреляция между понижением эндогенного уровня фосфатидилинозитол-3-фосфата (ФИ-З-Ф) и изменениями в морфологии органелл. По-видимому, ФИ-3-Ф является липидным продуктом ФИ-З-киназы, контролирующим структурную организацию эндосом (Shpetner et al., 1996).

Аналогичные изменения в структуре мембранных органелл вызывает токсин грибов Penicillium brefeldanum, брефельдин, А (БФА) (Stoorvogel et al., 1996; Fukunaga et al., 1998). Такое сходство указывает на возможность существования общих внутриклеточных мишеней действия этих двух агентов. БФА влияет на активность гуанозинтрифосфатазы (ГТФазы) АРФ, связывающейся с комплексом белков окаймления — коатомером и у-адаптином. Предполагается, что изменения в структуре органелл, вызванные БФА, происходят в результате нарушения сборки цитозольных белков окаймления. И хотя к настоящему времени белки, образующие окаймление эндосом, не были идентифицированы, в литературе имеются косвенные данные об их существовании (Killisch et al., 1992, Rabinowitz et al., 1992). Таким образом, активность ФИ-З-киназ необходима для интернализации, сортировки поверхностных рецепторов в ранние эндосомы, регуляции структуры эндосом, для транспорта молекул, предназначенных для деградации, в поздние эндосомы и лизосомы, а также для транспорта рецепторов в компартмент рециклирования (Shpetner et al., 1996; Corvera, Czech, 1998, Backer, 2000). В целом механизмы, с помощью которых фосфатидилинозитол 3-киназы регулируют транспорт макромолекул в процессе эндоцитоза, изучены пока недостаточно.

2.2 Лизосомы.

Развитие методов дифференциального и изопикнического центрифугирования привело к открытию Де Дювом внутриклеточных частиц, окруженных мембраной и содержащих гидролитический фермент — кислую фосфатазу (De Duve, 1963). Эти частицы были названы лизосомами. В отличие от других ком-партментов клетки, лизосомы невозможно идентифицировать на основе их формы, размера и внутренней структуры из-за большой вариабельности этих параметров. Лизосомы были определены на основе их функций как органеллы, богатые гидролитическими ферментами и обеспечивающие деградацию макромолекул, которые поступают в них из внеклеточного пространства через эндоцитоз или из цитоплазмы путем аутофагии (De Duve, 1983). Кроме наличия большого количества гидролитических ферментов (более 50), лизосомы характеризуются отсутствием рецепторов маннозо-6-фосфата и рециклирующих поверхностных рецепторов. В дальнейшем именно отсутствие рецептора маннозо-6-фосфата использовалось для отделения лизосом от поздних эндосом, также содержащих многие гидролитические ферменты и осуществляющих начальный этап гидролиза макромолекул (Griffiths et al., 1988; Kornfeld, Mellman, 1989). Особенности мембран поздних эндосом и лизосом, по-видимому, связаны с их ролью в сегрегации и компартментализации гидролитических ферментов. Лизосомные мембранные белки принимают участие и в других функциях лизосом, включая защиту мембраны от деградации, транспорт продуктов гидролиза, транспорт протонов для поддержания кислого рН и контроль взаимодействия и слияния с другими орга-неллами (Hunziker, Geuze, 1996). В мембранах лизосом обнаружены специфические мембранные белки, среди которых выделяют 5 основных классов: LAMP-1, LAMP-2 (lysosome-associated membrane proteins), LIMP-I, LIMP-I1 (lysosomal integral membrane proteins) и lgps (lysosomal glycoproteins). Интегральные мембранные белки LAMPs и LIMPs составляют около 50% от общего белка лизосомной мембраны. Эти белки содержат высоко гликозилированный люминальный домен, который защищает их от действия лизосомных гидролаз и короткий цитозольный С-терминальный домен со специфическим мотивом, взаимодействующий с адап-торными комплексами и обеспечивающий доставку белков в лизосомы. Синтезируемые интегральные мембранные белки доставляются прямым или непрямым (через плазматическую мембрану) путем из цистерн транс-Гольджи в лизосомы. Природа везикулярных переносчиков белков LAMP из транс-Гольджи в поздние эндосомные компартменты не установлена (Luzio et al., 2003).

Одной из основных функций лизосомной мембраны является регуляция притока метаболитов, образующихся при деградации макромолекул в лизосомах. Транспорт этих мономерных продуктов деградации происходит путем пассивной диффузии или с помощью специфических транспортных систем. Через мембрану лизосом, в основном, диффундируют небольшие молекулы с молекулярной массой менее 200 Да. К настоящему времени идентифицировано более 20 белковых систем, транспортирующих небольшие молекулы через лизосомную мембрану. Однако клонированы только два белка цистинозин и сиалин, участвующие в транспорте цистина и сиаловой кислоты (Winchester, 2001).

Важную роль в функционировании лизосом играет вакуолярная протонная Н±АТФ-аза, которая поддерживает низкий уровень рН в лизосомах, связывая гидролиз АТФ в присутствии Са2+ с переносом протонов. Вакуолярная протонная НГ-АТФ-аза представляет собой макромолекулярный комплекс, который пронизывает лизосомную мембрану и состоит из 13 субъединиц. В его состав входят два функциональных домена: Vi и V0. Домен Vi осуществляет гидролиз АТФ и включает 8 субъединиц, расположенных на цитоплазматической стороне мембраны. Домен Vo — интегральный мембранный комплекс, состоящий из 5 различных субъединиц, ответственных за перенос протонов. Фосфолипиды, включая сфин-гомиелин, являются основными липидными компонентами лизосомной мембраны. В составе мембраны также обнаружен относительно высокий уровень холе-стерола (Winchester, 2001). Недавно показано, что убихинон участвует в лизосомной электронно-транспортной цепи, которая способствует проникновению протонов через мембрану лизосом (Gille, Nohl, 2000).

Большая часть синтезированных лизосомных гидролаз доставляется в лизо-сомы после присоединения к ним маннозо-6-фосфата в цистернах цис-Гольджи и связывания с маннозо-6-фосфатными рецепторами в транс-Гольджи. Затем, гидролазы попадают в эндосомы, где кислая среда способствует их диссоциации от рецепторов, которые рециклируют в транс-Гольджи. В результате слияния поздних эндосом с прелизосомным компартментом ферменты доставляются в лизо-сомы. Синтезированные интегральные мембранные белки направляются прямым или непрямым (через плазматическую мембрану) путем из транс-Гольджи в лизо-сомы (Luzio et al., 2000).

Лизосомы играют важную роль в процессинге метаболитов. Нарушения в структуре и функционировании лизосомных ферментов и их кофакторов, лизосомных мембранных белков или белков, участвующих в посттрансляционных модификациях или транспорте лизосомных белков, приводят к лизосомным болезням накопления. К настоящему времени обнаружено более 40 таких болезней (Winchester et al., 2000).

Генетически обусловленное отсутствие одного из ферментов лизосом или его низкая активность является причиной возникновения «лизосомных болезней накопления», то есть аккумуляции метаболита в лизосомах. Так, например генетические нарушения одной и более лизосомных гидролаз приводит к развитию мукополисахаридозов, олигосахаридозов и липидозов (Бспуег е1 а1., 1995).Самая большая группа лизосомных болезней накопления связана с нарушением синтеза лизосомных гидролаз или их эффекторных белков. Эти болезни могут быть следствием отсутствия нормального гликозилирования ферментов, нарушения синтеза предшественника фермента, недостаточности синтеза маннозо-6-фосфата и других нарушений (Булычев, 1991).

Ряд низкомолекулярных метаболитов, образующихся в результате деградации высокомолекулярных соединений в лизосомах, неспособен диффундировать через лизосомную мембрану в цитозоль. Их транспорт осуществляется с помощью специальных переносчиков. Врожденные нарушения системы переносчиков могут также вызвать накопление низкомолекулярных продуктов гидролиза и быть причиной возникновения лизосомных болезней (Булычев, 1991).

В 1974 году Де Дювом с соавторами была выдвинута концепция о «лизосо-мотропных» соединениях (Бе Оиуе е1 а1., 1974). Понятия «лизосомотропизм» и «лизосомотропные» соединения были введены для описания процессов избирательного накопления в лизосомах веществ, различных по физико-химическим и биологическим параметрам, способных впоследствии модифицировать свойства лизосом и клеток в целом. Среди лизосомотропных соединений Де Дюв выделил три основные группы соединений.

1. Неорганические соединения, аккумулирующиеся в лизосомах — железо, свинец, торий, кремний, асбест, частицы углерода и др.

2. Органические микромолекулы — сахароза, основные красители, пептиды, ман-нитол и некоторые лекарственные средства.

3. Органические макромолекулы — белки, полисахариды (декстран и др.), синтетические полимеры — тритон 339, поливинилпирролидон.

Покровский и Тутельян выделили три основные формы лизосомотропизма (Покровский, Тутельян, 1976). Первая из них связана с избирательным накоплением определенных веществ в лизосомном матриксе. Эта форма достаточно перспективна для разработки новых методов лекарственной терапии. Вторая форма лизосомотропного воздействия проявляется при избирательном повреждении лизосомных мембран, характерном для некоторых патологических процессов. К числу таких процессов относится воздействие некоторых токсинов на мембраны лизосом, приводящее к их разрыву и выходу кислых гидролаз в цитозоль и разрушению клеток. Третья форма характеризуется избирательным воздействием специфических ингибиторов некоторых лизосомных ферментов, локализованных как в мембранах, так и в матриксе лизосом (Покровский, Тутельян, 1976).

Вещества, попадающие в лизосомы, способны изменять свойства мембран этих органелл. При этом может происходить как лабилизация, так и стабилизация лизосомных мембран. Лизосомотропные препараты, в отличие от других соединений, действуют на мембрану лизосом изнутри. Однако в большинстве случаев необходимо учитывать и влияние этих веществ на цитоплазматическую сторону лизосомной мембраны. Так, типичное лизосомотропное вещество — тритон WR-1339 — ингибируя определенные ферменты лизосом, одновременно вызывает изменения проницаемости лизосомной мембраны (Короленко, 1990).

Главными механизмами проникновения лизосомотропных соединений в клетки является эндоцитоз и неионная диффузия. Известно, что ряд слабых оснований, благодаря их высокой растворимости в липидах, в недиссоциированной форме проникают через мембрану клетки. Внутри клетки слабые основания ионизируются и аккумулируются в виде катионов в кислых вакуолярных компарт ментах клетки. Для процесса проникновения и аккумуляции лизосомотропных агентов большое значение имеет величина их рК. Вещества с рК около 8.0 обладают наиболее выраженными лизосомотропными свойствами. Основные вещества с рК выше 8.0 проникают в клетки гораздо медленнее (De Duve et al., 1974).

Изучение феномена лизосомотропизма имеет большое значение как для исследования фундаментальных механизмов эндоцитоза и катаболизма макромолекул, так и для использования лизосомотропных агентов в медицинской практике. В целом, необходимо отметить, что биологическая активность лизосомотропных веществ к настоящему времени изучена недостаточно и комплексный подход к исследованию их действия на лизосомный аппарат клетки в литературе отсутствует.

Лизосомы обычно рассматриваются как терминальный компартмент эндо-цитозного пути, играющий важную роль в деградации фагоцитированного материала (Funato et al., 1997), кринофагии (Noda, Farquhar, 1992) и протеолизе цитозольных белков, транспортирующихся через лизосомную мембрану с помощью переносчиков (Cuervo, Dice, 1996). Представление о том, что лизосомы осуществляют лишь функцию деградации макромолекул, в последнее время изменилось, благодаря лучшему пониманию процесса доставки в них поглощенного материала, их динамического взаимодействия с другими органеллами эндоцитозного пути и в результате обнаружения во многих типах клеток секреторных лизосом (Storrie, Desjardins, 1996; Griffiths, 1996, Stinchcombe, Griffiths, 1999; Luzio et al., 2000).

В отличие от обычных секреторных экзокринных и эндокринных клеток, имеющих отдельные органеллы для хранения и выделения секреторных продуктов, клетки иммунной системы, большинство из которых происходит из гемопо-этической линии, используют для этой цели лизосомы. Эти специализированные лизосомы были названы секреторными (Griffiths, 1996). Секреторные лизосомы содержат мембранные белки и кислые гидролазы, характерные для лизосом, а также специализированные секреторные продукты. Они выполняют функции лизосом, но в то же время способны упаковывать специализированные секреторные белки и сливаться с плазматической мембраной для осуществления процесса секреции. Морфологически секреторные лизосомы являются органеллами смешанного типа: они образуются из мультивезикулярных структур, характерных для лизосом, и плотных структур, характерных для секреторных гранул. Исследования биогенеза секреторных лизосом Т-лимфоцитов показали, что электронно-плотное ядро образуется и постепенно увеличивается внутри мультивезикулярной структуры (Griffiths, Argon, 1995). В зрелых Т-лимфоцитах наблюдается высокая степень совпадения между лизосомными и секреторными маркерами, указывающая на то, что большинство лизосом в этих клетках является секреторными. В отличие от них нейтрофилы, наряду с секреторными, содержат и обычные лизосомы (Stinchcombe, Griffiths, 1999). Механизмы, регулирующие сортировку белков в секреторные лизосомы, сходны с механизмами доставки лизосомных белков и белков секреторных гранул, действующих в специализированных секреторных клетках. Однако в клетках крови эти белки направляются в те же самые органеллы. Например, мембраносвязанные белки GMP-17 (granule membrane protein) и CTLA-4, экспрессирующиеся только в клетках, имеющих секреторные лизосомы, содержат тирозиновые мотивы лизосомных мембранных белков, которые обеспечивают их селективную доставку в секреторные лизосомы (Stinchcombe, Griffiths, 1999). Кроме того, секреторные лизосомы могут использовать специализированные механизмы для сортировки и секреции белков, отличные от механизмов, используемых обычными секреторными клетками (Bossi, Griffiths, 1999).

Клетки иммунной системы осуществляют как эффекторные, так и регуля-торные функции. Поэтому секреторные лизосомы Т-лимфоцитов содержат не только растворимые белки, необходимые для разрушения вирусных агентов и злокачественных клеток (такие как перфорин и гранзимы), но и мембраносвязан-ные белки, контролирующие иммунный ответ (Fas-лиганд и CTLA-4). Узнавание клеток-мишеней рецепторами Т-клеток запускает управляемое кинезином движение секреторных лизосом вдоль микротрубочек к месту контакта на мембране между Т-лимфоцитом и клеткой-мишенью. Мембраны секреторных лизосом затем сливаются с плазматической мембраной, не только высвобождая растворимые белки (перфорин), но и доставляя мембранные белки к месту взаимодействия с клеткой-мишенью. Доставка этих белков через секреторные лизосомы позволяет Т-лимфоцитам сохранять эти белки внутри клетки, контролировать точную локализацию и время их действия. Это особенно важно для обеспечения специфичности ответа Т-лимфоцитов и для защиты от разрушения соседних клеток (Stinchcombe, Griffiths, 1999).

Хотя секреторные лизосомы, в основном, характерны для клеток гемопо-этической линии, существуют и другие клетки, такие как меланоциты и клетки эпителия почек, использующие лизосомный компартмент для регулируемой секреции (Orlow, 1995; Swank et al., 1998). Также имеются данные о том, что клетки почек крысы и клетки СНО способны к секреции содержимого лизосом в ответ на повышение уровня кальция (Coorssen et al., 1996; Rodriguez et al., 1997).

Кроме того, секреторные лизосомы вовлечены в процесс репарации плазматической мембраны при различных повреждениях. Восстановление повреждений плазматической мембраны происходит с помощью экзоцитоза, в котором участвуют эндосомы и лизосомы. Приток ионов кальция к местам повреждения вызывает слияние мембран эндосом и лизосом с плазматической мембраной и, таким образом, способствует восстановлению ее нативного состояния (Miyake, McNeil,.

1995). Эти наблюдения указывают на то, что механизм регулируемой секреции содержимого лизосом, используемый гемопоэтическими клетками, присутствует и в других типах клеток и, возможно, является примитивной секреторной системой, усиленной только в клетках, осуществляющих иммунные функции. В этом случае можно предположить, что разделение на специализированные секреторные и лизосомные компартменты экзокринных и эндокринных секреторных клеток появилось в ходе дальнейшего эволюционного развития (Stinchcombe, Griffiths, 1999).

Данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе путей мембранного транспорта, включающих лизосомы, и процессов их слияния с поздними эн-досомами и плазматической мембраной, полученные в последнее время, позволили сформировать представление об этих органеллах, как об очень динамичных структурах. Актуальной задачей в настоящий момент является изучение олиго-мерных белковых комплексов, принимающих участие в биогенезе, внутриклеточном транспорте компонентов лизосом и процессах слияния. Исследования в этом направлении будут способствовать более глубокому пониманию регуляции функций лизосом в норме и при патологических состояниях, в частности, при возникновении лизосомных болезней накопления.

6. ВЫВОДЫ.

1. Бензофенантридиновые алкалоиды, сангвинарин и хелеритрин, накапливаются в фибробластах в высоких концентрациях по сравнению с их содержанием в инкубационной среде. Одним из основных компартментов, участвующих в аккумуляции фибробластами сангвинарина и хелеритрина, является эндосомо-лизосомный компартмент.

2. Сангвинарин и хелеритрин ингибируют активность лизосомных ферментов фибробластов мыши. Приблизительно 50% ингибирование активности Л/-ацетил-Д?>-глюкозаминидазы, /?-галактозидазы, арилсульфатазы и кислой липазы наблюдается при концентрации сангвинарина 100 мкМ в среде. Хелеритрин в той же концентрации вызывает значительное (30−50%) снижение активности этих ферментов.

3. Данные о БН-чувствительности лизосомных ферментов к блокаторам • 8Н-групп (пара-хлормеркурибензойная кислота и А^-этилмалеимид), а также Б-Б-восстанавливающему агенту (дитиотреитол), свидетельствуют о том, что ингибирующий эффект сангвинарина непосредственно связан с блокированием БН-групп этих ферментов.

4. Билирубин, хелеритрин и фарморубицин стимулируют слияние фагосом с лизосомами и увеличивают содержание Ф-актина в перитонеальных макрофагах мыши. Эти агенты также вызывают изменения состояния лизосомных мембран гепатоцитов мыши. Стимулирующий эффект билирубина на слияние лизосом с фагосомами связан в значительной степени с увеличением текучести лизосомных мембранпри действии фарморубицина и хелеритрина больший вклад в стимуляцию слияния мембран лизосом и фагосом вносят изменения состояния цитоскелета.

5. Комплексы плазмидной ДНК с катионными векторамиполиэтиленимином, полиаргинином, поли-Ь-лизином и поли-О-лизином — ингибируют слияние лизосом с фагосомами в перитонеальных макрофагах мыши и в клетках 1774, что свидетельствует об аккумуляции этих комплексов в лизосомах.

Лизосомотропные вещества сурамин и декстран сульфат ингибируют или стимулируют процесс трансфекции комплексов плазмидной ДНК с различными поликатионами в клетках Cos-7. Характер действия определяется природой вектора, образующего комплексы с плазмидной ДНК.

Комплексное исследование влияния лизосомотропных соединений на функциональную активность лизосомного аппарата клетки впервые выявило, что характер их действия определяется молекулярными особенностями каждого из этих соединений.