Гель-электрофорез — один из стандартных молекулярно-биологических методов анализа. Молекулы белка в растворе обладают зарядом при любом значении pH, отличном от их изоэлектрической точки. Это обуславливает их подвижность в электрическом поле. Разделяют белки в полиакриламидных гелях (ПААГ), имеющих по сравнению с агарозными гелями меньший размер пор. Гель образуется в результате полимеризации мономерных молекул акриламида в присутствии N, N'-метилен-бис-акриламида, формирующего поперечные сшивки. Варьированием концентрации мономеров можно добиваться получения пор различного размера. ПАА-гели плотнее агарозных, устойчивы к кипячению в воде, пластичные и менее ломкие.
ПААГ состоит из зон концентрирующего и разрешающего геля. Концентрация акриламида в разрешающем геле зависит от размеров белка — для крупных белков используют гели с низкой концентрацией, начиная от 5% и выше, менее крупные белки разделяют в мелкопористых гелях, содержащих до 20−25% акриламида. Заливка геля и электрофоретическое разделение белков в пластине геля происходит в вертикальном положении. Разработано большое количество модификаций метода электрофореза белков в ПААГ для решения различных задач и для разных белков и пептидов. Наиболее распространѐнной разновидностью является электрофорез белков в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (хаотропный агент, ПАВ) по Лэммли (Laemmli, 1970). Далее приведена одна из модификаций этого метода. Южно промокательной метод — используется для исследования и определения последовательность ДНК в ДНК образце;
Северная промокательной — применяется для изучения РНК и выделения типов РНК из множество видов образцов РНК. Вестерн блоттинга — исследует белки и формирование антител;
Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, применяемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку. Существует множество коммерческих компаний, специализирующихся на производстве антител (как поликлональных так и моноклональных) к десяткам тысяч различных белков. Вестерн-блоттинг используется в биохимии, генетике, молекулярной биологии, и в других естественно-научных дисциплинах. Другие сходные методы используют антитела для определения белков в тканях и клетках посредством иммуноокрашивания и иммуноферментного анализа (ИФА, англ. ELISA).Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка в Стэнфорде. Название вестерн-блот было дано технике У. Нейлом Бурнеттом и является игрой слов от названия Саузерн блоттинг, — методики определения.
ДНК, разработанной ранее Эдвином Саузерном. Аналогичный метод определения РНК называется нозерн блоттингом, детекцияпосттрансляционных модификаций белков называется истерн блоттингом. Восточной промокательной — занимается обнаружением модификаций белков, модификации в этом случае являются посттрансляционного типа;
Массивы — используются для исследования последовательности ДНК;Аллель конкретных олигонуклеотид — позволяет выявить возникшие мутации. Кроме этих методов появляются и более новые, современные методы. Некоторые методы стареют, соответственно появляются новые методы, более продуктивные. Молекулярная биология продолжает развиваться, так как в медицине без нее пришлось бы очень сложно. Клонирование Выражения — Данный метод помогает научным работникам понять функцию протеина. ДНК, которая кодирует для определенного протеина скопировано или клонировано используя PCR в вызванный вектор выражения плазмидой. Плазмида введена или к бактериальной клетке или к животной клетке. Эта плазмида имеет элементы промоутера, которые могут простимулировать высокое выражение пожеланного протеина так, что свою ферментационную деятельность можно после этого рассмотреть.
Заключение
.
Молекулярная биология — это наука о механизмах хранения, воспроизведения, реализации и передачи генетической информации, о функциях и структуре нерегулярных биополимеров -белков и нуклеиновых кислот. Начав с изучения биологических процессов на молекулярно-атомном уровне, молекулярная биология перешла к сложным надмолекулярным клеточным структурам, а в настоящее время успешно решает проблемы физиологии, генетики, экологии и эволюции. Предметом молекулярно-биологических исследований являются важнейшие жизненные процессы и феномены, такие как изменчивость и наследственность, клеточная дифференцировка и пролиферация, биосинтез белков, контроль экспрессии генов, ответы клеток на стрессы и др. Ключевое значение во всех данных процессах имеют молекулы нуклеиновых кислот и белков. Современную биохимию и молекулярную биологию трудно разграничить друг от друга и от остальных наук, попадающих под определение «физико-химическая биология».
Литература
.
Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 2013.Т. 1- 3. Белясова Н. Биохимия и молекулярная биология. М.:Книжный дом, 2014.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и примененение. М.: Мир, 2012.
Коничев А.С., Севастьянова Г. А. Молекулярная биология. М.: Академия, 2012.
Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот / под ред. А. С. Спирина. М.: Высш. школа, 2014 Т.
1. С. 29−31.Патрушев Л. И. Экспрессия генов. — М.: Наука, 2014. — 000 с., ил. ISBN 5−02−1 890−2Сингер М., Берг П. Гены и геномы. — Москва, 2013.
Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. — Москва, 2010.
Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.: Изд-во МГУ, 2015.
