Флуоресцентные методы общего учета бактерий

По характеру взаимодействия красителя с соответствующими структурами клетки красители могут быть объединены в две группы. Красители первой группы флуоресцируют, специфически связываясь с соответствующими компонентами клетки. Обычно это нуклеиновые кислоты или белки независимо от того, метаболически активна клетка или нет. Красители второй группы начинают флуоресцировать только после их метаболической модификации внутри клетки, т. е. с помощью красителей этой группы выявляют физиологически активные клетки.

К первой группе относятся, например, такие красители, как акридин оранжевый (АО), 4,6-диамидино-2-фенилиндол (4,6- diamino-2-phenylindole, DAPI), флуоресцеинизотиоцианат (FITC), 5-(4,6-дихлортриазин-2-ил), аминофлуоресцеин [(5-(4,6- dichlorotriazine-2-yl)aminofluorescein, DTAF)].

Среди второй группы следует назвать флуоресцеиндиацетат (fluorescein diacetate, FDA) и 5-(и 6-)сульфофлуоресцеиндиацетат [(5- и 6-) sulfofluorescein diacetat, SFDA)].

Для общего учета живых и мертвых клеток в пробах воды наиболее часто используют красители, связывающиеся с ДНК и РНК, такие как АО и DAPI. Комплекс AO-ДНК флуоресцирует зеленым светом, комплекс АО-PH К — красным светом. DAPI более специфичен и химически связывается с двойной цепочкой ДНК, особенно с участками, богатыми аденином и тимином, и в меньшей степени с неклеточными структурами.

Особенностью красителей АО и DAPI является то, что они, как катионные красители, адсорбируются негативно заряженными частицами почвы, глины, а также фосфолипидами. АО и DAPI наиболее подходят для окрашивания микроорганизмов в водных образцах, хотя их применяют и для окрашивания микроорганизмов в почвенных суспензиях.

Для общего подсчета микроорганизмов в почве в настоящее время широко используются анионные красители FITC и DTAF, которые имеют низкий уровень связывания с неклеточными структурами и дают хороший контраст при наблюдении под микроскопом. Эти красители связываются с аминогруппами белков на поверхности клетки.

Метод на основе использования FITC позволяет достаточно точно определить количество и, возможно, размер бактериальных клеток в суспензии почвы, содержащей от 20 до 80% частиц почвы. Однако последнее крайне проблематично, так как образующийся светящийся ореол вокруг клеток приводит к завышению размера клеток. Поэтому для определения размеров клеток следует или применять фазово-контрастную микроскопию, или окрашивать клетки по Граму, используя лишь первую реакцию этого метода.

С помощью FITC можно также выявлять мицелий, конидиоспоры грибов и споры актиномицетов. Следует помнить, что очень трудно споры Slreptomyces отличить от обычных бактериальных клеток.

В качестве практического примера общего учета клеток в естественных субстратах с использованием флуоресцентной микроскопии ниже приводится методика общего учета бактерий в почве, окрашенных с помощью FITC.

Для любого метода общим требованием является обязательная предварительная фильтрация всех растворов реагентов, которые будут использованы в работе, через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм или меньше. Желательно подобрать разведение исследуемого образца так, чтобы в поле зрения было от 20 до 50 клеток. При использовании метода необходимо иметь краситель FITC (например, фирмы Sigma); 0,5 М карбонатный буфер (Na₂C0₃) pH 9,6; 0,2 М фосфатный буфер (КН₂Р0₄) pH 7,2; физиологический (0,85%) раствор NaCl; 5%-й раствор пирофосфата (Na₄P₂0? ЮН₂0); дистиллированную воду; черный поликарбонатный мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм (Nucleoроге) и диаметром пластинки 25 мм; не флуоресцирующее иммерсионное масло; предметные и покровные стекла (размером до -30×30 мм, все виды стекол должны быть обезжирены); смесь парафина и канадского бальзама (1:1) или лак для ногтей для заливки краев между покровным и предметным стеклами, предотвращающие высыхание препарата; пипетки со стерильными сменными наконечниками (Pipettes); шприцы стерильные (на 1 — 5 мл); держатель для фильтра диаметром 25 мм; пинцеты; секундомер и люминесцентный микроскоп с соответствующими объективами и светофильтрами.

Перед процедурой окрашивания готовят физиологический раствор:

NaCl, 0,85 г NaCl растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Краситель готовится путем растворения 2 мг FITC в 1 мл 0,5 М карбонатного буфера, pH 9,6 с последующим добавлением 4,4 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 7,2, и 4,4 мл 0,85%-го раствора NaCl. Смесь можно хранить при комнатной температуре в темноте в течение 6 ч.

Если предполагается определять численность бактерий в почве, то перед использованием почву желательно подсушить при 0 — 4 °C, просеять через сито с размером пор 1 — 2 мм, удалив корни, почвенных животных и др., растереть до состояния порошка и определить влажность почвы. Для этого навеску почвы высушивают при 85 — 95 °C в течение суток.

Процедура окрашивания заключается в следующем. Взвешивают навеску почвы, например 1 г, и помещают ее в пробирку. Приливают 9 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 7,2, и встряхивают 5 мин. Для лучшей десорбции клеток очень желательно провести мягкую ультразвуковую обработку суспензии (1—3 мин; 0,4 А, 15 кГц). Исходную почвенную суспензию разводят обычно до 1: 100 0,2 М фосфатным буфером, после чего опять встряхивают в течение 15 мин. Добавляют к 1 мл суспензии 1 мл раствора FITC и окрашивают (инкубируют) 5 мин. Отбирают шприцом 1 мл окрашенного образца и фильтруют через черный поликарбонатный мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фильтр промывают сначала 1 мл 0,5 М карбонатного буфера, а затем 1 мл 5%-го раствора пирофосфата. Избыток жидкости удаляют продуванием с помощью того же шприца 1 — 2 мл воздуха. Черный поликарбонатный мембранный фильтр двумя пинцетами переносят на предметное стекло и немедленно наносят маленькую каплю не флуоресцирующего иммерсионного масла.

Микроскопирование и подсчет клеток проводят с использованием масляной иммерсии при длине волны 400 — 425 нм с соответствующими фильтрами. Бактериальные клетки флуоресцируют зеленым цветом. Обычно проводят подсчет клеток в 20 —30 полях зрения, если количество клеток в каждом поле зрения не менее 30. Приготовленный препарат можно хранить в темноте и сухом месте в течение суток.

Количество клеток в исследуемом образце почвы рассчитывают по формуле М — (N/LК) R]/D_f где М — количество клеток в 1 г почвы; N — используемая площадь поверхности фильтра; L — площадь поля зрения под микроскопом; К — среднее количество клеток в одном поле зрения; R — разведение образца; D — навеска почвы в граммах, в которой производится подсчет. Навеска почвы указывается после пересчета на 1 г абсолютно сухой почвы.