Разделение фракции рДНК на отдельные гены

Такое разделение необходимо для двух последних, наиболее распространенных способов получения фракции генов 16S рРНК и является ключевым для проводимого исследования. Для оценки разнообразия филотипов в сообществе необходимо разделить фракцию генов 16S рРНК на молекулы, идентичные по длине, но различающиеся по первичной структуре, для чего применяются следующие способы.

• • Молекулярное клонирование. Наиболее распространенный традиционный способ разделения ПЦР-амплифицированных генов I6S рРНК — клонирование в клетках Е. coli. Преимущество этого способа состоит в том, что он дает возможность разделить ПЦРамплификаты на какое угодно количество клонов, зависящее только от сложности сообщества. В некоторых исследованиях количество клонов, полученных из суммарной фракции генов 16S рРНК, достигло нескольких тысяч. Однако относительная сложность метода и возможная избирательность генов при клонировании ограничивают его применение.
• • Использование градиентных гель-электрофорезов — температурного (TGGE) и денатурирующего (DGGE). Относительно новым способом разделения ПЦР-амплификатов являются методы элекрофореза в полиакриламидном геле, содержащем денатурирующий градиент. В таком геле ПЦР-амплификаты мигрируют в соответствии с их первичной структурой и нуклеотидным составом. Денатурирующий градиент достигается либо созаднием разницы температур (TGGE), либо добавлением денатурирующих агентов (обычно мочевины и формамида) (DGGE). Для повышения разрешающей способности метода обычно используют ПЦР-амплификаты не полноразмерного гена 16S рРНК, а тех его фрагментов, где сосредоточены наиболее вариабельные участки последовательности. В противоположность сложной технологии молекулярного клонирования этот способ дает быструю оценку разнообразия бактериального сообщества, основанную на получении электрофоретического профиля, где каждая полоса соответствует одному из членов сообщества.

Таким образом, данный способ можно считать идеальным для проведения мониторинга динамики изменений состава природного сообщества: временных, при изменении состава природного сообщества либо при изменении условий (температуры, pH и т. д.), либо при действии различных факторов, например антибиотиков, ионов металлов и т. д.

Вместе с тем метод имеет определенные ограничения: с его помощью достоверно разделяются только гены из сравнительно немногочисленных сообществ, содержащих несколько десятков членов.