Изучение влияния наночастиц диоксида титана на клеточную мембрану методом атомно-силовой спектроскопии

• Введение
• Глава 1. Обзор литературы
• 1.1 Эритроциты
• 1.2 Клеточная мембрана
• 1.3 Наночастицы диоксида титана
• 1.4 Атомно-силовой микроскоп
• Глава 2. Оборудование и материалы
• 2.1. Атомно-силовой микроскоп Solver P47 Bio
• 2.2 Ультразвуковая ванна Сапфир
• 2.3 Центрифуга Minispin
• 2.4 Просвечивающий электронный микроскоп JEM-1400
• Глава 3. Теория
• 3.1 Силовые измерения на АСМ
• Глава 4. Эксперимент
• 4.1 Качественное изучение взаимодействия наночастиц TiO₂ и эритроцитов
• 4.1.1 Приготовление препарата эритроцитов
• 4.1.2 Получение контрольных снимков
• 4.1.3 Характеризация частиц TiO₂
• 4.1.4 Взаимодействие наночастиц с клеточной мембраной
• 4.1.4.1 Действие аморфного TiO₂
• 4.1.4.2 Действие частиц анатаза
• 4.2 Силовые измерения
• Выводы
• Список литературы

Развитие нанотехнологий делает актуальным вопрос о биологической безопасности различных наноматериалов, находящих все более широкое применение. Особый интерес представляет изучение воздействия наночастиц на живую клетку. Известно, что наночастицы размером менее 10 нм способны не только проникать внутрь клетки, но и встраиваться в мембрану [4, 14].

В последнее десятилетие опубликовано значительное количество научных работ, посвященных исследованию цитотоксических свойств различных наночастиц [4, 8, 13, 14]. В абсолютном большинстве этих работ авторы ограничиваются установлением зависимости цитотоксических свойств наночастиц от их размеров и химической природы. Влияние кристаллической структуры наночастиц на их цитотоксические свойства практически не изучено.

Нанопорошки диоксида титана являются одним из наиболее распространенных в настоящее время наноматериалов и находят применение в фотокатализе, производстве пигментов, перспективных технологиях адресной доставки лекарственных средств и во многих других областях.

В данной работе использованы наночастицы диоксида титана в двух кристаллических модификациях — аморфная и анатаз, имеющие одинаковые размеры (1−8 нм). Выбор объясняется доступностью и широкой распространенностью нанопорошков диоксида титана.

Для исследования были выбраны эритроциты человека, как наиболее доступный носитель биологических мембран. Кроме того, мембрана эритроцитов отличается упругостью и высокой (относительно большинства других клеток) устойчивостью к физическим воздействиям. Этот факт позволяет экстраполировать результаты экспериментов по разрушению мембран эритроцитов на другие клетки, предполагая, что в тех условиях, когда повреждения получают эритроциты, более мягкие клетки получат заведомо не меньшие повреждения.

Целью данной работы является проверка гипотезы о зависимости степени воздействия наночастиц на клеточную мембрану от их кристаллической структуры.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Эритроциты.

Эритроциты — красные кровяные тельца, наиболее многочисленная группа форменных элементов крови. Эритроциты млекопитающих — это безъядерные структуры, имеющие форму двояковогнутых дисков. Эта особенность формы эритроцитов отчетливо различима в мазках крови. Она обеспечивает эритроцитам выполнение их основной функции — перенос кислорода и углекислого газа, так как при такой форме поверхность диффузии увеличивается, а расстояние диффузии уменьшается. Кроме того, благодаря своей форме эритроциты обладают большей способностью к обратимой деформации при прохождении через узкие (до 5мкм в диаметре) изогнутые капилляры.

Эритроциты человека около 8 мкм в диаметре, толщиной на периферии около 2 мкм и в центре — около 1,4 мкм (Рис. 1). [2].

Рисунок 1. Размеры эритроцита [2].

У зрелых эритроцитов нет ядра и органелл. Цитоплазма заполнена дыхательным пигментом — гемоглобином, содержание которого в сухом веществе эритроцита выше 95%. Это сложный белок, способный нестойко связываться как с кислородом, так и с углекислым газом, образуя оксигемоглобин и карбоксигемоглобин соответственно. Именно эти свойства гемоглобина обеспечивают основную функцию эритроцитов — газообмен.

Перенося кислород, эритроциты не потребляют его и не расходует на это энергию, так как энергию они получают путем анаэробного гликолиза.

Зрелые эритроциты не способны к синтезу нуклеиновых кислот и гемоглобина. Для них характерен относительно низкий уровень обмена, что обусловливает длительную продолжительность их жизни (приблизительно 120 дней).

Примерно с 60-го дня жизни эритроцит начинает стареть и «изнашивается», при этом его пластичность уменьшается. По мере старения в эритроцитах вначале понижается, а затем нарушается гликолиз, вследствие чего их энергетический потенциал снижается. Одновременно с этим в стареющих эритроцитах нарушается цитоскелет, что приводит к изменению их формы. Из двояковогнутого диска вначале они приобретают строение стоматоцитов (вогнутые с одной стороны и выпуклые с другой), затем — эхиноцитов (шпоровидные эритроциты), сфероцитов и других форм.

Следует отметить, что изучение мазка периферической крови, неоднократно проведенное в данной работе, было и до сих пор остается важной частью гематологического исследования.

1.2 Клеточная мембрана.

Клеточная мембрана (или цитолемма, или плазмалемма, или плазматическая мембрана) представляет собой двойной слой (бислой) молекул класса липидов, большинство из которых представляют собой так называемые сложные липиды —фосфолипиды. Молекулы липидов имеют гидрофильную («головка») и гидрофобную («хвост») часть. При образовании мембран гидрофобные участки молекул оказываются обращены внутрь, а гидрофильные — наружу.

Биологическая мембрана включает и различные белки: интегральные (пронизывающие мембрану насквозь), полуинтегральные (погруженные одним концом во внешний или внутренний липидный слой), поверхностные (расположенные на внешней или прилегающие к внутренней сторонам мембраны) (Рис. 2). Некоторые белки являются точками контакта клеточной мембраны с цитоскелетом внутри клетки, и клеточной стенкой (если она есть) снаружи. Некоторые из интегральных белков выполняют функцию ионных каналов, различных транспортеров и рецепторов.

Рисунок 2. Клеточная мембрана [1].

Плазмолемма эритроцитов отличается упругостью и высокой (относительно многих других клеток) устойчивостью к физическим воздействиям. Она пропускает газы (кислород, углекислый газ), ионы (Na-, K+) и воду.

Плазмолемму пронизывают трансмембранные белки — гликофорины, которые, ответственны примерно за 60% отрицательного заряда на поверхности эритроцитов, необходимого для предотвращения их слипания. Также на плазмолемме эритроцитов имеются Рс-рецепторы к иммуноглобулинам. На них фиксируются комплексы «антиген — антитело». Количество фиксированных иммунных комплексов в физиологических условиях возрастает постепенно, параллельно со старением эритроцитов.

Наличие этих комплексов необходимо для своевременного гемолиза. Сигналом для фагоцитирования макрофагами изношенных эритроцитов является изменение олигосахаридов их мембран и наличие на Рс-рецепторах плазмолеммы эритроцита комплексов «антиген — антитело» [1,3].

В настоящее время большой интерес представляет влияние различных наночастиц на мембрану эритроцита. В частности, в работе было установлено, что при размере наночастиц меньшем 15 нм, происходит их встраивание в клеточную мембрану, а последующий выход из нее создает поры.

В этой же работе установлено, что как адсорбция нанокристаллов корунда, так и адсорбция кварца вызывают изменения рельефа поверхности мембраны и морфологии эритроцита.

1.3 Наночастицы диоксида титана.

Наночастицы TiO2 получают путем гидролиза тетрахлорида титана (TiCl4) и тетраизопропокcида титана (Ti (O-i-C3H7)4) в присутствии кислотного катализатора в виде коллоидных растворов при варьировании температуры гидролиза, pH среды, продолжительности синтеза и модифицирования прекурсора ацетилацетоном. В зависимости от условий синтеза получают TiO2-наночастицы с различной кристаллической модификацией:

— аморыный;

— анатаз;

— брукит;

— рутил;

Все они образуют наноструктуры. Аморфный и анатаз образуют наночастицы в виде гранул (1−8 нм), рутил — в виде иголочек. Все типы наночастиц кроме брукита образуют стабильные золи.

Существуют работы, посвященные использованию частиц TiO2 в медицинских целях, в частности для доставки олигонуклеотидных последовательностей, антисмысловых к нуклеиновым кислотам вирусов.

Также ведуться разработки по снижению цитотоксичности частиц TiO2 за счет модификации их поверхности глицидилизопропиловым эфиром.

1.4 Атомно-силовой микроскоп.

Атомно-силовой микроскоп (АСМ) был изобретён в 1986 году Гердом Биннигом, Кэлвином Куэйтом и Кристофером Гербером. В основе работы АСМ лежит силовое взаимодействие между зондом и поверхностью, для регистрации которого используются специальные зондовые датчики, представляющие собой упругую консоль (кантилевер) с острым зондом на конце (Рис. 3). Сила, действующая на зонд со стороны поверхности, приводит к изгибу консоли. Регистрируя величину изгиба, можно контролировать силу взаимодействия зонда с поверхностью.

Рисунок 3. Схематическое изображение зондового датчика АСМ [6].

Оптическая система регистрации малых изгибов кантилевера (Рис. 4) состоит из полупроводникового лазера, луч которого фокусируется на зеркальной поверхности кантилевера, и разделенного на секции фотоприемника, дифференциальный ток которого усиливается и используется для определения деформации кантилевера.

Рис. 4. Схема оптической регистрации изгиба консоли [5].

В режиме получения топографического изображения исследуемой поверхности зондовый датчик сканирует заданный участок, перемещаясь при помощи прецизионных пьезо-приводов. Кроме получения топографического снимка поверхности, АСМ используется и для силовых измерений. Для того чтобы методом атомно-силовой микроскопии измерить силу взаимодействия между зондом и образцом нужно закрепить образец на жесткой подложке, после чего зонд плавно подводится к поверхности, используя только вертикальный привод. Сразу после касания зонд поднимается обратно до отрыва, при этом фиксируется изгиб кантилевера, значение которого (при известном законе, связывающем силу с отклонением балки) позволяет определить силу взаимодействия между зондом и исследуемой поверхностью (Рис. 5).

Рисунок 5. Схема силового измерения [7].

Глава 2. Оборудование и материалы.

2.1 Атомно-силовой микроскоп Solver P47 Bio.

Атомно-силовой микроскоп Solver P47 Bio (NT-MDT, Россия) смонтирован на инвертированном световом микроскопе.

Основными функциональными устройствами, входящими в состав прибора, являются:

— измерительный блок:

? блок подвода и сканирования;

? измерительная головка;

? сканер;

— инвертированный световой микроскоп;

— виброизолирующий подвес;

— система управления:

? СЗМ контроллер;

? компьютер с интерфейсной платой.

Основной элемент АСМ — измерительная головка (Рис. 6). В ее нижней части находится держатель зондового датчика. Головка укомплектована двумя различными держателями. Один для проведения измерений в жидкой среде, другой для проведения измерений на воздухе (Рис. 7−8). В данной работе измерения проводились как на воздухе, так и в жидкой среде.

Рисунок 6. Измерительная головка АСМ [5].

Рисунок 7. Сменный держатель зондового датчика для работы в жидкости [5].

Рисунок 8. Сменный держатель зондового датчика для работы на воздухе [5].

Сканирующая измерительная головка может работать в качестве выносной измерительной головки. В этом случае образец закрепляется на лабораторном столе и головка устанавливается над образцом или прямо на образец, что позволяет исследовать образцы неограниченных размеров.

В настоящей работе измерительная головка использовалась в совокупности с остальными элементами. Препарат располагался на предметном столике, над ним, опирая ножки в пазы, устанавливалась измерительная головка.

Под предметным столиком расположен окуляр инверсированного светового микроскопа, который необходим для наведения зонда на интересующие участки препарата. Наведение происходит за счет передвижения столика с образцом, путем вращения двух винтов.

Блок подвода находится в нижней части станины. Он осуществляет вертикальные перемещения опоры измерительной головки.

Для увеличения разрешающей способности микроскопа, посредством изоляции от наиболее влияющих на его работу вибраций, был разработан и изготовлен виброизоляционный подвес (рис.6). Он состоит из двух колец резинового шнура, держателя шнура и металлической клетки. Данная система позволила увеличить разрешающую способность микроскопа по вертикали с 2нм до 0,15нм.

Рисунок 9. АСМ Solver P47 Bio на виброизоляционном подвесе.

Рабочий элемент АСМ — зондовый датчик. Зондовым датчиком в соответствующей технической литературе [5, 6] по атомно-силовым микроскопам называется совокупность кремниевого чипа с сформированной на нем посредством химического травления консолью. На конце консоли методами фотолитографии и химическо травления создается, собственно говоря, зонд — пирамидка высотой 14−15 мкм и характерным радиусом острия 10−50 нм.

Характеристики зондовых датчиков, использованных в работе, по данным компании-производителя NT-MDT указаны в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристики зондовых датчиков.

Существуют также зондовые датчики с треугольным кантилевером, образованным двумя балками, но в настоящем исследовании они не использовались.

2.2 Ультразвуковая ванна Сапфир.

Объем 0,5 литра, на который выделяется мощность 60 Вт.

В работе для приготовления суспензии наночастиц их крупные агрегаты разбивались в ультразвуковой ванне.

Ультразвук обычно значительно ускоряет физико-химические процессы в жидкостях, в основном за счет кавитации — процесса парообразования и последующей конденсации пузырьков воздуха в потоке жидкости, сопровождающийся шумом и гидравлическими ударами.

2.3 Центрифуга Minispin.

Центрифуга на 12 пробирок объемом 1,5 мл. Рабочие обороты 800 — 13 400 об/мин. Была использована при 1200 об/мин, тем самым подвергая образец перегрузке в 300g.

2.4 Просвечивающий электронный микроскоп JEM-1400.

Данный микроскоп произведен японской фирмы Jeol (Рис. 10) и в первую очередь предназначен для измерения биологических объектов, что обусловлено его низким (80 кВ) ускоряющим напряжением относительно других ПЭМов.

В ПЭМ изображение от ультратонкого образца (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране, фотоплёнке или сенсорном приборе с зарядовой связью (ПЗС-матрице). Данный микроскоп позволяет выполнять фиксацию изображения всеми тремя способами.

Рисунок 10. ПЭМ JEM 1400.

Глава 3. Теория.

3.1 Силовое измерения на АСМ.

Кантилевер — это датчик силового взаимодействия. Любую информацию о поверхности микроскоп получает благодаря механическим отклонениям балки кантилевера, которые регистрируются оптической системой. Обычно кантилевер представляет собой балку в виде прямоугольного параллелепипеда (Рис. 11) или в виде двух балок, соединенных под некоторым углом, с зондом (острием) на одном из ее концов. Далее подробно рассмотрим используемый в нашей работе прямоугольный кантилевер. С поверхностью взаимодействует острие зонда. Считаем, что именно к его вершине приложена сосредоточенная сила, действующая со стороны исследуемого образца.

Рис. 11. Геометрия кантилевера.

Сила, действующая на зонд, зачастую имеет не только вертикальную составляющую, но и компоненты, лежащие в горизонтальной плоскости. Поэтому острие кантилевера может отклоняться не только вдоль оси, но в двух других направлениях. Вертикальную составляющую Fz назовем нормальной силой, поперечную Fx и продольную Fy — латеральными силами.

Так как в АСМ о силе воздействия образца на кантилевер судят по деформации последнего, то для определения силы, необходимо знать жесткость деформаций кантилевера в различных направлениях. Считаем, что вектор отклонения острия кантилевера (имеющий компоненты Дx, Дy, Дz) связан с приложенной к зонду силой линейно, т. е. по закону Гука:

(1).

Коэффициентом пропорциональности служит тензор второго ранга, который назовем тензором обратной жесткости. Эта величина содержит всю информацию об упругих свойствах кантилевера. Чтобы найти компоненты тензора C, необходимо решить задачи о статических деформациях кантилевера под действием сил, направленных по разным осям. Для наглядности запишем формулу (1) в матричном виде:

(2).

При силовых измерениях главный интерес представляет деформация кантилевера под действием вертикальной силы. Определим величину и направление этой деформации. Решение этой задачи позволит найти последний столбец тензора С:

(3).

(4).

(5).

Деформация вертикального изгиба показана на Рис. 12:

Выделим из балки двумя поперечными сечениями элемент длиной и рассмотрим его деформацию (Рис. 14). Так как этот элемент изогнут, то материал на внешней стороне изгиба растянут, а на внутренней стороне сжат. Но имеется нейтральная поверхность, которая и не сжата и не растянута.

Рис. 12. Вертикальная деформация.

Для упрощения вычислений будем считать, что поперечные сечения балки остаются плоскими и нормальными к её деформированной оси (прямой чистый изгиб балки постоянного сечения).

Рис. 13. Поперечное сечение.

Рис. 14. Маленький отрезок внутри изогнутой балки.

Для чистого изгиба нейтральная поверхность проходит через центр тяжести поперечного сечения, т. е. в нашем случае продольная ось симметрии параллелепипеда принадлежит нейтральной поверхности. Продольное удлинение материала ДL пропорционально расстоянию z от нейтральной поверхности:

Таким образом, по закону Гука сила, действующая на единичную площадь в некоторой маленькой полоске площадью dS вблизи z, равна.

.

где E — модуль Юнга, R— радиус кривизны балки. Если рассмотреть любое поперечное сечение, то действующие на нём силы направлены в одну сторону выше нейтральной поверхности и в другую — ниже её. Получается пара сил, которая создаёт изгибающий момент Mz, под которым понимают момент сил относительно нейтральной линии:

(6).

Величину называют осевым моментом инерции сечения балки относительно оси, проходящей через его центр масс. Для балки с прямоугольным поперечным сечением:

(7).

Обозначим отклонение в z-направлении точки балки на расстоянии y от закреплённого конца через u (y). Кривизна кривой u (y) при малых изгибах задаётся выражением. Тогда изгибающий момент сил Mz можно выразить следующим образом:

(8).

С другой стороны, M_z является моментом сил относительно точки y, обусловленным действием силы F_z и собственным весом балки. Таким образом, получаем уравнение:

(9).

Интегрируя его с учетом граничных условий и, получаем решение:

(10).

Отклонение конца балки Дz (Рис. 12):

(11).

Второе слагаемое — это прогиб под действием собственного веса. Для типичного кантилевера он составляет доли ангстрем и может быть опущен на фоне первого члена, который в АСМ-экспериментах в сотни раз больше. Зависимость (11) есть не что иное, как соотношение (5), в котором надо положить:

(12).

Коэффициент обратной жесткости является наибольшим среди остальных компонент тензора. В формуле (12) для этого параметра введено специальное обозначение c без индексов. Именно величина = c указывается в качестве жесткости в характеристиках кантилевера, являясь одним из его важнейших параметров. Для кантилевера с прямоугольным поперечным сечением можно переписать:

(13).

Из-за того что с является наибольшей компонентой тензора С, при силовых измерениях (кроме измерений латеральных сил) можно использовать закон Гука в простой форме:

(14).

Где — «силовая постоянная кантилевера» — обозначение, принятое в атомно-силовой микроскопии. Законом Гука в таком виде мы будем пользоваться в дальнейшем.

Для силовых измерений прямым способом в данной работе использованы контактные зонды марки HA_NC с золотым покрытием, из-за малой толщины (10−20 нм) слой золота не влияет на упругие свойства кантилевера.

Результатом силового измерения с помощью атомно-силового микроскопа являются силовые кривые, представляющие собой зависимость дифференциального тока фотоприемника (разность уровней сигнала от верхней и нижней долей приемника) от смещения основания зонда по высоте. Типичная силовая кривая, характерная для специфического взаимодействия, приведена на рис. 15.

Рис. 15. Силовые кривые: красная - подвод зонда к подложке, синяя - отрыв зонда, черная - идеализация, выделенная область соответствует отрыву зонда от поверхности и служит для определения значения силы специфического взаимодействия.

Правый горизонтальный участок соответствует подводу зонда до касания с поверхностью образца, левый горизонтальный участок не несет физического смысла и объясняется принудительным ограничением движения сканера, которое вводится для предохранения зонда от поломки при чрезмерной контактной силе. Наклонный участок кривой соответствует деформации кантилевера при уменьшении расстояния от его основания до подложки после касания ее зондом. Отличие (незначительное) его от прямой линии объясняется наличием некоторой нелинейности и дрейфа параметров в системе регистрации. Наклонный участок кривой принимаем за прямую линию и находим соответствие значения дифференциального тока деформации кантилевера. Например, для приведенной на Рис. 15 кривой получается соотношение 21.6 нА/мкм. Зная соответствие между значением дифференциального тока фотоприемника и деформацией кантилевера, находим изгиб кантилевера, соответствующий отрыву зонда от поверхности (участок, выделенный прямоугольником на рис. 15, рис. 16), подставив его значение в закон Гука (14), зная силовую постоянную кантилевера, находим значение силы специфического взаимодействия.

Рис. 16. Фрагмент силовой кривой, соответствующий отрыву зонда от поверхности.

наночастица титан мембрана эритроцит.

Глава 4. Эксперимент.

4.1 Качественное изучение взаимодействия наночастиц TiO₂ и эритроцитов.

4.1.1 Приготовление препарата эритроцитов.

В работе использовались эритроциты свежей периферической крови автора (здоровый мужчина, 20 лет, кровь забирали через прокол кожи на пальце руки). Каплю (50 мкл) крови помещали в пробирку с 1 мл фосфатно-солевого буфера (pH 7,4, производства кампании Биолот) и центрифугировали при ускорении 300 g в течение 1,5 минут, после чего сыворотку удаляли и заполняли пробирку чистым буферным раствором, взбалтывая при этом осевшие эритроциты.

После трехкратного центрифугирования осевшие эритроциты собирали пипеткой.

На предметное стекло капали 10 мкл полученной суспензии эритроцитов и размазывали по нему другим стеклом, для получения монослоя клеток.

4.1.2 Получение контрольных снимков.

Для того, чтобы выявить изменения, возникающие на поверхности эритроцитов под действием наночастиц, была накоплена база снимков нативных эритроцитов (Рис. 16, 17).

В результате установлено, что при данном способе подготовки препарата на поверхности эритроцитов наблюдаются неровности, высота которых не превосходит 10 нм.

4.1.3 Характеризация частиц TiO₂.

В данном исследовании были использованы наночастицы диоксида титана в двух кристаллических модификациях — аморфный и анатаз. Наночастицы были синтезированы в лаборатории экологического катализа ИК СО РАН Шикиной Надеждой Васильевной и Бессудновой Еленой Владимировной.

Рисунок 16. АСМ изображение мазка эритроцитов.

Рисунок 17. АСМ изображение мембраны эритроцита Для определения размера частиц были изготовлены их суспензии в дистиллированной воде. Для наилучшего разбиения крупных агрегатов на отдельные частицы была использована ультразвуковая ванна Сапфир.

Путем последовательных разбавлений, в суспензии была достигнута концентрация 0,1 мг/мл.

Как в случае частиц анатаза, так и в случае наночастиц с аморфной кристаллической структурой, капля суспензии наносилась на свежий скол слюды. После этого по истечении 30 секунд капля сдувалась атмосферным воздухом.

На АСМ снимках частицы видны как острые пики, т.к. их размер в разы меньше характерного размера острия зонда (Рис. 18, 19). Это приводит к тому, что взаимодействие наночастицы с различными участками зонда интерпретируется электроникой как взаимодействие вершины зонда с одним большим объектом, однако, разрешение АСМ по вертикали при этом ~1нм, поэтому найдя самую высокую точку в каждом пике можно определить размер частицы.

Рисунок 18. АСМ снимок препарата частиц анатаза Рисунок 19. АСМ снимок препарата наночастиц в аморфной кристаллической модификации.

В результате измерений было установлено, что размеры как частиц TiO2 с аморфной кристаллической модификацией, так и частиц анатаза лежат в диапазоне 1 ё 8 нм. Причем размер меньше 6 нм имеют более 90% частиц аморфного TiO2 и более 85% частиц анатаза.

Этот факт говорит о том, что при сравнении результатов взаимодействия различных наночастиц с мембраной клетки, можно будет установить наличие или отсутствие влияния кристаллической структуры наночастиц на их способность взаимодействовать с клеточной мембраной.

4.1.4 Взаимодействие наночастиц с клеточной мембраной.

Для изучения взаимодействия наночастиц с клеточной мембраной были изготовлены суспензии наночастиц в буферном растворе. В суспензии помещался концентрат отмытых эритроцитов, полученный по вышеуказанной методике в объемном соотношении 1:10, и выдержавался в течении 5 минут, после чего эритроциты отмывались центрифугированием в буфере. Затем, аналогично препаратам контроля, были сделаны мазки на предметном стекле.

4.1.4.1 Действие аморфного TiO₂.

Под действием частиц аморфного TiO2 в мембране эритроцитов возникали различные повреждения. Их можно разделить на три типа: точечные, обширные эрозивные коньенообразные повреждения мембраны и трещины.

Точечные повреждения — отверстия в мембране глубиной от 15 до 35 нм, и шириной от 200 до 300нм соответственно (Рис. 19, 20). Возникают в результате встраивания частицы в липидный бислой мембраны и последующего выхода из нее.

Также наблюдались коньенообразные изменения мембраны шириной от 100 до 800 нм и относительно малой глубины — 2−5 нм (Рис. 16).

Рисунок 19. Точечные повреждения мембраны эритроцита под воздействием частиц TiO₂ с аморфной кристаллической структурой.

Рисунок 20. Точечные повреждения мембраны эритроцита под воздействием частиц TiO₂ с аморфной кристаллической структурой. 2D изображение и его профиль вдоль указанного отрезка.

Трещины имеют глубину меньшую, чем каньенообразные повреждения — 1−2 нм и существенно меньшую ширину — 50−100 нм (рис. 17).

4.1.4.2 Действие частиц анатаза.

В результате воздействия на эритроциты частицами анатаза возникают только кратерообразные повреждениям мембран диаметром 150−250 нм и глубиной 10−15 нм при сохранении окружающих областей поверхности клетки (Рис. 23,24). Данный рельеф повреждения обусловлен тем, что фрагмент мембраны отрывается, уходит вглубь клетки, при этом сжимаясь, наподобие резины.

Рисунок 21. Повреждения мембраны эритроцита под воздействием частиц TiO₂ с аморфной кристаллической структурой. Точечные и обширные эрозивные.

Рисунок 22. Трещины на мембране эритроцита под воздействием частиц TiO₂ с аморфной кристаллической структурой.

Рисунок 23. Снимок эритроцита, обработанного частицами анатаза.

Рисунок 24. Кратерообразное повреждение и его профиль.

4.2 Силовые измерения.

Каплю суспензии, эритроцитов полученную описанным выше методом, наносили на порытое полилизином стекло (Thermo, Германия), инкубировали в течение 5 минут и смывали буферным раствором. Заполненную буферным раствором чашку Петри с закрепленным на дне стеклом помещали в держатель АСМ, наводили кантилевер на эритроциты при помощи инвертированного светового микроскопа (Биолам П2−1, ЛОМО, Россия), на платформе которого установлена измерительная головка АСМ, и осуществляли силовые измерения (получение силовых кривых).

Рисунок 25. Эритроцит на предметном стекле.

Для измерений локальной упругости поверхности эритроцитов использовали АСМ-зонды ETALON (NT-MDT, Россия) с силовой постоянной 3,5±0,7 Н/м. Для того чтобы избежать разрушения мембраны при контакте с излишне острым зондом, зонды модифицировали (создавали контактную площадку) методом многократного сканирования свежего скола слюды в контактном режиме. Результаты модификации контролировали методом ПЭМ-визуализации. Для измерений использовали зонды, имеющие контактную площадку диаметром 200 нм.

Рисунок 26. Зонд до и после модификации.

Были получены массивы силовых кривых для нативных эритроцитов (контроль) и для эритроцитов, обработанных наночастицами диоксида титана в двух кристаллических модификациях (аморфная и анатаз). Статистически значимых отличий в наклоне силовых кривых выявлено не было.

Рисунок 27. Типичная силовая кривая для поверхности эритроцита (изгиб соответствует области деформации клетки).

Рисунок 28. Контрольная силовая кривая (твердая поверхность).

Выводы.

Результаты, полученные при изучении методом АСМ мазков эритроцитов свидетельствуют о том, что повреждения мембран, возникающие под действием наночастиц диоксида титана значимо отличаются для наночастиц в форме анатаза и аморфной, имеющих одинаковый размер. Характерными формами повреждений являются точечные (круглые отверстия малого диаметра) и эрозивные — длинные и узкие трещины.

Методом атомно-силовой спектроскопии не удалось выявить изменения локальных механических свойств поверхности эритроцитов, обработанных наночастицами, в сравнении с нативными. Данный результат свидетельствует о том, что изменения, происходящие с эритроцитами под действием наночастиц, не затрагивают цитоскелет и не приводят к значимым изменениям механических свойств клетки в целом.

Проблема зависимости цитотоксических свойств наночастиц от их кристаллической структуры нуждается в дальнейшем исследовании с использованием более широкого набора модельных объектов.

1. J.C. Fernandes, P. Eaton, H. Nascimento, L. Belo, S. Rocha, R. Vitorino, F. Amado, J. Gomes, A. Santos-Silva, M. E. Pintado, F. X. Malcata, Effects of Chitooligosaccharides on Human Red Blood Cell Morphology and Membrane Protein Structure // Biomacromolecules 2008, 9, 3346−3352.

2. Г. Бранков, Основы биомеханики — «МИР», М. 1981.

3. Д. Парсон Биологические мембраны. Двенадцать очерков о структуре, свойствах и функциях мембран — М.: Атомиздат, 1978.

4. П. В. Мокрушников, Л. Е. Панин, Б. Н. Зайцев, Н. С. Доронин, А. И. Козельская, А. В. Панин, Взаимодействие нанокристаллов корунда и кварца с мембранами эритроцитов // 2012 г.

5. ЗАО «Нанотехнология-МДТ», Сканирующий зондовый микроскоп Solver PRO. Руководство пользователя.

6. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии — Нижний Новгород 2004.

7. H.J. Butt, B. Cappella, Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications // Surface Science Reports 59 (2005) 1−152.

8. Шикина Н. В., Бессуднова Е. В., Рябчикова Е. И. Создание и исследование нанокомпозитов на основе наночастиц диоксида титана, содержащих фрагменты ДНК // Нанотехника № 2 2012.

9. E. Oberdoster, S. Zhu, Toxicology of Carbon Nanomaterials 44, 1112 (2006).

10. D. Bedrov, G.D. Smith, J. Phys. Chem. B. 112, 2078 (2008).

11. J. Wong-Ekkabut, S. Baoukina, W. Triampo, Nat. Nano. 3, 363 (2008).

12. А. Dhawan, J. Taurozzi, Environ Sci. Technol. 40, 7394 (2006).

13. B.M. Rothen-Rutishauser, S. Schurch, B. Haenni, N. Kapp, P. Gehr, Interaction of Fine Particles and Nanoparticles with Red Blood Cells Visualized with Advanced Microscopic Techniques // Environ. Sci. Technol. 2006, 40, 4353−4359.

14. A.-P. Zhang, Y.-P. Sun, Photocatalytic killing effect of TiO₂ nanoparticles on Ls-174-t human colon carcinoma cells // World J Gastroenterol 2004 November 1;10(21), pp. 3191−3193.

15. Фейнман Р., Лейтон Р., Сэндс М. Фейнмановские лекции по физике, 7 часть. — М.: Изд. МИР, 1966. — 292 с.