Практикум. 
Микробиология: теория и практика

Вопросы и задания для самоконтроля.

• 1. Почему термин «микроорганизм» не имеет таксономического смысла?
• 2. Сравните между собой имеющиеся классификации микроорганизмов.
• 3. К каким доменам относятся представители мира микробов?
• 4. Сравните группы эукариотических микроорганизмов по морфологии и метаболическим возможностям.
• 5. Чем археи отличаются от бактерий?

Семинар 1.

Основные филогенетические группы организмов: археи, бактерии Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных по ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Лабораторная работа 1.

Выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов.

Цель работы, после выполнения работы студенты будут знать принципы выделения чистых культур микроорганизмов и смогут определить их систематическое положение.

1.1. Выделение чистых культур микроорганизмов и проверка их на чистоту.

Для выделения чистых культур микроорганизмов из накопительных обычно используют метод Коха. Принцип его заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии, являющейся потомством одной клетки. Выделение чистых культур аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов проводят, рассевая накопительную культуру на поверхность агаризованной питательной среды методом «истощающего штриха» (рис. 10.3) либо растирая каплю суспензии стерильным стеклянным шпателем Дригальского.

Рис. 103. Посев по методу «истощающего штриха»:

1…4 — этапы последовательного нанесения линий для получения отдельных колоний В зависимости от свойств накопительных культур микроорганизмов для получения отдельных колоний используют разные среды. Например, для рассева споровых аэробных, денитрифицирующих и углеводородокисляющих бактерий применяют БСА, для аммонифицирующих — МПА, для уробактерий — МПА с 2% мочевины, для метилотрофов — агаризованную среду с метанолом, для азотфиксаторов — агаризованную среду Эшби и т. д. Чашки с посевами крышками вниз помещают в термостат (30°С) на 4—6 сут. По окончании инкубации изолированные колонии микроорганизмов описывают (табл. 10.1) и микроскопируют. Затем из выбранных колоний с помощью петли делают посев прямым штрихом на соответствующие скошенные агаризованные среды. Посевы помещают в термостат (30°С) на 3—5 сут. После инкубации проверяют чистоту выделенных культур визуально (рост должен быть однородным по всему штриху) и микроскопированием (чистые культуры многих бактерий должны быть морфологически однородны, допустимо лишь некоторое варьирование размеров клеток). Необходимо также провести рассев на соответствующую твердую среду в чашки Петри. Однородность колоний и совпадение их признаков с описанными ранее является свидетельством чистоты культуры. Однако следует учитывать, что некоторые виды бактерий могут образовывать колонии разной морфологии в результате процесса диссоциации.

Таблица 10.1

Свойства идентифицируемого микроорганизма

Для получения чистых культур облигатных анаэробов (гомоацетогенов и метаногенов) используют рассев накопительной культуры на поверхность или в толщу агаризованной минеральной среды того же состава (с 1,5—2% агара). Стерильную анаэробную агаризованную среду в плотно укупоренных сосудах расплавляют, остужают до 45 °C и стерильным шприцем вносят аликвоту культуральной жидкости из накопительной культуры с соблюдением условий анаэробиоза. После тщательного перемешивания содержимого сосуда его либо оставляют в горизонтальном положении для застывания, либо раскатывают сосуд рукой по ровной поверхности до затвердевания агара по стенкам в виде тонкого слоя. В обоих случаях добиваются получения максимальной поверхности агаризованной среды. Допустим рассев накопительной культуры на поверхноеть твердой среды в чашках Петри петлей или шпателем при работе в анаэробном боксе и последующей инкубации посевов в анаэростате. Для гомоацетогенов мел в агаризованной среде может служить индикатором образования ацетата (зоны просветления вокруг колоний). Культивирование ведут при 20—30°С (для гомоацетогенов) или при 30—37°С (для метаногенов) до появления отдельных колоний. При использовании в качестве субстрата молекулярного водорода очистку культуры проводят либо в тонком слое агаризованной среды, либо методом предельных разведений в жидкой среде при перемешивании. Чистоту выделенных культур оценивают по однородности полученных колоний и микроскопической картины, а также путем рассева на твердые среды в анаэробных условиях (в анаэробном боксе). Материал берут из отдельной колонии с помощью микробиологической иглы или петли и осуществляют поверхностный посев на среду в чашках Петри. При глубинном посеве в толщу расплавленной агаризованной среды стерильным шприцем вносят суспензию клеток из отдельной колонии, приготовленную в стерильном анаэробном физрастворе. Через 2 пассажа выделенную культуру проверяют на чистоту на богатых средах, содержащих 0,1% дрожжевого или солодового экстракта и пептона. Свидетельством чистоты культуры является однородность выросших колоний и совпадение их признаков с описанными в литературе. Для выделения Methanosaeta-подобных метаногенов, которые практически нс растут на твердых средах, применяют метод предельных разведений в жидкой среде с ацетатом в качестве субстрата.

1.2. Идентификация выделенных чистых культур.

Необходимые материалы и оборудование: световой микроскоп, иммерсионное масло, необходимые красители и реактивы, предметные и покровные стекла, газовые горелки, микробиологические петли и иглы, тест-культуры Micrococcus luteus, Escherichia coli и Mycobacterium Jlavescens; пробирки со средой с глюкозой и индикатором, чашки с агаризованными средами с молоком и крахмалом, пробирки со столбиками желатины, которые готовит лаборант.

В процессе выполнения данной лабораторной работы студенты изучают принципы постановки тестов, необходимых для описания микробного штамма и идентификации его до уровня рода. Для изучения размеров, морфологии клеток, их подвижности и взаимного расположения готовят и микроскопируют препарат «раздавленная капля» и фиксированный окрашенный фуксином препарат. Результаты вносят в табл. 10.1. Наличие эндоспор в клетках и тип спорообразования определяют путем простого или дифференциального окрашивания (см. т. 1, подпараграф 2.2.4). Для окрашивания по Граму на обезжиренном предметном стекле в каплях воды делают мазки трех микроорганизмов: в центре готовят мазок клеток исследуемой бактерии, а слева и справа — контрольных бактерий, заведомо грамположительной, например, Micrococcus luteus, и заведомо грамотрицательной, например, Escherichia coli. Приготавливают тонкие и негустые мазки, с равномерно распределенными клетками. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1—2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и мазки обрабатывают 1—2 мин раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,5—1,0 мин 96%-м этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1—2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют синефиолетовый, а грамотрицательные — розово-красный цвет. Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если мазок получился слишком толстым и густым, и обесцвечивание спиртом не произошло до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Для сравнения и в качестве экспресс-определения можно использовать ускоренный тест для определения грампринадлежности культуры. Для этого исследуемую культуру бактерий с помощью петли переносят с твердой среды на предметное стекло в каплю 3%-го раствора КОН и тщательно перемешивают круговыми движениями зеркальцем петли. Через 10 с петлю поднимают над каплей. Для грамотрицательных бактерий характерно образование слизи ДНК, которая тянется за петлей на 0,5—1,0 см. Образование слизи происходит в результате разрушения клеточных стенок грамотрицательных бактерий и выхода из них нуклеиновых кислот. Если образование слизи не наблюдается, то бактерии относят к грамположительным.

Для окрашивания на кислотоустойчивость на обезжиренном предметном стекле в каплях воды готовят два мазка: исследуемой бактерии и заведомо кислотоустойчивых микобактерий (Mycobacterium flavescens). Препараты высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препараты карболовым фуксином Циля и 2—3 раза подогревают их до появления паров, держа предметное стекло с помощью пинцета высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. Дают препаратам остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазки промывают водой. Затем клетки обесцвечивают 5%-м раствором H₂S0₄. Для этого предметное стекло погружают 2—3 раза в стакан с серной кислотой, не задерживая его в ней. Важно, чтобы все имеющиеся на предметном стекле мазки погружались в кислоту. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3—5 мин метиленовым синим (по Леффлеру). Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании кислотоустойчивые клетки имеют красный цвет, а некислотоустойчивые — синий.

Для демонстрации физиолого-биохимических тестов в лабораторной работе выбраны наиболее часто используемые и наглядные, однако для идентификации микроорганизма из конкретной группы могут быть рекомендованы и другие, более специфические тесты. Для определения способности культуры использовать для роста глюкозу применяют жидкую или агаризованную (с 1,5% агара) среду с индикатором, содержащую (г/л): пептон — 5,0; К₂НР0₄ — 1,0; глюкозу — 10,0; бромтимолблау — 2 мл (1,6%- го спиртового раствора), воду дистиллированную, разлитую в пробирки по 8—10 мл. В пробирки с жидкой средой перед стерилизацией помещают заполненные той же средой поплавки (вверх дном). Культуру вносят стерильной петлей в жидкую среду, либо стерильной иглой вертикальным уколом до дна — в столбики агаризованной среды в узких пробирках. Продолжительность культивирования 7 сут. в термостате на 30 °C. Рост микроорганизмов или его отсутствие определяют по помутнению среды, росту по уколу, образованию пленки или осадка. Изменение цвета индикатора (бромтимолблау) указывает на образование кислых (пожелтение среды) или щелочных (посинение среды) продуктов метаболизма. Об образовании газа свидетельствует накопление его в поплавке (в жидкой среде) или разрывы и даже поднятие столбика агара (в твердой среде). В качестве контроля используют стерильную незасеянную среду.

Для определения протеолитической активности в качестве субстратов используют такие белки, как желатина и казеин. В первом случае производят посев уколом микробиологической иглой вертикально до дна в толще столбика мясо-пептонной желатины (МПЖ), состоящей из МПБ с 10—15% желатины. Через 7—10 сут. инкубации при комнатной температуре отмечают наличие или отсутствие разжижения желатины.

Для выяснения способности микроорганизмов разлагать казеин проводят высев культуры на «молочный агар» (стерильное обезжиренное молоко и 3%-й водный агар в равных объемах) в чашках Петри. Микроорганизмы сеют прямыми штрихами с помощью петли, чашки инкубируют в термостате при 30 °C 7 сут. Гидролиз казеина обнаруживают по зоне просветления среды вокруг выросшего штриха культуры микроорганизмов. Усилить контраст между зоной гидролиза и средой с нетронутым молоком можно, добавив на агар 5%-й раствор трихлоруксусной кислоты. Величина зоны просветления (в мм), измеренная от края штриха культуры, характеризует казеинолитическую активность микроорганизмов.

Для определения амилолитической активности культуру сеют петлей прямым штрихом на поверхность агаризованной среды с крахмалом в чашках Петри. Среда содержит (г/л): пептон — 10,0; КН₂Р0₄ — 5,0; растворимый крахмал — 2,0; агар — 15,0; pH = 6,8—7,0. Микроорганизмы культивируют 7 сут. в термостате при 30 °C. Гидролиз крахмала обнаруживают, заливая поверхность среды с выросшими бактериями 3—5 мл раствора Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Величина зоны гидролиза крахмала (в мм), измеренная от края штриха до границы светлой зоны, характеризует амилолитическую активность культуры.

Для выполнения теста на каталазу биомассу с помощью петли переносят на сухое предметное стекло и сверху наносят каплю 3%-й перекиси водорода. О наличии каталазы свидетельствует образование пузырьков газа, наблюдаемое через 1—5 мин после соприкосновения бактерий с перекисью невооруженным глазом или с помощью микроскопа при малом увеличении. Можно нанести несколько капель перекиси водорода непосредственно на колонию или штрих культуры, выросшей на скошенном агаре, и наблюдать выделение молекулярного кислорода.

Для проведения теста на оксидазу несколько капель 1%-го свежеприготовленного раствора солянокислого тетраметил-и-фенилендиамина наносят на отрезок фильтровальной бумаги. Клетки суточной культуры микроорганизма распределяют петлей по поверхности этого влажного отрезка бумаги. При положительной реакции через 10—20 с развивается фиолетовая или пурпурная окраска. Можно также воспользоваться готовыми тестовыми полосками.

Результаты всех тестов вносят в табл. 10.1 и используют при работе с определителем.