Покоящиеся формы микроорганизмов

Некоторые прокариотические организмы в ответ на изменение внешних условий способны переходить в стадию покоя. Среди прокариот распространены такие покоящиеся формы, как эндоспоры и цисты.

Формирование эндоспор характерно для представителей нескольких родов грамположительных бактерий (Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Thermoactinomyces), которые имеют толстую клеточную стенку грамположительного типа, что, вероятно, необходимо для спорообразования. Эндоспоры чрезвычайно устойчивы к исчерпанию питательных веществ, нагреванию, облучению, действию химических соединений и высушиванию. В природе образование спор помогает клеткам избегать гибели при истощении субстрата или высушивании, воздействии радиации или химических веществ. Известны факты о сохранении жизнеспособности эндоспор Bacillus anthracis (бацилл сибирской язвы) в течение 500 лет и спор термоактиномицетов — до 7500 лет. Удалось прорастить даже эндоспоры Bacillus cereus из кишечника древней пчелы из куска янтаря, возраст которого 25—30 млн лет.

Борьба со спорами играет важную роль в пищевой, медицинской и промышленной микробиологии, поскольку многие спорообразующие бактерии являются возбудителями опасных заболеваний. Некоторые споры выдерживают кипячение в течение часа и более, поэтому для стерилизации растворов и инструмента применяют более жесткие и длительные способы воздействия антимикробных факторов (например, автоклавирование с температурой стерилизации 12ГС и длительностью 1,5—3 ч). Спорообразование привлекает внимание исследователей и с фундаментальной точки зрения как простая одноклеточная модель клеточной дифференциации.

Обычно в клетке образуется одна эндоспора, однако, известны случаи формирования до 5 спор в одной бактериальной клетке. Эндоспоры хорошо просматриваются в клетках при помощи светового или электронного микроскопов. Непроницаемые для многих видов красителей, они наблюдаются как неокрашенные тельца на фоне прокрашенного остального содержимого клетки. Существуют и специальные методы дифференциальной окраски спор, позволяющие отчетливо различить в световой микроскоп окрашенную в синий цвет спору на фоне окрашенной в розовый цвет цитоплазмы. В материнских клетках (или спорангиях) споры различной формы (круглой или овальной) могут располагаться по-разному (центрально, терминально, субтерминально). Иногда образовавшаяся спора столь велика, что расширяет спорангий в середине или с одного конца. Различают три основных типа спорообразования: бациллярный, клостридиальный и плектридиальный (рис. 4.8).

Рис. 4.8. Типы спорообразования у микроорганизмов.

Этот признак часто используют при идентификации спорообразующих культур микроорганизмов. В активно спорующейся культуре почти все клетки образуют споры.

Споры имеют гладкую или шероховатую поверхность, бывают круглой или овальной формы. Электронно-микроскопические исследования показали, что структура эндоспор довольно сложна (рис. 4.9).

Рис. 4.9. Схема строения эндоспоры.

Снаружи спора покрыта тонким экзоснориумом. За ним (по направлению к центру споры) лежит многослойная толстая белковая оболочка споры, практически не проницаемая для химических веществ. Из-за этого эндоспоры обладают существенной устойчивостью к дезинфектантам. Интересно, что энтеротоксин, образуемый Clostridium perfringens только при спорообразовании, серологически близок белкам оболочки споры. За белковой оболочкой располагается кортекс, состоящий из пептидогликана, более рыхлого, чем в вегетативной клетке. Он может занимать до половины объема споры. Под кортексом лежит стенка ядра споры, окружающая протопласт (ядро споры). Ядро споры содержит нуклеоид, рибосомы и необходимые для начала роста вещества, запасенные в стабильной форме. Нестойкие и легко восполняемые компоненты в ядре споры отсутствуют (табл. 4.2).

Таблица 4.2

Уровень метаболитов в зрелых спорах и растущих клетках Bacillus megaterium

Так, ядро споры включает хромосому и небольшие количества каждого компонента белоксинтезирующего механизма: рибосомы, тРНК, ферменты и сопутствующие белки. Два нестабильных компонента клеток, иРНК и нуклеозидтрифосфаты, отсутствуют, однако, есть запас более стабильных предшественников АТФ — АДФ и АМФ. Аминокислоты и ферменты их биосинтеза при прорастании споры легко восполняются путем гидролиза небольших запасных белков, составляющих до 20% от общего белка споры. Эти же запасные белки имеют дополнительную функцию связывания споровой ДНК, поддерживая ее конформацию и повышая, таким образом, ее устойчивость к облучению. Энергия для восполнения отсутствующих компонентов может быть получена из стабильного 3-фосфоглицерата путем его конверсии в источник энергии и фосфата — фосфоенолпируват.

Высокую устойчивость эндоспор объясняют несколькими причинами. За счет снижения содержания воды в протопласте существенно замедляются все метаболические процессы. В дегидратации принимает участие кортекс, который осмотически вытягивает воду из протопласта. Этот процесс требует затрат значительного количества энергии. Показано, что действие пенициллина, нарушающее структуру кортекса, снижает степень обезвоживания протопласта споры. Считают, что в терморезистентпости спор главную роль играет кальциевая соль дипиколиновой кислоты (рис. 4.10), содержание которой в спорах может достигать 15%.

Рис. 4.10. Дипиколиновая кислота.

Вегетативные клетки практически не содержат Са²⁺, и его активный транспорт начинается с началом спорообразования. Дипиколиновая кислота образуется в спорангии из диаминопиколиновой кислоты — предшественника пептидогликана. Са-дипиколинат локализован в ядре зрелой споры и может принимать участие в стабилизации споровых нуклеиновых кислот. Однако мутанты В. megaterium, споры которых не содержали дипиколиновой кислоты, также были термоустойчивы. В спорах обнаружены также небольшие кислоторастворимые белки, связывающие ДНК. Они окружают ДНК споры и защищают ее от повреждающих воздействий. Эти белки образуются из ферментов вегетативной клетки в результате ограниченного протеолиза, становясь при этом термостабильными. Другие специфические ферменты, синтез которых индуцируется при споруляции, также термоустойчивы. Таким образом, высокая устойчивость спор зависит, по-видимому, от нескольких факторов: стабилизации ДНК Са-дипиколинатом и кислоторастворимыми белками, дегидратации протопласта и др.

Сиоруляция (образование эндоспоры) происходит в несколько стадий (рис. 4.11).

Рис. 4.11. Споруляция.

После удвоения генетического материала в материнской клетке ее содержимое претерпевает неравное деление. Меньшая клетка (преспора) обволакивается со всех сторон большей клеткой (спорангием) и оказывается окруженной двойным мембранным слоем. Между этими мембранами формируются споровые оболочки. Сначала образуется кортекс и начинается накопление в споре Са-диниколинага. Затем вокруг коргекса закладываются белковые оболочки и экзоспориум. Когда синтез оболочек завершается, спора становится зрелой, увеличивается ее светопреломление и термоустойчивость. Цикл спорообразования завершается лизисом спорангия и выходом зрелой споры. Споруляция обычно начинается при истощении питательных веществ в среде и длится от 7 до 10 ч (у В. subtilis и В. megaterium соответственно).

Прорастание споры в активную вегетативную клетку — не менее сложный процесс, чем спорообразование. Часто эндоспоры не прорастают даже в богатой среде без активации, которая может заключаться в слабом нагреве или воздействии ультразвуком. Активация заканчивается созреванием, т. е. нарушением состояния покоя споры. Процесс характеризуется набуханием споры, разрывом или поглощением экзоспориума, потерей устойчивости к нагреву и стрессам, утратой способности преломлять свет, увеличением метаболической активности. Многие обычные метаболиты, такие как аминокислоты и сахара, могут запускать процесс прорастания спор после их созревания. Протопласт споры образует новые компоненты, выходит из остатков споровых оболочек и формирует новую активную клетку бактерии.

Некоторые прокариоты, а среди эукариотических микроорганизмов простейшие, образуют другой вид покоящихся форм — цисту.

Циста — это потерявшая подвижность клетка с утолщенной, ослизненной оболочкой, устойчивая к высушиванию и перепадам температур.

Метаболическая активность цисты значительно снижена. Образование цист характерно для азотфиксирующих свободноживущих микроорганизмов из рода Azotobacter, некоторых метанотрофов и олиготрофов.

Цисты выполняют следующие основные функции: 1) защищают клетку от вредных воздействий окружающей среды, таких как истощение источника питания, высушивание, неблагоприятное значение pH или низкое парциальное давление кислорода; 2) способствуют сохранению ДНК; 3) служат способом передачи инфекционного начала от хозяина к хозяину (у патогенных микроорганизмов).

Обычно прорастание цист в вегетативные клетки побуждается благоприятными внешними условиями. Некоторые цисты паразитических простейших превращаются в активные трофозиготы, попадая в желудочнокишечный тракт (ЖКТ) хозяина.