Сельскохозяйственная микробиология. 
Микробиология

Микроорганизмы ПОЧВЫ и их сообщества

Мир почвенных микроорганизмов весьма разнообразен, однако в курсе микробиологии в основном рассматривают бактерии, в том числе актиномицеты, микроскопические грибы и близкие к ним организмы. Прочие группы обычно изучают в других курсах.

Методы определения численности, состава и активности почвенных микроорганизмов

?? Прямые методы определения численности микроорганизмов. При определении состава и активности почвенных микроорганизмов прежде всего встает вопрос об общем количественном анализе микроорганизмов почвы. Наиболее объективный метод такого анализа — прямое микроскопирование почвы по С. Н. Виноградскому. В соответствии с предложенной ученым методикой готовят почвенную суспензию и под микроскопом в определенном ее объеме подсчитывают общее число микроорганизмов. При подготовке почвенной суспензии целесообразно использовать один из рекомендуемых способов диспергирования почвы и десорбции микроорганизмов из почвенных частиц: растирание почвы, обработка поверхностно-активными веществами, ультразвуком и т. д. Далее пересчетом устанавливают, сколько микроорганизмов приходится на 1 г исследуемой почвы.

По Виноградскому, препараты готовят на предметном стекле и просматривают под оптическим микроскопом. В поле зрения можно видеть палочковидные бактерии, мелкие и крупные кокки, обрывки мицелия грибов и актиномицетов и другие микроорганизмы. Определение числа бактериальных клеток прямым микроскопированием облегчается при использовании люминесцентного микроскопа и красителей. При этом микроорганизмы лучше видны среди мелких частиц почвы. Красителями могут служить акридиновый оранжевый, изотиоционат и др.

При окрашивании акридиновым оранжевым красный тон приобретают мертвые клетки, зеленый — живые. Для окраски мицелия и установления его длины при прямом микроскопировании пользуются диацетатом флуоресцеина. Иногда прямую микроскопию применяют для микробиологического анализа срезов почвы, помещенных в метилметакрилат, фильтратов почвенных суспензий (на фильтрах Зейца), окрашенных метиленовым синим или другими красителями.

Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе для подсчета микроорганизмов в почве рекомендовали пользоваться сконструированной ими капиллярной камерой, глубина которой не превышает 30—40 мкм, а ширина — не более диаметра поля зрения микроскопа. Подсчитав число микроорганизмов в капилляре, можно также сделать пересчет на I г почвы.

Для прямого подсчета микроорганизмов почвы используют электронный микроскоп, при помощи которого наряду с обычными видами можно обнаружить множество мельчайших форм микроскопических существ. Для прямого анализа микрофлоры почвы применяют и сканирующий электронный микроскоп, дающий объемное изображение анализируемых объектов (рис. 54).

Прямые методы дают представление об обшей численности микроорганизмов в почве. Однако внешний облик микроорганизмов, как правило, не позволяет судить об их видовой принадлежности и функциях. Определить принадлежность микроскопических существ, обнаруженных в почве, к разным систематическим и физиологическим группам можно при помощи разнообразных приемов.

Косвенные методы определения численности микроорганизмов. Так, состав отдельных групп^[1] микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, грибы и т. д.) может быть уточнен посевом почве н;

Рис. 54. Почвенные микроорганизмы в сканирующем электронном микроскопе: А — нсспорообразующие бактерии; Б — спорообразующая бактерия; В — споры бациллы; Г — Streptomyces sp. Д, Е — спороносны сгрситомиистов;

Ж — конилиеносси Penicillium; 3 — конидии PeniciIlium: И — конидиеносеи Aspergillus (по: В. С. Гузев и др.) ной суспензии на различные твердые питательные среды, где затем развиваются колонии микроорганизмов тех или иных групп. В практике обычно используют агаризованные или желатинизированные, а иногда силикагслевые питательные среды.

После инкубации засеянных чашек в термостате подсчитывают выросшие на твердой питательной среде колонии. Допуская, что каждая колония произошла из одного зародыша того или иного микроорганизма, устанавливают число клеток в исходном образце почвы.

Подобный пересчет имеет ряд условностей. Например, бактериальные колонии могут вырасти на питательной среде не из одной клетки, а из группы клеток, оставшихся нс разделенными в почвенной взвеси. Колонии грибов и актином и цетов вырастают как из обрывков мицелия разной величины, так и из спор. Дифференцировать колонии, образованные из спор или мицелия указанных микроорганизмов, невозможно. Поэтому правильнее богатство почв мицелиальными микроорганизмами учитывать, измеряя длину их мицелия при прямом микроскопировании.

Представляют значительный интерес примерные соотношения числа микроорганизмов, подсчитываемых в одной и той же почве различными методами. В таблице 3 приведены соответствующие данные Д. И. Никитина для дерново-подзолистых почв Подмосковья.

Таблица 3.

Соотношение показателей численности микроорганизмов, определенных разными методами в дерново-подзолистых почвах.

Как видно, прямая микроскопия дает показатели, во много раз превосходящие те, что получены методом посева. Указанное явление объясняется прежде всего тем, что при прямом анализе подсчитывают живые и мертвые клетки. Число последних может быть велико, так как индивидуальная жизнь микроорганизмов очень коротка. Однако численность мертвых клеток в почве обычно не превышает 25% общего числа.

Общие показатели численности микроорганизмов, как бы условны они ни были, представляют интерес. На их основании можно примерно вычислить массу совокупности микроорганизмов в почве. Как показывают подсчеты, эта масса составляет десятые доли процента массы почвы. При последовательном сравнении почв, начиная от более северных и кончая южными, можно отметить постепенное увеличение в них доли микробной массы.

?ям Определение микробной биомассы. В последнее время для установления микробной массы почвы применяют косвенный метод, рекомендованный Д. Джен ки неоном. Почву обрабатывают летучим антисептическим веществом, убивающим микроорганизмы. После дефумигации почвы определяют количество выделяемого диоксида углерода, который в основном образуется из отмерших клеток. Затем расчетным путем примерно устанавливают массу органического вещества микроорганизмов.

Предложены и другие косвенные методы определения в почве массы отдельных групп микроорганизмов — для бактерий по специфичной для прокариот мурамовой кислоте, для грибов — по хитину, входящему в состав их клеток, для водорослей — по количеству хлорофилла и т. д. Почвенную биомассу примерно измеряют и по компонентам микробной клетки — АТФ и ДНК и более точно биохимическим методом — по содержанию аденозина и аде ни на при помощи флуориметрии.

Применяется оригинальный «регидрационный метод»: почву подсушивают при температуре не выше 70 °C, что нарушает барьер проницаемости микробных клеток, и в водную или солевую вытяжку переходит часть внутренних компонентов клетки. Концентрация таких компонентов может быть измерена и с использованием определенного коэффициента установлена биомасса микроорганизмов в почве.

В связи с тем, что при микроскопическом исследовании почв отдельные показатели условны, надежнее использовать одновременно несколько методов. По обобщенным данным Д. Г. Звягинцева, сырая масса бактерий в пахотном слое различных почв колеблется от 0,5 до 15 т/га, микроскопических грибов — от 5 до 20 т/га.

ьп&М Учет численности отдельных физиологических групп. При анализе почв нередко учитывают число отдельных физиологических групп микроорганизмов. Это делают так называемым методом титра, при котором твердые или жидкие избирательные (элективные) питательные среды для определенных групп микроорганизмов засевают разными разведениями почвенной суспензии. После выдержи ван ия в термостате отмечают ту степень разведения, в которой есть искомая группа микроорганизмов, и простым пересчетом определяют численность представителей данной группы в почве. Так узнают, насколько богата почва тарификаторами, денитрификаторами, целлюлозоразлагающими и другими микроорганизмами.

Метод титра используют при учете почвенных водорослей и простейших. Для водорослей берут минеральные среды, которые после засева рядом разведений почвенной суспензии выдерживают при искусственном освещении. При учете простейших также методом разведений почвенной суспензии инфицируют среды, содержащие микроорганизмы, которыми простейшие могут питаться.

Для характеристики типа почвы и се состояния важны не только показатели численности разных групп микроорганизмов, но и анализ состояния в почве представителей отдельных родов и видов. За редким исключением, физиологические группы микроорганизмов очень разнообразны. Внешняя обстановка может резко менять их видовой состав, но почти не отражается на числе физиологических групп. Поэтому при анализе почвы важно установить состояние отдельных видов микроорганизмов.

Диагностика до вида даже обычных сапрогрофов почвы невозможна. Поэтому сейчас исследователи стремятся выявить микроорганизмы, характерные для определенных почв. Список подобных индикаторных микроорганизмов пока невелик, но будет возрастать по мере развития почвенной микробиологии. Уже сейчас определение индикаторных микроорганизмов помогает установить тип почвы, ее окультурснность и предсказать характер воздействия на почву агротехнических и агрохимических приемов.

Наблюдение за микроорганизмами в природе. Приведенные методы анализа позволяют определить численность микроорганизмов или отдельных их групп в почве, но не выявляют их состояния (распределения, взаимосвязей и т. д.). Для выяснения данного вопроса существует ряд подходов. Так, в XX в. Н. Г. Холодный рекомендовал изучать микробные пейзажи почвы при помощи «стекол обрастания». В соответствии с данным методом в почву закладывают предметные стекла и оставляют на определенный срок. Поверхность стекол обрастает микрофлорой, характерной для данной почвы. Последующий микроскопический анализ стекол позволяет получить представление как о составе, так и о взаимоотношениях микроорганизмов в почве.

Новые возможности в области изучения микробных пейзажей почвы открыл капиллярный метод Б. В. Перфильева и Д. Р. Г, а б с. Для изучения группового состава микроорганизмов почв ими сконструирован капиллярный прибор — педоскоп, который может быть использован и для работы с грунтами. Педоскоп представляет собой набор капиллярных ячеек с пятью-шестью прямоугольными каналами. Ячейки закладывают в пазы широкого стеклянного держателя (рис. 55) и заполняют полужидкой авизованной средой, содержащей в качестве органического субстрата гумусовые вещества (фульвокислоты), что создает для микроорганизмов условия, близкие к почвенным. Псдоскои выдерживают в почве полтора-два месяца, затем просматривают под микроскопом. Описанный метод позволяет выявить характерные для почвы микробные ассоциации.

Оценка биологической активности почв. При анализе почв устанавливают не только состав их микронаселения, но и суммарную биохимическую активность. Одним из показателей такой активности служит тарификационная способность почвы, характеризующая мобилизуемость азотного запаса почвы в результате деятельности микроорганизмов.

Нитрификационную способность устанавливают по нарастанию в почве количества нитратов после выдерживания при определенных условиях в термостате. По результатам такого анализа можно судить о потенциальной способности почвы накапливать то или иное количество минерального азота. Если в начале опыта в почву внести соль аммония, то по накоплению нитратов можно получить дополнительное представление об активности нитрифицирующих бактерий.

При изучении почвенной биодинамики определяют интенсивность «дыхания» почвы по выделению почвой С0₂. Данная проба отражает в основном интенсивность разложения в почве органических соединений.

Можно установить быстроту распада в почве любого химического вещества путем учета продуктов распада или убыли внесенного в почву соединения. Для этого используют метод «аппликаций», при котором в почву помещают полосы бумаги или лучше.

Рис. 55. Псдоскои с различными типами капиллярных ячеек (по: Б. В. Перфильев и Д. Р. Габс) льняной ткани, закрепленной на стекле. Периодически материал извлекают из почвы, просматривают и фиксируют на нем зоны распада (рис. 56).

Аппликационный метод весьма показателен при решении некоторых агрономических задач. Например, он помогает выявить интенсивность процессов в разных горизонтах пахотного слоя, установить действие различных удобрений, мелиорирующих средств и т. д.

Для оценки биологической активности почвы исследуют также ферменты, находящиеся в почве. В основном их продуцируют микроорганизмы, поэтому между показателями активности ферментов почвы и определенными микробиологическими процессами намечается коррелятивная зависимость.

Рис. 56. Распад льняной ткани под лсйстнием микроорганизмов в черноземе: А. Ь. В — в течение одною, двух и трех месяцев соответственно Подобная связь отмечена, например, между активностью инвертазы и интенсивностью дыхания почвы, активностью оксидазы и динамикой нитратов. Абсолютные значения отдельных показателей активности ферментов различаются для почв разных климатических зон, что может быть использовано в диагностических целях.

При отмирании микроорганизмов окружающая среда еще более обогащается ферментами, которые в значительной части адсорбируются почвенными коллоидами, что способствует стабилизации последних. Отмечено, что ферментные процессы в почве прекращаются при значительно более низкой влажности, чем деятельность микроорганизмов. Следовательно, биохимические процессы могут протекать даже в относительно сухих почвах. Определение активности ферментов почвы может дать представление об их плодородии.

В зависимости от теоретических или практических задач почвенные микробиологи пользуются различными комплексами методов анализа почвы.

• [1] Здесь и далее понятие «группы микроорганизмов» имеет, как правило, нс таксономический, а скорее, морфо-физиологический и функциональный — экологический смысл. Анализ подобных групп традиционноиспользовался в почвенной микробиологии, и именно в таком виде результаты исследований были представлены в большинстве цитированных работ. Поэтому несколько условное понятие «групп» в учебнике сохранено, содержание же термина ясно из текста. Студентам же. наверное, полезно задуматься, сколько раз за последние десятилетия менялись объем и содержание ключевых терминов в микробиологии. Например, «бактерии» — палочковидные микроорганизмы, палочковидные неспорообразующие микроорганизмы (в отличие от бацилл);преимущественно одноклеточные формы (в отличие от мицеальных — акти-номицетов); прокариоты (за исключением прокариотических синезеленыхводорослей, впоследствии цианобактерий); все прокариоты (включая цианобактерии); наконец, снова лишь группа прокариот (поскольку к другойгруппе, или домену, теперь относят археи, или архсбактсрии). {Прим, ред.)