Для чего же нужны подобные эксперименты и нужны ли они вообще?

На первый взгляд, создание клеточных межвидовых химер является плодом безудержной фантазии забывшего о биоэтике ученого-фанатика. Однако именно этот подход значительно расширил наши фундаментальные знания об эмбриогенезе, поскольку позволил провести подсчет количества клеток, необходимых для органогенеза (образования печени, головного мозга, кожи, органов иммунной системы). Кроме того (пожалуй, это главное в биологии ЭСК), генетики получили в свое распоряжение уникальный инструмент, с помощью которого при химеризации зародышей можно установить функциональное предназначение генов. Сначала специальной методикой двойного нокаута в ЭСК «выключают» исследуемую пару генов. Затем такие ЭСК вводят в бластоцисту и отслеживают изменения, возникающие в организме развивающегося химерного зародыша. Таким образом были установлены функции генов sf-1 (развитие надпочечника и половых органов), urt-l (закладка почки), mуоD (развитие скелетных мышц), gata-l-4 (закладка эритрои лимфопоэза). Кроме того, в ЭСК лабораторных животных можно ввести (трансфецировать) еще не изученные гены человека для определения их функции с помощью химерного зародыша.

Но, как правило, оправдание эксперимента получением новых фундаментальных знаний не встречает поддержки у широкой аудитории. Приведем пример прикладного значения химеризации с помощью ЭСК. В первую очередь, это ксенотрансплантация, то есть, пересадка органов животного человеку. Теоретически создание клеточных химер «человек-свинья» позволяет получить животное, значительно более близкое по антигенным характеристикам к донору ЭСК, что в разных клинических ситуациях (сахарный диабет, цирроз печени) может спасти жизнь больному человеку. Правда, для этого нужно сначала научиться возвращать свойство тотипотентности геному зрелой соматической клетки, после чего ее можно будет вводить в развивающийся зародыш свиньи.

Сегодня свойство ЭСК в специальных условиях культивирования делиться практически бесконечно используется для наработки тотипотентной клеточной массы с последующей ее дифференциацией в специализированные клетки, например дофаминергические нейроны, которые затем трансплантируются пациенту с болезнью Паркинсона. При этом трансплантации обязательно предшествует направленная дифференцировка полученной клеточной массы в нужные для лечения специализированные клетки и очистка последних от недифференцировавшихся клеточных элементов.

Как выяснилось в дальнейшем, угроза канцерогенеза была далеко не единственной преградой на пути клеточной трансплантации. Спонтанно ЭСК в эмбриоидных тельцах дифференцируются гетерогенно, то есть, образуют производные самых разнообразных клеточных линий (нейроны, кератиноциты, фибробласты, эндотелиоциты). В поле зрения микроскопа в этом случае среди клеток разнообразных фенотипов выделяются кардиомиоциты, каждый из которых сокращается в своем ритме. Однако для лечения больного необходимо иметь чистые популяции клеток: нейронов — при инсульте, кардиомиоцитов — при инфаркте миокарда, в-клеток поджелудочной железы — при сахарном диабете, кератиноцитов — при ожогах и т. д.

Следующий этап развития клеточной трансплантологии был связан с разработкой технологий получения достаточного количества (миллионы клеток) таких чистых клеточных популяций. Поиск факторов, вызывающих направленную дифференцировку ЭСК, носил эмпирический характер, поскольку последовательность их синтеза в процессе эмбриогенеза оставалась неизвестной. Сначала было установлено, что образование желточного мешка индуцируется добавлением в культуру ЭСК цАМФ и ретиноевой кислоты. Линии гемопоэтических клеток образовывались при наличии в среде культивирования 1L-3, SCF, фактора роста фибробластов (FGH), инсулиноподобного фактора роста (IGF-1), 1L-6 и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-СSF). Клетки нервной системы формировались из ЭСК после удаления LIF и слоя фибробластов, выполняющего роль фидера. После обработки ретиноевой кислотой в присутствии эмбриональной сыворотки ЭСК начинали дифференцироваться в нейроны, а кардиомиоциты получались при добавлении диметилсульфоксида (ДМСО), который обеспечивает направленную доставку гидрофобных сигнальных молекул в клеточное ядро. При этом накопление в культуральной среде активных форм кислорода, а также электрическая стимуляция способствовали формированию зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

Огромные силы и средства были затрачены на поиск условий для дифференцировки ЭСК в инсулинпродуцирующие клетки поджелудочной железы. Однако скоро стало ясно, что целый ряд специализированных линий клеток в-клетки поджелудочной железы, клетки иммунной и эндокринной систем, адипоциты) не возникают из ЭСК при их стимуляции по принципу «один стимулирующий фактор — одна линия клеток». Этот принцип оказался справедливым только для ограниченного числа клеточных линий. В частности, образование нейронов можно индуцировать ретиноевой кислотой, клеток мышечной линии — трансформирующим фактором роста-в (ТСР-в), эритроидных линий — 1L-6, моноцитарно-миелоидной линии — 1L-3. Причем эффекты этих факторов на дифференцировку ЭСК оказались строго дозозависимыми.

Начался этап поиска комбинаций ростовых факторов, которые продвигали бы ЭСК на более поздние этапы эмбриогенеза с образованием мезодермы (источник кардиомиоцитов, скелетных мышц, эпителия почечных канальцев, миелоэритропоэза и гладкомышечных клеток), эктодермы (эпидермис, нейроны, сетчатка) и энтодермы (эпителий тонкого кишечника и секреторных желез, пневмоциты). Природа как бы заставляла исследователей двигаться вперед по пути эмбриогенеза, повторять его этапы в чашке Петри, не давая возможности сразу и легко получить желаемый результат. И такие комбинации факторов роста были найдены. Активин, А в комплексе с ТGF-в оказался мощным стимулятором образования из ЭСК мезодермальных клеток, блокируя при этом развитие энтои эктодермы. Ретиноевая кислота и, а также комбинация сигналов морфогенетического белка костного мозга (ВМР-4) и эпидермального фактора роста (EGF) активируют процессы образования клеток эктои мезодермы, останавливая развитие энтодермы. Интенсивный рост клеток всех трех зародышевых листков наблюдается при одновременном воздействии на ЭСК двух факторов — фактора роста гепатоцитов (НGF) и фактора роста нервных клеток.

Таким образом, для получения нужных клеточных линий следует сначала переводить эмбриональные стволовые клетки на этап образования клеток какого-либо зародышевого листка, а затем подбирать новую комбинацию ростовых факторов, способную индуцировать направленную дифференцировку экто-, мезои эндодермы в специализированные клетки, необходимые для трансплантации больному. Количество комбинаций ростовых факторов на сегодня исчисляется тысячами, большинство из них запатентованы, некоторые вообще не разглашаются биотехнологическими фирмами.

Наступила очередь этапа очистки полученных клеток от недифференцированных клеточных примесей. Дифференцированные в культуре клетки метились маркерами зрелых клеточных линий и пропускались через высокоскоростной лазерный иммунофенотипический сортер. Лазерный луч находил их в общем клеточном потоке и направлял по отдельному пути. Полученный очищенный клеточный материал первыми получили лабораторные животные. Пришло время оценки эффективности применения производных ЭСК на моделях болезней и патологических процессов. Одной из таких моделей была экспериментальная болезнь Паркинсона, которая хорошо воспроизводится на животных с помощью химических соединений, разрушающих дофаминергические нейроны. Поскольку в основе заболевания у человека лежит приобретенный дефицит дофаминергических нейронов, применение заместительной клеточной терапии в данном случае было патогенетически оправданным. У животных с экспериментальным гемипаркинсонизмом приживалось около половины дофаминергических нейронов, полученных из ЭСК и введенных в структуры мозга. Этого оказалось достаточно для значительного уменьшения клинических проявлений заболевания. Вполне успешными оказались попытки восстановления функции поврежденных структур ЦНС при экспериментальных инсульте, травмах и даже разрывах спинного мозга.

Однако следует обратить внимание на то, что практически все случаи успешного применения дифференцированных производных ЭСК для коррекции экспериментальной патологии предпринимались в остром периоде моделируемой патологической ситуации. Отдаленные результаты лечения не были столь утешительны: через 8−16 месяцев позитивный эффект клеточной трансплантации исчезал или резко уменьшался. Причины этого вполне понятны. Дифференцировка трансплантированных клеток in vitro или in loco morbi неизбежно приводит к экспрессии клеточных маркеров генетической чужеродности, что провоцирует иммунную атаку со стороны организма реципиента. Для разрешения проблемы иммунологической несовместимости использовалась традиционная иммуносупрессия, параллельно которой начались клинические испытания по реализации потенциала трансдифференцировки и генетической коррекции не вызывающих иммунного конфликта аутологических гемопоэтических и мезенхимальних стволовых клеток.