Электрофорез на носителях (зональный электрофорез)

В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором, наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускании постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.

В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.

Преимущества методов зонального электрофореза в сравнении с методами свободного электрофореза заключаются в следующем:

• 1. Все они значительно проще в осуществлении.
• 2. Необходимое количество исследуемого материала весьма мало. Например, для электрофореза на бумаге требуется 0,5—0,8 мг белка, а для электрофореза в полиакриламидном геле — всего 100—200 мкг. В то же время свободный электрофорез даже в аппаратах для микроили полумикроанализа требует значительных количеств сыворотки. Это является одной из причин, по которым задерживается широкое использование свободного электрофореза в повседневной работе клинических лабораторий. Благодаря малому количеству белка, требующемуся для исследования методом зонального электрофореза, появилась возможность ставить практически неограниченное число анализов белков сыворотки. Зональный электрофорез широко используется для анализа белков в педиатрической практике и при исследовании материалов с низкой концентрацией белка (например, спинномозговая и тканевая жидкости), не говоря уже о чрезвычайно широком использовании этого метода в экспериментальных исследованиях на животных. Поскольку для опытов требуются лишь очень небольшие количества исследуемого материала, можно ставить сколько угодно параллельных проб, что в значительной мере повышает точность исследования.
• 3. После электрофоретического разделения белковые фракции можно фиксировать в поддерживающей среде и выявить с помощью специфического окрашивания. Среди многочисленных методов окрашивания особое значение в клинических исследованиях приобрели способы выявления связанных с белками липидных и углеводных компонентов. Благодаря простоте этих методов анализ липопротеидов и гликопротеидов стал обычным в повседневной клинической практике. Он приобрел большое значение в диагностике некоторых заболеваний, а это позволило значительно продвинуться в выяснении их патогенеза. Специальные методы окрашивания помогают также обнаружить трансферрин, гаптоглобин, церулоплазмин и другие компоненты сыворотки.
• 4. Число фракций, на которые разделяется исходный белок при зональном электрофорезе, можно увеличить не только с помощью специальных методов окрашивания. Простая замена буферного раствора или поддерживающей среды дает тот же эффект. Например, при электрофорезе сыворотки на бумаге в буферном растворе трис-ЭДТА получается не пять, а девять белковых фракций. Еще лучшее разделение можно получить в поддерживающей среде, которая обладает эффектом молекулярного сита, например в крахмальном или полиакриламидном гелях. Малые размеры пор этих гелей задерживают миграцию высокомолекулярных белков, так как трение при этому увеличивается настолько, что даже большой электростатический заряд их молекул не может компенсировать замедляющего действия поддерживающей среды. Однако в других поддерживающих средах величина белковой молекулы мало влияет на скорость миграции, поскольку эффект увеличения трения обычно компенсируется ее большим электростатическим зарядом.
• 5. При зональном электрофорезе разделение белковых фракций происходит очень быстро. Некоторые методы позволяют закончить всю процедуру, включая окрашивание, за 1—2 ч.
• 6. Прибор для зонального электрофореза имеет простое устройство и может быть изготовлен даже в небольшой мастерской. Стоимость такого самодельного или имеющегося в продаже прибора значительно ниже цены аппарата для свободного электрофореза.
• 7. Кроме обычного окрашивания, белки, меченные радиоактивным изотопом, после разделения зональным электрофорезом можно выявлять радиоавтографически. Большое значение имеет также тот факт, что с помощью соответствующих субстратов можно непосредственно в поддерживающей среде тестировать ферментативную активность полученных белковых фракций. Метод зонального электрофореза имеет и некоторые недостатки. С его помощью нельзя произвести прямого определения скорости миграции белков. Между исследуемыми белками и поддерживающей средой возможны нежелательные взаимодействия, в результате которых часть белка адсорбируется в среде. Адсорбция происходит сильнее всего на бумаге, менее выражена на ацетат-целлюлозной мембране и практически ничтожна в агаровом геле. [3, 5, 7]

Таким образом, был описан один из видов электрофореза — зональный электрофорез. Отмечены основные составляющие, при проведении данного метода и перечислены подвиды данного метода.