Очистка почв от нефтяных загрязнений с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов

Реферат Дипломная работа выполнена в лаборатории «Микробиологического мониторинга и биоремедиации почв» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии. Работа посвящена селекции штаммов ассоциативных микроорганизмов обладающих углеводородокисляющей и ростстимулирующей активностью. В экспериментальной части данного исследовательского проекта была проведена сравнительная оценка 30 штаммов микроорганизмов относящихся к родам Rhodococcus, Variovorax, Arthrobacter, Bacillus, Micrococcus и Pseudomonas. По результатам поставленных опытов были выявлены 11 штаммов микроорганизмов, обладающих биодеструктивным потенциалом к углеводородам нефти. Отобранные микроорганизмы были изучены на предмет ростстимулирующей активности, и по экспериментальным данным мной были выявлены: 5 штаммов микроорганизмов, отличающихся наибольшей способностью к продукции фитогормонов ауксинов, 2 штамма — к продукции АЦК дезаминазы и 3 штамма, обладающих способностью к разложению труднодоступных фосфатов. По результатам всей экспериментальной части было выявлено 3 наиболее активных штамма для создания консорциума бактерий, обладающих несколькими или одним из ростстимулирующих свойств и углеводородокисляющей активностью, которые важны для разработки новых технологий фиторемедиации нефтезагрязненных почв.

Ключевые слова: бактерии, Rhodococcus, Variovorax, АЦК дезаминаза, ауксины, ризосфера, нефть, фитои биоремедиация.

Оглавление Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Проблема загрязнения почв нефтью

1.1.1 Актуальность проблемы и источники нефтяного загрязнения

1.1.2 Факторы определяющие характер и степень нефтяного загрязнения почв

1.1.3 Предельно допустимые концентрации загрязнений

1.2 Влияние нефти и нефтепродуктов на растения и почвенные микроорганизмы

1.2.1 Влияние нефтяного загрязнения на растения

1.2.2 Влияние нефтяного загрязнения на микробиологические процессы в почве

1.3 Микробная деградация углеводородов нефти

1.3.1 Микроорганизмы — деструкторы нефти и нефтепродуктов

1.3.2.1 Пути поступления углеводородов нефти в клетки микроорганизмов

1.3.2.2 Микробиологическое окисление углеводородов нефти и нефтепродуктов

1.4 Растительно-микробные системы для биоремедиации нефтезагрязненных почв

1.4.1 Ростстимулирующие ризосферные бактерии

1.4.2 Образование ассоциативного симбиоза

1.4.3 Механизмы положительного действия ризосферных бактерий на растения

1.4.4 Особенности приживаемости ризобактериальных инокулятов

1.5 Ремедиация нефтезагрязненных почв

1.5.1 Биоремедиация неффтезагрязненных почв с помощью микроорганизмов

1.5.2 Фиторемедиация нефтезагрязненных почв

2. Цели и задачи

3. Экспериментальная часть

3.1 Объекты исследования

3.2 Материалы и методы исследования

3.2.1 Определение углеводородокисляющей активности

3.2.2 Определение способности к продуцированию ауксинов по выявлению фитогормонов с использованием ВЭЖХ

3.2.3 Выявление АЦК-утилизирующих микроорганизмов и определение активности продуцируемого ими фермента АЦК дезаминазы

3.2.4 Определение способности к разложению труднодоступных фосфатов

3.3 Результаты исследования, их анализ и обсуждение

3.3.1 Результаты опыта по определению углеводородокисляющей активности

3.3.2 Результаты опыта по определению способности к продуцированию ауксинов по выявлению фитогормонов с использованием ВЭЖХ

3.3.3 Результаты опыта по выявлению АЦК-утилизирующих микроорганизмов и активности продуцируемого ими фермента АЦК дезаминазы

3.3.4 Результаты опыта по определению способности к разложению труднодоступных фосфатов Выводы по работе Список литературы

Введение

Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами является одной из важнейших мировых экологических проблем и имеет особенно острую необходимость решения для нефтедобывающих стран, в том числе и для России. Широкое применение в очистке нефтезагрязненных почв получили углеводородокисляющие микроорганизмы, которые служат основой для различного типа биопрепаратов и технологий биоремедиации. Нефть — чрезвычайно сложный и разнообразный по составу субстрат, и это, с одной стороны, определяет трудности очистки почв, но с другой стороны обуславливает широкий спектр микроорганизмов, которые могут использовать различные компоненты и фракции нефти для питания.

Углеводородокисляющие бактерии широко распространены и присутствуют в различных типах почв и климатических регионах. Поэтому выбранный тип технологии биоремедиации основан на активизации растительно-микробного взаимодействия наилучшим образом обеспечивающим осуществление комплексной очистки нефтезагрязненных почв.

Актуальными являются разработка способов повышения устойчивости растений к стрессовым факторам и улучшения их минерального питания. Создание сортов растений с повышенной устойчивостью к стрессам связано с большими трудностями, поскольку генетика и селекционный процесс видов растений, используемых для фиторемедиации, изучены слабо, а в природе часто несколько стрессовых факторов действуют одновременно, что также усложняет решение проблемы этим подходом.

Перспективным направлением исследований по повышению адаптации растений к стрессовым факторам является активизация их взаимодействий с полезными симбиотическими микроорганизмами, которые фиксируют атмосферный азот, стимулируют рост продуцируемыми фитогормонами, повышают доступность растениям элементов минерального питания, осуществляют биоконтроль фитопатогенов и индуцируют системную устойчивость.

Основная цель выполняемой работы заключается в отборе и детальной характеристике штаммов антистрессовых симбиотических бактерий, повышающих адаптационный потенциал растений к стрессовым факторам среды и осуществляющих деструкцию нефтезагрязнений почвы.

1. Аналитический обзор

1.1 Проблема загрязнения почв нефтью

1.1.1 Актуальность проблемы и источники нефтяного загрязнения Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами является одной из важнейших мировых экологических проблем и имеет особенно острую необходимость решения для нефтедобывающих стран, в том числе и для России.

Большинство земель в той или иной мере загpязнены сейчас нефтепродуктами. Особенно сильно это выражено в тех регионах, через которые проходят нефтепроводы, а также богатых предприятиями химической промышленности, использующими в качестве сырья нефть или природный газ. Ежегодно десятки тонн нефти загpязняют полезные земли, снижая ее плодородие, но до сих пор этой проблеме не оказывают должного внимания.

Основной источник загpязнения почвы нефтью — антропогенная деятельность. В естественных условиях нефть залегает под плодородным слоем почвы на больших глубинах и не производит существенного на нее влияния. В нормальной ситуации нефть не выходит на поверхность, происходит это только в редких случаях в результате подвижек горных пород, тектонических процессов, сопровождающихся поднятием грунта.

Основные загpязнения нефтью происходят в районах нефтепромыслов, нефтепроводов, а также при перевозке нефти по сухопутным и, особенно, морским магистралям. Так, при одном порыве нефтепровода выбрасывается в среднем 2 т нефти, что выводит из строя 1000 м? земли, а в результате аварии на газоконденсатопроводе на землю в среднем попадает не менее 2 млн. т/год нефтепродуктов. В районах наземных нефтепромыслов и нефтепроводов периодически происходят локальные утечки нефти и нефтепродуктов, которые не распространяются на большие площади.

Районы и источники загрязнений нефтью можно условно разделить на две гpуппы: временные и постоянные («хронические»). К временным районам можно отнести нефтяные пятна на водной поверхности, разливы при транспортировке. К постоянным относятся районы нефтедобычи, на территории которых земля буквально пропитана нефтью в результате многократных утечек.

Экологические последствия загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами зависят от параметров загpязнения, свойств почвы и характеристик внешней среды.

Нефть представляет собой жидкость от желто или светло-бурого до черного цвета, с характерным запахом. Это смесь углеводов и их производных, каждый из которых может рассматриваться как самостоятельный токсикант. В ее составе обнаруживается свыше 1000 индивидуальных органических веществ, содержащих 83 — 87% углерода, 12 14% водорода, 0,5 — 6,0% ceры, 0,02 — 1,7% азота, 0,005 — 3,6% кислорода и незначительную примесь минеральных соединений; зольность нефти не превышает 0,1%. Нефть легче воды: плотность различных видов нефти колеблется от 0,73 до 0,97. К нефтепродуктам обычно относят различные углеводородные фракции, получаемые из нефтей. Основные компоненты нефтепродуктов — углеводороды. Наряду с углеводородами в нефтепродуктах, как и в нефтях, также содержатся соединения серы, азота и кислорода.

В зависимости от месторождения нефть имеет различный состав как качественный, так и количественный. Больше всего предельных углеводородов содержится в нефти, добываемой в штате Пенсильвания (США). Бакинская нефть сравнительно бедна предельными углеводородами, но богата так называемыми нафтеновыми углеводородами, содержащимися в количестве до 90%. Значительно богаче предельными углеводородами гpозненская нефть, сураханская и ферганская (Средняя Азия).

1.1.2 Факторы определяющие характер и степень нефтяного загрязнения почв К первой гpуппе факторов относятся химическая природа загpязняющих веществ, концентрация их в почве, срок от момента загpязнения и др. Как было отмечено выше, нефть состоит из многих фракций, существенно различающихся между собой по физико-химическим свойствам. Поэтому их поведение в почве различно.

Наибольшей проникающей способностью обладают легкие фракции, которые капиллярными силами затягиваются на глубину до 1 метра. Будучи загpязнена только легкими фракциями, почва со временем может самоочиститься, так как эти фракции обладают низкими температурами кипения и довольно быстро испаряются. Легкая фракция нефти, куда входят наиболее простые по строению низкомолекулярные метановые (алканы), нафтеновые (циклопарафины) и ароматические углеводороды — наиболее подвижная часть нефти. Большую часть легкой фракции составляют метановые углеводороды с числом углеводородных атомов от 5 до 11 (пектан, гексан, гептан, октан, нонан, декан, ундекан). Нормальные (неразветвленные) алканы составляют в этой фракции 50−70%. Метановые углеводороды легкой фракции, находясь в почвах, оказывают наркотическое и токсическое действие на живые организмы. Особенно быстро действуют нормальные алканы с короткой углеводородной цепью, содержащиеся в основном в легких фракциях нефти. Эти углеводороды лучше растворимы в воде, легко проникают в клетки организмов через мембраны, дезорганизуют цитоплазменные мембраны организма. Нормальные алканы, содержащие в цепочке менее 9 атомов углерода, большинством микроорганизмов не ассимилируются, хотя могут быть окислены. Их токсичность ослабляется в присутствии нетоксичного углеводорода, который уменьшает общую растворимость алканов.

Многие исследователи отмечают сильное токсическое действие легкой фракции на микробные сообщества и почвенных животных. Легкая фракция, мигрируя по почвенному профилю и водоносным горизонтам, расширяет, иногда значительно, ореол первоначального загрязнения.

С содержанием легкой фракции коррелируют другие характеристики нефти: углеводородный состав, количество смол и асфальтенов. С уменьшением содержания легкой фракции ее токсичность снижается, но возрастает токсичность ароматических соединений, относительное содержание которых растет. Значительная часть легкой фракции нефти разлагается и улетучивается еще на поверхности почвы или смывается водными потоками. Путем испарения из почвы удаляется от 20 до 40% легкой фракции.

Содержание твердых метановых углеводородов (парафина) в нефти (от очень малых количеств до 15−20%) — важная характеристика при изучении нефтяных разливов на почвах. Твердый парафин не токсичен для живых организмов, но вследствие высоких температур застывания (+18 ?С и выше) и растворимости нефти (+40 ?С) в условиях земной поверхности он переходит в твердое состояние, лишая нефть подвижности.

Твердый парафин очень трудно разрушается, с трудом окисляется на воздухе. Он надолго может «запечатать» все поры почвенного покрова, лишив почву свободного влагообмена и «дыхания». Это, в свою очередь, приводит к полной деградации биоценоза.

К циклическим углеводородам в составе нефти относятся нафтеновые (циклоалканы) и ароматические (арены). Общее содержание нафтеновых углеводородов в нефти изменяется от 35 до 60%, в некоторых случаях составляя меньше или больше приведенных крайних значений. О токсичности нафтеновых углеводородов сведений почти не имеется. Циклические углеводороды с насыщенными связями окисляются очень трудно. Биодеградацию циклоалканов затрудняет их малая растворимость и отсутствие функциональных групп.

Ароматические углеводороды — наиболее токсичные компоненты нефти. В концентрации всего 1% в воде они убивают все водные растения; нефть, содержащая 38% ароматических углеводородов, значительно угнетает рост высших растений. С увеличением ароматичности нефти увеличивается ее гербицидная активность. Содержание ароматических углеводородов в нефти изменяется от 5 до 55%, чаще всего от 20 до 40%. Основную массу ароматических структур составляют моноядерные углеводороды — гомологи бензола. Полициклические ароматические углеводороды, т. е. углеводороды, состоящие из двух и более ароматических колец, содержатся в нефти в количестве от 1 до 4%.

Бензол и его гомологи оказывают более быстрое токсическое действие на организм, чем полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Последние действуют медленнее, но более длительное время, являясь хроническими токсикантами. Ароматические углеводороды трудно поддаются разрушению. Обычно они окисляются микроорганизмами.

Смолы и асфальтены относятся к высокомолекулярным неуглеводородным компонентам нефти. В составе нефти они играют исключительно важную роль, определяя во многом ее физические свойства и химическую активность. Структурный каркас смол и асфальтенов составляют высококонденсированные полициклические ароматические структуры, состоящие из десятков колец, соединенных между собой гетероатомными структурами, содержащими серу, кислород, азот.

По содержанию смол и асфальтенов нефти разделяются на малосмолистые (от 1−2 до 10% смол и асфальтенов), смолистые (10−20%), высокосмолистые (23−40%). Смолы и асфальтены содержат основную часть микроэлементов нефти, в том числе почти все металлы. Общее содержание микроэлементов в нефти — сотые, десятые доли процента. Смолистые вещества очень чувствительны к элементарному кислороду и активно присоединяют его. На воздухе смолистая нефть быстро густеет, теряет подвижность. Если нефть просачивается сверху, ее смолисто-асфальтеновые компоненты сорбируются в основном в верхнем, гумусовом горизонте, иногда прочно цементируя его. При этом уменьшается поровое пространство почвы. Смолисто-асфальтеновые компоненты гидрофобны. Обволакивая корни растений, они резко ухудшают поступление к ним влаги, в результате чего растения засыхают. Эти вещества малодоступны микроорганизмам, процесс их метаболизма идет медленно, иногда десятки лет. Токсическое же влияние оказывают некоторые тяжелые металлы в составе смол и асфальтенов. Последние малодоступны микроорганизмам и обычно остаются в почвах в виде прочного органно-минерального комплекса.

Из различных соединений серы в нефти наиболее часто обнаруживаются сероводород, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, свободная сера. Сернистые соединения оказывают вредное влияние на живые организмы. Особенно сильным токсическим действием обладают сероводород и меркаптаны.

Ко второй гpуппе факторов принадлежат структура почвы, гpанулометрический состав, влажность почвы, активность микробиологических и биохимических процессов и др. Чем крупнее частицы почвы, тем легче нефть и нефтепродукты проходят внутрь ее, в ее нижние слои. От структуры почвы также зависит степень аэрации почвы, а следовательно, интенсивность испарения и окисления нефти. Влажная почва отталкивает гидрофобные нефть и нефтепродукты, препятствуя ее впитыванию.

К внешним факторам относятся температура воздуха, ветреность, ypoвень солнечной радиации и особенно доля ультрафиолетового излучения в свете, растительный покров и пр. Чем выше температура воздуха, тем выше скорость окислительных процессов, посредством которых разлагается на воздухе нефть. Соответственно в летнее время нефть быстрее разлагается: легкие фракции испаряются, тяжелые окисляются. Зимой, при отрицательной температуре, большинство тяжелых фракций переходят в твердое состояние и вообще не окисляются, поэтому основная часть (если не все) процессов разложения нефти и нефтепродуктов происходят именно летом. Ветер обдувает верхний слой почвы свежим воздухом, создавая динамически повышенную концентрацию кислорода над ней, способствуя окислению. К тому же ветер создает токи воздуха в воздушной системе почвы, по крайней мере той ее части, что осталась после загpязнения. Выветривание верхнего загpязненного и окисленного слоя также содействует дальнейшему очищению. Ультрафиолетовое излучение способствует окислительным реакциям и поэтому сильно ускоряет разложение нефти на поверхности земли и, особенно, на водных гладях.

При сильном нефтяном загpязнении растительный покров обычно вымирает. Однако, если загpязнение не очень велико, то он может способствовать очищению почвы. Образующийся от него за несколько лет растительный опад создает над загpязненным слоем чистый гyмусовый слой, богатый аэробной микрофлорой, которая может вести окисление лежащих ниже нефтепродуктов.

1.1.3 Предельно допустимые концентрации загрязнений Предельно допустимые концентрации нефтяных загрязнений в почвах зависят от вида нефтепродуктов (НП) и составляет для почвы 0,1 мг/кг. Однако ПДК суммарного содержания нефтепродуктов в почве не стандартизовано; установлены ПДК для некоторых видов нефтепродуктов: бензол — 0,3 мг/кг, толуол — 0,3 мг/кг, ксилол — 0,3 мг/кг.

Минимальный уровень содержания нефтепродуктов в почвах и грунтах, выше которого наступает ухудшение качества природной среды, рассматривается как верхний безопасный уровень концентрации (ВБУК). ВБУК нефтепродуктов в почвах зависит от сочетания многих факторов, таких как тип, состав и свойства почв и грунтов, климатические условия, состав нефтепродуктов, тип растительности, тип землепользования и др. Эти нормы должны различаться в зависимости от климатических условий и типов почвообразования.

Верхний безопасный уровень концентрации НП в почвах можно принять за ориентировочный уровень допустимой концентрации (ОДК) в почвах. Ориентировочным допустимым уровнем загрязнения почвы НП предлагается считать нижний допустимый уровень загрязнения, при котором в данных природных условиях почва в течение одного года восстановит свою продуктивность, а негативные последствия для почвенного биоценоза могут быть самопроизвольно ликвидированы. Такая оценка ОДК как общесанитарного показателя может быть дана для верхнего гумусо-аккумулятивного горизонта почв (примерно до глубины 20−30 см).

Вполне очевидно, что ОДК нефти и НП в почве не может быть единым для всех типов почв и природных зон. Он зависит от факторов, определяющих влияние вещества на свойства почв и растений, от потенциала самоочищения почв, от данного вида загрязнения.

1.2 Влияние нефти и нефтепродуктов на растения и почвенные микроорганизмы

1.2.1 Влияние нефтяного загрязнения на растения На современном этапе развития общества растения испытывают разнообразные антропогенные воздействия, в ответ на которые они меняют стратегии поведения. Изменение стратегий поведения проявляется в возникновении механизмов адаптации к новым экологическим факторам на разных уровнях организации растений. Основным антропогенным фактором, оказывающим стрессовое воздействие на растения, является нефтяное загрязнение. Изучение адаптационных механизмов растений в ответ на действие нефти делает возможным выявление признаков, обеспечивающих устойчивость растений в условиях нефтяного загрязнения, с целью их использования в процессе разработки методов рекультивации и подборки для неё устойчивых к нефтяному загрязнению растений. Изучаемые признаки можно использовать как индикаторы для характеристики состояния почв при нефтяном загрязнении.

Опасность загрязнения нефтью и нефтепродуктами связана, прежде всего, с высокой чувствительностью к нему высших растений, при том, что они занимают ключевое положение практически во всех наземных экосистемах, определяя существование и состав остальных биологических компонентов биогеоценозов: животных и микроорганизмов.

Влияние нефти на растения обусловлено, как ее непосредственным токсическим воздействием, так и трансформацией почвенной среды.

Морфологические и анатомические изменения растений.

Нефть оказывает отрицательное влияние на рост, метаболизм и развитие растений, подавляет рост надземных и подземных частей растений, в значительной степени задерживает начало цветения. Загрязненные нефтью цветки редко образуют семена.

Нефтяное загрязнение в значительной мере изменяет морфологию растения. Наблюдается уменьшение роста стебля в высоту, уменьшение его радиального роста, нефтяное загрязнение ингибирует ростовые процессы. В условиях загрязнения нефтью значительно снижается площадь ассимиляционной поверхности растений (у мезофитных и ксерофитных растений). Корневая система уменьшает свои размеры, меняет свою морфологию (переход от мочковатого типа корневой системы к стержневому). Прекращается формирование клубеньков и развитие корневых волосков.

Значительным изменениям подвергаются анатомические особенности растений. Увеличивается толщина листовой пластинки, исчезает кутикула, уменьшаются размеры клеток и количество хлоропластов. В корневой системе растений происходит утолщении эпидермы, увеличивается количество ксилемных элементов и размер центрального цилиндра, объем воздухоносных тканей. Размеры ксилемных элементов сокращаются, что обеспечивает корню более выгодный энергетически механизм поглощения и транспорта воды и минеральных элементов.

Изменения анатомии и морфологии органов направлены на создание защитных механизмов и выполняют компенсаторную функцию в ответ на нефтяное загрязнение. Ответная реакция растений на нефтяное загрязнение зависит от их принадлежности к экологической группе. Наблюдается усиление ксероморфных признаков у устойчивых к нефтяному загрязнению растений, что обеспечивает им защиту от токсического действия нефти.

В литературе отмечается различная реакция растений на нефть в зависимости от их биоморфы и систематической принадлежности.

В целом на нефтезагрязненых почвах у растений отмечаются следующие физиономические и фенологические отклонения от нормы:

1) появление гигантских и карликовых форм;

2) нарушение нормальных пропорций во внешнем облике растений;

3) возникновение наростов, наплывов, утолщений, придающих отдельным экземплярам уродливый облик;

4) нарушение нормального ритма развития (повторное цветение видов, нормально цветущих один раз в сезон);

5) сильная поврежденность растений вредителями.

Биохимические и физиологические изменения.

Нефтяное загрязнение почв в значительной мере влияет на уровни содержания фотосинтетических и флавоноидных пигментов в листьях растений.

У растений, произрастающих в условиях нефтезагрязнения, наблюдается снижение содержания всех фотосинтетических пигментов (хлорофилла а, хлорофилла b, каротиноидов) и возрастание количества флавоноидных соединений. Так же нефтяное загрязнение может способствовать накоплению антоциановых пигментов.

С ростом концентрации нефти в почве уменьшается содержание нитратов в корнеплодах, и заметно увеличивается концентрация витамина С. Повышение концентрации витамина в корнеплодах обусловлено ухудшением условий минерального питания расений.

На клеточном и физиологическом уровне воздействие углеводородов нефти на растения проявляется в нарушении структуры хлоропластов и фотосинтеза. Углеводороды повреждают мембраны хлоропластов, митохондрий, мембраны клеток корня. Растения, растущие при нефтяном загрязнении почвы, содержат значительно большее количество веществ со стресспротективными свойствами.

Поступая в клетки и сосуды растений, нефть вызывает токсические эффекты. Они проявляются в быстром повреждении, разрушении, а затем в отмирании всех живых, активно функционирующих тканей растений в вегетирующем состоянии.

Таким образом под действием нефтяных загрязнений в растениях происходят различные изменения как внешние, которые можно различить визуально, так и внутренние, которые можно обнаружить только с помощью специальных исследований и проведения ряда анализов.

Устойчивость растений к нефтяному загрязнению сильно зависит от стадии их развития и биомассы. Наиболее чувствительны к токсическому воздействию нефтепродуктов растения, находящиеся на ранних стадиях развития, а устойчивы — многолетние взрослые растения, так как у них происходит отрастание новых органов из спящих почек после гибели части растений после загрязнения.

Очевидно, что способность различных растений произрастать в условиях нефтяного загрязнения неодинакова. Выявление и изучение растений, способных не только произрастать на нефтезагрязненных почвах, но и способствовать их восстановлению является важным аспектом для повышения эффективности очистки нефтезагрязненных почв.

1.2.2 Влияние нефтяного загрязнения на микробиологические процессы в почве Процесс естественного фракционирования и разложения нефти начинается с момента ее поступления на поверхность почвы. Выделяют три наиболее общих этапа трансформации нефти в почвах:

1) физико-химическое и частично микробиологическое разложение алифатических углеводородов;

2) микробиологическое разрушение главным образом низкомолекулярных структур разных классов, новообразование смолистых веществ;

3) трансформация высокомолекулярных соединений; смол, асфальтенов, полициклических углеводородов.

Длительность всего процесса трансформации нефти в разных почвенно-климатических зонах различна: от нескольких месяцев до нескольких десятков лет.

Загрязнение нефтью оказывает отрицательное воздействие на химические, физические и биологические свойства почв. Под влиянием нефти и ее компонентов изменяется численность микроорганизмов основных физиологических групп, ухудшаются агрофизические, агрохимические свойства почвы, снижаются активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, обеспеченность почвы подвижными формами азота и фосфора.

На разложение нефти в почве решающим образом влияет функциональная активность комплекса почвенных микроорганизмов, обеспечивающих полную минерализацию нефти и нефтепродуктов до углекислого газа и воды. На первой стадии изменение почвенной биоты характеризуется массовой гибелью мезои микрофауны; на второй стадии — «бумом» микробиологической активности специализированных микроорганизмов и последующей постепенной эволюцией биоценоза, коррелирующей с постоянно изменяющейся геохимической ситуацией в почве.

В работе Н. А. Киреевой показана токсичность ароматических углеводородов для микроорганизмов почвы и их негативное воздействие на ферментативную активность. Наиболее чувствительными к загрязнению ароматическими углеводородами являются нитрифицирующие и целлюлозоразрушающие микроорганизмы, которые могут служить индикаторами загрязнения почв.

Загрязнение нефтью существенно изменяет комплекс почвенных актиномицетов, снижая их численность и обедняя видовой состав. Кроме того, в загрязненной нефтью почве возрастает число фитопатогенных и фитотоксичных видов микроскопических грибов. Развитие фитотоксичных форм грибов может усилить отрицательное воздействие на почву нефтяного загрязнения.

Показано, что загрязнение нефтью приводит к существенному (на два порядка) снижению численности гетеротрофной части микробного комплекса, отмеченного на начальных этапах воздействия нефти. Через три месяца происходит восстановление численности гетеротрофов.

Первоначально, в интервале концентраций нефти соответствующих зоне гомеостаза (до 1 мл/кг), она не оказывает существенного влияния на почвенную микробиоту, выступает как биологический стимулятор. Более высокие дозы (зона стресса 1−30 мл/кг) приводят к необратимым изменениям микробиологических свойств почвы, а в дальнейшем, — к нарушению её водно-воздушного режима. Затем, в зоне резистентности, она становится основным трофическим субстратом для углеводородокисляющих микроорганизмов, одновременно угнетая жизнедеятельность других гетеротрофных микроорганизмов, растений и животных. Наконец, при ещё больших дозах, в зоне репрессии, нефть выступает как ингибитор биологической активности почвы.

Изменения микробиологических параметров почвы первыми рассматриваются как значимые экологические нарушения. Они зафиксированы при концентрациях нефти более 1−5 мл/кг в зависимости от типа почвы.

1.3 Микробная деградация углеводородов нефти

1.3.1 Микроорганизмы — деструкторы нефти и нефтепродуктов Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным различными систематическими группами. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая и ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют большой практический интерес.

Микроорганизмы, использующие углеводороды, широко распространены в природе. Активные формы микроорганизмов выделяются из разнообразных водных и почвенных экосистем, особенно загрязнённых углеводородами или нефтью, а также из микрофлоры нефти и пластовых вод нефтяных месторождений. Были описаны 22 рода бактерий, 31 род микроскопических грибов и в том числе 19 родов дрожжей, выделенных из почвенных экосистем, способных к биодеградации различных нефтяных углеводородов. Из морской среды обитания выделено 25 родов бактерий и 27 родов углеводородокисляющих микроскопических грибов. В их числе бактерии родов Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Desulfovibrio, Eneribacer, Escherichia, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Pseudomonas, Sarcina, Serratia, Spirillum, Streptomyces, Thiobacillus, Vibrio; мицелиальные грибы родов Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trichoderma; дрожжи Candida, Debaryomyces, Endomyces, Endomycopsis, Hansenula, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis, Trichosporon; цианобактерии Agmenellum, Aphanocapsa, Lyngbya, Microcoleus, Oscillatoria, Phormidium, Plectonema.

Как видно, углеводородокисляющая группа микроорганизмов природного происхождения таксономически очень разнообразна. Наиболее активные бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Из дрожжей выделяют род Candida и Torulopsis.

Постоянными и доминирующими компонентами естественных биоценозов нефтяных загрязнений являются родококки, их основная экологическая функция — аккумуляция газообразных н-алканов, жидких углеводородов нефти и трансформация их в биомассу. Бактерии этого рода отличаются высокой жизнестойкостью при действии неблагоприятных факторов — низкой температуры, солнечного ультрафиолета, длительного отсутствия питательных веществ. Естественная нефтеокисляющая микрофлора нефтезагрязненной тундровой почвы представлена главным образом бактериями R. Еrythropolis. В связи с этим понятен интерес к родококкам — деструкторам нефти.

В настоящее время активно ведётся поиск микроорганизмов, разрушающих нефть, в особенности при низких температурах. Т. В. Коронелли провел скрининг коллекции углеводородокисляющих бактерий родов Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus на агаризованной среде с парафином при температуре 6 °C с целью выбора штамма, сохраняющего углеводородокисляющую активность при низких температурах. Отобранные таким образом 17 штаммов выращивали в жидкой среде с нефтью при температуре 8 °C. Через 14 суток определяли концентрацию нефтяных углеводородов методом ИК-спектроскопии. Оказалось, что 12 штаммов использовали от 13 до 36% внесенной нефти, два штамма — 5−6%, а три были неэффективными. Все 12 штаммов являлись представителями рода Rhodococcus: 11 штаммов принадлежали к виду R. Еrythropolis, один — к виду R. Мaris.

Немалый интерес представляют спорообразующие бактерии, так как они наиболее устойчивы к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородных загрязнений должен производиться с учетом ряда требований. При поиске микроорганизма-деструктора необходимо учитывать, что вносимая в почву микробная биомасса не должна быть чужеродной для почвенной микрофлоры. Еще одним важным требованием к вносимым в почву микроорганизмам является их непатогенность. В связи с тем, что технология микробиологической очистки загрязненных почв предусматривает аэробные условия, необходимо вести выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Микробные клетки могут подвергаться воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, следовательно, микроорганизм-деструктор должен обладать высокой жизнестойкостью.

1.3.2 Процесс микробиологического окисления углеводородов нефти Микробиологические превращения углеводородов представляют собой особую область из-за некоторых особенностей этих процессов. Их специфика обусловлена своеобразием углеводородов как химических соединений с предельной восстановленностью и связанными с этим гидрофобными свойствами. Оказалось, что гидрофобность углеводородной молекулы имеет большое значение для химизма микробиологического окисления этих соединений, их транспорта в микробную клетку, динамики роста культур, их физиологии, многих аспектов технологии процессов, связанных с применением субстратов углеводородной природы.

Все реакции микробиологического превращения углеводородов являются окислительными. Предельная восстановленность этих веществ делает необходимым для их окисления присутствие кислорода. Гидрофобный характер молекулы является причиной того, что процессы окисления осуществляются оксигеназами, в отличие от окисления более гидрофильных веществ, происходящего под действием дегидрогеназ. Гидрофобность углеводородных субстратов и их плохая растворимость в воде определяют способы транспорта веществ в клетку.

Характерной особенностью процесса ассимиляции углеводородов в качестве источника углерода является часто встречающееся накопление промежуточных продуктов в культуральной среде микроорганизмов, растущих за счёт таких субстратов.

Окисление углеводородов большинством известных микроорганизмов осуществляется с помощью адаптивных энзимов (ферментов). Этот факт установлен многочисленными экспериментами по окислению углеводородов клетками микроорганизмов, выращенных на неуглеводородных субстратах.

1.3.2.1 Пути поступления углеводородов в клетки микроорганизмов Имеющиеся разнообразные данные о поступлении углеводородов в клетки микроорганизмов, локализации углеводородокисляющих ферментов и образующихся продуктов не оставляют сомнений в том, что углеводороды окисляются внутриклеточно. Отсюда вытекает необходимость объяснить поступление нерастворимого в воде субстрата в клетку.

Различают следующие виды транспорта углеводородов в клетки микроорганизмов:

— пассивный перенос:

а) простая диффузия — неспецифическое поступление веществ в клетку, при котором различные соединения проникают в клетку, не взаимодействуя с каким-либо переносчиком;

б) облегчённая диффузия — специфический процесс, при котором переносимое вещество обратимо связывается с переносчиком, находящимся в мембране, и поступает в клетку в виде субстрат-белкового комплекса. При этом скорость поступления веществ равна скорости его выхода из клетки.

Оба эти процесса не требуют энергии, и скорость их зависит от концентрации субстрата в среде.

— активный перенос — вещество поступает в клетку против градиента концентрации в среде; процесс требует затрат энергии и происходит с помощью специфических белков-переносчиков (пермеаз).

Дальнейшие ограничения связаны с растворимостью субстрата в воде. Поступление субстрата в микробную клетку может осуществляться либо из состояния истинного раствора, либо при непосредственном контакте его с клеткой.

Процесс поглощения определяется как активный транспорт в соответствии со следующими параметрами:

— специфичность по отношению к субстрату; на наружной поверхности мембраны образуется комплекс переносчик — субстрат;

— потребность в метаболической энергии; переносчик обладает высоким сродством к субстрату, если он обращен к внешней поверхности мембраны, и низким сродством к нему, если обращен к ее внутренней поверхности. На эти изменения переносчика и расходуется энергия;

— транспорт соответствующего субстрата против градиента концентрации; это происходит за счет изменения сродства переносчика к субстрату при переходе снаружи внутрь;

— освобождение в цитоплазму немодифицированного субстрата (в отличие от переноса групп).

Только низкомолекулярные жидкие углеводороды от C₅ до C₁₁, а также некоторые ароматические углеводороды могут незначительно растворяться в воде, более высокомолекулярные гомологи практически нерастворимы.

1.3.2.2 Микробиологическое окисление углеводородов нефти и нефтепродуктов Окисление нормальных парафинов Пути окисления нормальных парафинов микроорганизмами, использующими эти соединения в качестве источников углерода и энергии, изучены достаточно подробно.

В преобладающем большинстве случаев в результате первичной ферментативной атаки молекулы н-парафина происходит окисление терминального атома углерода. Первыми стабильными продуктами окисления углеводородов являются первичные спирты.

Следующий этап составляют обычные биологические превращения спирта в альдегид и альдегида в кислоту. Общая схема реакций выглядит следующим образом:

R-CH₂-CH₃+ [O] > R-CH₂-CH₂OH — 2H > R-CH₂-CHO — 2H + HOH > (1) R-CH₂-COOH

Дальнейший механизм усвоения жирных кислот, возникающих при окислении углеводородов, протекает путем ?-окисления, заключающегося в последовательном отщеплении двууглеродных фрагментов в виде активного ацетата, поступающего в цикл трикарбоновых кислот.

H.B. Lukins и J.W. Foster установили, что некоторые микобактерии метаболизируют н-алканы через метилкетоны с промежуточным образованием перекиси и вторичного спирта.

Дальнейшее окисление кетонов изучено пока недостаточно.

На основании работ F.W. Forney и A.J. Markovetz деградация тридекана культурой Pseudomonas aeruginosa представляется следующим образом [32]:

СН₃(СН₂)₁₁СН₃ > СН₃(СН₂)₁₀СНОНСН₃ > СН₃(СН₂)₁₀СОСН₃> СН₃(СН₂)₉СН₂ОСОСН₃ >СН₃(СН₂)₉СН₂ОН+СН₃СООНvСН₃(СН₂)₉СООН. (2)

Окисление алкенов Микробиологическое окисление алкенов может включать следующие реакции:

а) окисление метильной группы с образованием ненасыщенных кислот; б) образование эпоксидов по двойной связи; в) образование диолов. Ненасыщенные углеводороды могут окисляться одновременно и по метильной концевой группе и по двойной связи молекулы.

Еще в 60-е гг. Стюарт с сотрудниками показали, что эфирообразующие бактерии Micrococcus cerificans окисляли метильную группу алкенов-1, не затрагивая двойную связь молекулы. Впоследствии детальные исследования, проведенные Ван-дер-Линденом и Тийссе выявили и другой путь окисления алкенов, ведущий к образованию эпоксидов, диолов, ?-оксикислот и ненасыщенных кислот.

Изучая окисление тетрадецена культурой Pseudomonas aeruginosa, A.J. Markovetz с сотрудниками обнаружили оба пути окисления. Ими были выделены и идентифицированы тетрадеценовая-13 кислота и тетрадеканол-2. Это свидетельствовало о том, что и метильная группа и терминальная двойная связь подвергались атаке этой культурой. Позже были обнаружены оба пути окисления гексадецена-1 и октадецена-1 культурой Micrococcus cerificans.

На основании этих работ можно дать схему реакций окисления алкенов бактериями, представленную на рисунке 1:

Рисунок 1 — Схема реакций окисления алкенов бактериями Окисление циклоалканов Описано несколько примеров полной деградации циклопарафинов и их производных, причем показано, что деградации циклоалканов нередко предшествует их ароматизация.

Впервые микробиологическая трансформация циклопарафинов описана J.S. Ooyama и J.W. Foster. Микроорганизм Mycobacterium vaccae, способный усваивать изоалканы, в частности 2-метилбутан, окислял циклические алканы до соответствующих кетонов суспензиями отмытых клеток.

Гомологи ряда циклопарафинов от С₃ до С₈ превращались в соответствующие цикломонокетоны. Окисление циклоалканов до циклокетонов, по-видимому, происходило через образование цикломоноспиртов.

Детально исследовалось окисление циклоалканов G.S. Fonken с сотрудниками. Была изучена большая группа грибов и бактерий на способность окислять циклопентаны при росте на различных субстратах: пептоне, декстрозе, солодовом и кукурузном экстрактах.

Авторам удалось с помощью этих организмов провести окисление циклогексана, фенилциклогексана, циклогексилсульфонов, циклопентилсульфонов и других до соответствующих оксипроизводных. На рисунке 2 и 3 приводятся типичные примеры окислительных трансформаций циклоалканов [35]:

Рисунок 2 — Схема реакций окисления циклопропана, циклогексана и бициклогексила

Деградация фенантрена К настоящему времени описано 2 различных пути деградации фенантрена, которые представлены на рисунке 4. Сначала фенантрен в результате последовательных реакций трансформируется до 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты. Дальнейшие биохимические пути деградации этого соединения могут быть различны: 1-гидрокси-2-нафтойная кислота метаболизируется либо через салицилат и катехол, либо через образование о-фталата и прокатехата. Катехол и протокатехат далее расщепляется по ортоили мета-пути до интермедиатов цикла Кребса.

Рисунок 3 — Схема реакций окисления н-бутилциклогексана, этилциклогексана и метилциклопентана Большим катаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas. Они способны полностью утилизировать или частично трансформировать такие соединения, как нафталин, фенантрен, флуорен и др.

Структурное сходство нафталина и фенантрена и данные относительно ферментов, участвующих в катаболизме этих соединений, позволили предположить возможность модификаций генетических систем биодеградации нафталина с приобретением ими способности детерминировать деградацию фенантрена.

Деградация антрацена Рисунок 4 — Пути микробной деградации нафталина и фенантрена При биотрансформации антрацена, антрахинон является тупиковым соединением и часто накапливается в культуральной жидкости микроорганизмов. 6,7-бензокумарин является продуктом спонтанного замыкания кольца продукта экстрадиольного расщепления цис-1,2-дигидроксиантрацена, что предполагает обязательное существование и антрацен цис-1,2-дигидродиола — первого интермедиата в пути разложения антрацена, найденного у других микроорганизмов. Были предложены два пути частичной конверсии антрацена представленных на рисунке 8, включающие в себя трансформацию антрацена в антрахинон и параллельный процесс последовательного превращения антрацена через цис-1,2-дигидрокси-1,2-дигидроантрацен, 1,2-дигидроантрацен в 6,7-бензокумарин.

Деградация флуорена Рисунок 5 — Схема биоконверсии антрацена Изучение превращения флуорена микроорганизмами проводилось как смешанными, так и чистыми культурами. Большую роль в детоксикации флуорена и ряда других ароматических углеводородов играют бактерии рода Rhodococcus, широко распространенные в окружающей среде.

Родококками Обозначения: 1 — 9-гидроксифлуорен; 2 — 2-гидроксифлуорен; 3 — 9-флуоренон; 4 — гидроксифлуоренон; 5 — дигидроксифлуорен; 6 — ?-инданон-?-гидроксиуксусная кислота; 7 — формилинданон; 8 — 1-инданон; 9 — 3,4-дигидрокумарин.

Окисление алкилзамещённых ароматических углеводородов Использование микроорганизмами алкилзамещенных ароматических углеводородов для роста достаточно хорошо известно, хотя и не является обычным свойством микробных культур. Описано окисление толуола культурами Nocardia и Pseudomonas, ми nксилолов, кумола, цимола, псевдокумола, 1- и 2-метилнафталинов различными видами рода Pseudomonas.

Рисунок 6 — Предполагаемые пути трансформации флуорена Ассимиляция простейшего метилпроизводного бензола — толуола — свойственна небольшому числу микроорганизмов. Описано всего несколько культур Nocardia и Pseudomonas, способных потреблять это соединение как субстрат для роста. У разных организмов начальные этапы окисления толуола связаны или с первоочередным окислением метила, или гидроксилированием ядра.

Алкилнафталины, как субстрат для роста микроорганизмов, изучены более поверхностно. Тем не менее, показано, что культуры Pseudomonas окисляют 1- и 2-метилнафталины.

Микрорганизм рода Pseudomonas E. Leibnitz с сотрудниками в опытах окислял ксиленолы до соответствующих оксикислот в процессе роста на среде с кукурузным экстрактом [38]:

Биогенное окисление нефтей различных по химическому составу В процессе окисления нефти большую роль играет взаимное влияние угдеводородных и неуглеводородных компонентов, входящих в её состав. При анаэробном и аэробном микробиальном разрушении независимо от типа нефтей повышается их плотность, увеличивается содержание смолисто-асфальтеновых соединений, серы и уменьшается концентрация парафиновых углеводородов в системе. При этом отмечено остаточное накопление нафтеновых углеводородов.

Рисунок 7 — Окисление 2-оксиметаксилола бактериями рода Pseudomonas

Снижение парафинового потенциала нефтей при биохимическом окислении происходит за счёт удаления из модельных систем н-алканов как веществ, преимущественно потребляемых микроорганизмами. Среди н-алканов бактериями лучше усваиваются низкомолекулярные соединения, что было доказано на углеводородах ряда от C₁₄ до C₂₀. Кроме того, не установлено какой-либо избирательности в биоокислении углеводородов с чётным или нечётным числом атомов C в молекуле.

От физиологических особенностей каждого рода микроорганизмов зависит направленность процесса деструкции индивидуальных углеводородов и их смесей, обладающих различной степенью устойчивости к окислению.

Изменение группового состава нефтей необходимо учитывать при разработке технологии очистки почв от нефтяного загрязнения.

Практическая помощь нефтяной микробиологии в решении этой проблемы заключается в выделении чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов, установлении их родовой принадлежности и степени активности в окислении нефтей и нефтепродуктов.

Таблица 1 — Классификация компонентов нефтей по их способности к биодеградации Наиболее активные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов, окисляющие в значительной степени устойчивые к биодеградации компоненты нефти, являются наиболее перспективными для создания на их основе биопрепаратов по очистке почв от нефтяного загрязнителя.

Исследование же способности микроорганизмов окислять конкретные классы углеводородов в составе нефтей, как было показано выше, позволяет в перспективе создавать биопрепараты целевого назначения.

1.4 Растительно-микробные системы для биоремедиации нефтезагрязненных почв

1.4.1 Ростстимулирующие ризосферные бактерии Ростстимулирующие ризобактерии (plant growth promoting rhizobacteria — PGPR) играют важную роль в адаптации растения к внешним воздействиям. Таксономически эти бактерии чрезвычайно разнообразны (наиболее изучены представители родов Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Psеudomonas и Bacillus). Они обитают в ризосфере (зона почвы, непосредственно соприкасающаяся с корнями), которая служит их основной экологической нишей с наиболее благоприятными условиями, и на поверхности корней. В ризосферу из корней активно поступают сложные смеси легкодоступных органических источников энергии и углерода, что обусловливает ее высокую микробиологическую активность и образование отличающихся от почвенного микробоценоза специфических ризосферных микробных сообществ. Разнообразие таких сообществ во многом определяется количественным и качественным составом корневых выделений, зависящим от вида, возраста и условий выращивания растения, а также от влияния комплекса почвенно-климатических факторов. В свою очередь, микробиологическая активность в ризосфере приводит к существенному изменению химических и физических свойств этой зоны и накоплению продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, биологически активных по отношению к растению. Для изучения взаимодействий растений с полезными формами бактерий в ризосфере продуктивна концепция, согласно которой ризобактерии образуют с растением единую растительно-микробную систему (ассоциацию) с новыми свойствами, детерминированными положительным взаимодействием партнеров.

В развивающемся устойчивом земледелии применение ризобактерий для улучшения роста и питания сельскохозяйственных культур служит одним из перспективных подходов. Однако механизмы взаимодействия компонентов растительно-микробных систем, условия реализации ростстимулирующего потенциала ризобактерий и критерии отбора наиболее эффективных ассоциативных штаммов во многом еще требуют фундаментального изучения.

1.4.2 Образование ассоциативного симбиоза Корневые экссудаты Важнейшим фактором образования ассоциативных симбиозов является выделительная функция корней растений.

Сведения о корневых выделениях пополнились в результате изучения их качественного состава. Большая серия работ продемонстрировала специфичность набора экссудатов в ризосфере у разных видов растений. Состав корневых выделений зависит также от стадии развития растения, условий роста, физико-химических свойств среды, в которой развивается корневая система. Корневые экзометаболиты проявляют неодинаковые физиологические свойства и представлены спектром органических соединений из разных классов. Это водорастворимые вещества, поступающие из корней в почву; высокомолекулярные полисахариды (муцигель), образующие тонкие слои на поверхности корней; отслаивающиеся клетки корневого чехлика, которые частично остаются в корневой зоне; отмирающие клетки эпидермиса; летучие и газообразные метаболиты прорастающих семян и корней.