Производство антибиотика Грамицидина С

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГБОУ ВПО КГМУ МИНЗДРАВА РФ Биотехнологический факультет Кафедра биологической и химической технологии КУРСОВАЯ РАБОТА по дисциплине Биотехнологические производства Тема: «Производство антибиотика Грамицидина С»

Выполнил: Завгородний В.В.

курс 4, группа 1

Руководитель: ассистент Едноровская О.В.

Курск-2014

Содержание Введение

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика готового продукта

1.2 Методы получения целевого продукта

1.3 Характеристика продуцента

2. ОРГАНИЗАЦИОННО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1 Характеристика условий культивирования

2.2 Технологическая схема получения целевого продукта

2.3 Выбор и обоснование оборудования. Аппаратурная схема получения целевого продукта

2.4 Мероприятия по обеспечению асептики в соответствии с требованиями GMP

3. Список литературы

Актуальность темы

: Термин «антибиотик» был предложен в 1942 г. С. А. Ваксманом для обозначения веществ, образуемых микроорганизмами и обладающих антимикробным действием. Впоследствии многие исследователи предлагали свои формулировки, вкладывая в них подчас слишком ограниченное содержание либо чрезмерно расширяя это понятие.

В настоящее время под антибиотиками понимают химиотерапевтические вещества, полученные из микроорганизмов или иных природных источников, а также их полусинтетические аналоги и производные, обладающие способностью избирательно подавлять в организме больного возбудителей заболеваний и (или) задерживать развитие злокачественных новообразований.

Антибиотики природного происхождения продуцируются различными группами микроорганизмов (чаще всего актиномицетами, реже бактериями), низшими растениями (дрожжами, водорослями, плесневыми грибами, высшими грибами), высшими растениями и животными организмами.

По характеру воздействия на бактериальную клетку антибиотики можно разделить на три группы:

— бактериостатические (бактерии живы, но не в состоянии размножаться),

— бактерициды (бактерии умертвляются, но физически продолжают присутствовать в среде),

— бактериолитические (бактерии умертвляются, и бактериальные клеточные стенки разрушаются).

По механизму биологического действия антибиотики делятся:

1. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной стенки (пенициллины, цефалоспорины, бацитрацин, ванкомицин).

2. Антибиотики, нарушающие функционирование цитоплазматической мембраны (полипептиды, полиены, грамицидин).

3. Антибиотики, разрушающие рибосомальные субчастицы и сдерживающие синтез белка (тетрациклины, хлормицетины, аминогликозиды, макролиды).

4. Антибиотики, избирательно подавляющие синтез нуклеиновых кислот:

— ингибиторы синтеза РНК (актиномицин, гризеофульвин, канамицин, неомицин, новобиоцин и др.);

— ингибиторы синтеза ДНК (брунеомицин, саркомицин).

Антибиотики обладают избирательным действием, т. е. активны только в отношении микроорганизмов при сохранении жизнеспособности клеток хозяина и действуют не на все, а на определенные роды и виды микроорганизмов. С избирательностью тесно связано понятие о широте спектра активности антибиотиков. Традиционно по спектру антимикробного воздействия антибиотики делятся на препараты узкого спектра действия и широкого:

1. Антибиотики узкого спектра действия действуют только определенный вид бактерий. К ним относятся пенициллин, оксациллин, эритромицин.

2. Антибиотики с широким спектром действия эффективны в уничтожении не исключительно грамположительных и грамотрицательных бактерий, но также спирохет, лептоспир, риккетсий, крупных вирусов (трахомы, пситтакоза и других). К ним относят группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, глициклин, метациклин, морфоциклин, доксициклин) и левомицетина.

Выражение величин биологической активности антибиотиков обычно производят в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или в 1 мг препарата (ед/мг). За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроба в определенном объеме питательной среды.

Целью курсовой работы является изучение культивирования антибиотика грамицидина С биотехнологическими методами.

Задачи курсовой работы:

— изучение характеристики грамицидина С

— изучение методов получения грамицидина С

— изучение характеристики продуцента

— изучение характеристики условий культивирования

— проектирование технологической схемы получения целевого продукта

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика готового продукта антибиотик грамицидин культивирование получение Грамицидин C — антибиотик тиротрициновой группы. Продуцируется споровой палочкой Bacillus brevis var. G.- B.

В промышленности получают синтетическим путём. Первый советский антибиотик, был выделен Г. Ф. Гаузе и М. Г. Бражниковой в 1942 году. Сыграл важную роль в спасении многих тысяч жизней на фронтах Великой Отечественной войны. Впоследствии он был вытеснен новыми антибактериальными средствами и незаслуженно забыт.

Обладает бактериостатическим (препятствующим размножению бактерий) и бактерицидным (уничтожающим бактерии) действием.

Эффективен в отношении стрептококков и стафилококков, а также возбудителей анаэробной инфекции и других микроорганизмов, преимущественно активен против грам-положительных бактерий. Микроорганизмы не развивают устойчивость к данному антибиотику.

Применяется при лечении гнойных и воспалительных инфекций кожи и мягких тканей, язв, пролежней, и при таких заболеваниях, как воспалительные заболевания уха, горла, стоматит, гингивит, конъюнктивит, кератит, остеомиелит (воспаления костного мозга и прилегающей костной ткани), блефарит, флегмона, фурункулёз, карбункулы. Применяется при ожогах кожи, а также как местное противозачаточное средство.

Форма выпуска — раствор или паста (в тубах или банках) для местного применения. Выпускается в виде ампул по 5 мл 2% стерильного спиртового раствора, защёчных таблеток. Усиливает эффекты других бактерицидных средств.

Предназначен только для местного применения. Внутривенное применение не допускается.

Имеет побочные эффекты — аллергические реакции (кожные высыпания и зуд, лихорадка, крапивница, отёк, контактный дерматит, анафилактический шок). Применение во время беременности и лактации нежелательно. Входит в Перечень ЖНВЛС.

Грамицидин С — антибиотик, нарушающий организацию липопротеидных систем и проницаемость клеток, создаваемую мембраной.

Степень этих нарушений зависит от концентрации антибиотика. Грамицидин медленно снижает поверхностное натяжение. Он может вступать в связь с клеточными мембранами. В основе механизма биологического действия грамицидина С лежит нарушение им состояния и функционирования мембран клеток в результате связывания антибиотика с мембранными компонентами. Это вызывает, с одной стороны, изменение проницаемости мембран и быструю потерю клетками жизненно важных соединений типа нуклеотидов, неорганического фосфора, аминокислот, а с другой — угнетение процесса энергетического обмена, особенно его начальной стадии — дегидрирования. Грамицидин С ингибирует активность ряда ферментов, локализованных в мембране (дегидрогеназы, оксидазы).

Так же грамицидин С является ионофором, то есть способны индуцировать проницаемость ионов через мембраны клеток; это послужило основой для их названия — антибиотики-ионофоры.

Обычно биологические мембраны непроницаемы для ионов К+. В опытах с митохондриями и клетками Streptococcus faecilis было показано, что в присутствии антибиотиков валиномицина или грамицидина С мембраны становятся проницаемыми для этих ионов, но не для ионов Na+ и Li+. Установлено, что подавление роста S. faecilis в присутствии валиномицина, грамицидина, нон-актина связано с потерей клеткой ионов К+, которая индуцируется этими антибиотиками. Помимо этого грамицидин С относится к антибиотикам ингибиторам окислительного фосфорилирования.

Способ определения активности грамицидина С.

Готовят бактериальную суспензию. Стандартный и испытуемый препараты грамицидина С в разных разведениях, помещают в кюветы люменометра и добавляют туда IIO 1 мл бактериальной суспензии. В течение 20 мин регистрируют свечение. В опытной пробе определяют степень падения люминесценции по сравнению со стандартом. В качестве тест-объекта используются суспензии Photobacterium Keiopnathi, что позволяет оценить активность антибиотика по степени падения люминесценции.

Культуру Photobacterium Keiopnathi выращивают на полусинтетической среде до достижения максимальной интенсивности свечения. Готовят бактериальную, суспензию путем центрифугирования и ресуспендироввния в фосфатно-солевом бульоне до концентрации около1• 10 кл/мл. Полученную суспензию хранят при +4 С до использования (не более 2-х суток). Для проведения анализов используют бактериальную суспензию, содержащую от 1• 10 до 2• 10 кл/мл.

Концентрацию грамицидина определяют следующим образом. Стандартный и испытуемый препараты грамицидина в разных разведениях помещают в кюветы люменометра" туда же добавляют по 1 мл бактериальной суспензии. В течение 20 мин регистрируют свечение на ленте самописца от всех кювет. Затем определяют степень падения люминесценции в опытной пробе по сравнению со стандартом.

Для получения исходного препарата индикаторных бактерий штамм Photobacterium Keiopnathi засевают в 100 мл полусинтической 4 среды. Колбу с культурой инкубируют при 28 С на качалке, регистрируя рост и развитие люминесценции. После достижения максимальной интенсивности свечения клетки отделяют от среды центрифугированием (5000 g, 10 мин) и суспензируют в 10 мл 0,1 M фосфатного буфера рН 7,1, содержащего 0,5 M NaC1.

Полученная таким образом суспензия содержит около 1• 10 кл/мл и может храниться без значительной потери люминесцентной активности в течение 2 сут при +4 С.

Количественное определение грамицидина основано на сравнении степени угнетения свечения разными, концентрациями стандартного и определяемого препаратов.

Исходную суспензию бактерий разводят в фосфатно-солевом буфере до 1 конечной концентрации 1• 10кл/мл. В кюветы наливают по 1 мл бактериальной суспензии и такое количество стандартного раствора антибиотика, чтобы его концентрация в кюветах составляла 20 ед/мл, 25 ед/мл, 30 ед/мл. В качестве опытного образца в кюветы с суспензией вносят известное количество того же стандартного раствора грамицидина. Все пробы стандартные в двух, а опытные в трех повторностях помещают в установку, в которой регистрируют люминесценцию в течение 20 мин на ленте самописца. При обработке результатов в качестве количественной меры степени угнетения свечения используют параметры, равные отношению свечения после 15 мин контакта бактерий с антибиотиками к его исходному уровню. Значения этого параметра усредняют по готовностям и заносят в таблицу.

По полученным значениям для каждого из экспериментов строят калибровочный график и по нему определяют расчетную концентрацию антибиотика в пробе.

Метод разведений.

Принципом методов разведений является определение количества антибиотика, которое полностью подавляет рост тест-культуры. При этом раствор анализируемого образца с неизвестным содержанием антибиотика и раствор стандарта с известным содержанием антибиотика разводят в геометрической прогрессии питательной средой, предварительно засеянной тест-культурой. По истечении необходимого времени инкубации определяют максимальное разведение образца и стандарта, которое ещё подавляет рост тест-культуры. Путём сравнения этих разведений вычисляют активность исследуемого образца. Вследствие того что оценку проводят по качественному признаку («растёт» -" не растёт"), этот метод не удовлетворяет первому из перечисленных выше требований. Вместе с тем главным преимуществом методов разведений является их высокая чувствительность, возможность определять очень малые количества антибиотиков, а в некоторых случаях — и короткое время (около 3 часов), необходимое для получения результатов.

При определении содержания антибиотиков в жидкостях тела методом серийных разведений можно использовать индикаторы, реагирующие на изменение рН или окислительно-восстановительного потенциала в процессе роста тест-микроба, например бромкрезоловый красный, метиленовый синий, тимоловый синий, водный синий или феноловый красный и др.

1.2 Методы получения целевого продукта Грамицидин С впервые выделен в СССР в 1944 г. группой Гаузе и Бражниковой нз штамма Baсillus brevis. В 1946 г. Синге с сотрудниками установили его первичную структуру. Молекула состоит из двух идентичных пентапептидов, соединенных между собой и образующих десятичленный цикл. Приведенное ниже строение антибиотика подтверждено Швицером и Зибером полным химическим синтезом.

В 1967 г. Ваки и Идзумия, проводя циклодимернзацню активированного производного пентапептида, помимо грамицидина 8 получили с 32%-ным выходом циклический пентапептид. Этот полуграмициднн 8 показал себя биологически неактивным.

А. Н. Белозерским и Т. С. Пасхиной и продолженное затем зарубежными исследователями, показало, что он представляет собой полипептид, дающий при гидролизе эквимолекулярную смесь пяти аминокислот L-лейцина, D-фенилаланина, L-пролина, L-валина и L-орни-тина. Этот пентапептид повторяется в молекуле грамицидина дважды, причем концы цепи из десяти остатков аминокислот замыкаются в одно гигантское кольцо. Таким образом, грамицидин С представляет собой циклический декапептид.

Почти одновременно с изложенным выше синтезом дипептидов было описано получение и двух пентапептидов б-валила, б-орнитила, б-лейцила, б-фенилаланила, б-пролина и б-валила, б-орнитил, б-лейцил, б-фенилаланил, б-пролин. Оба эти пентапептида очень близки в отношении своего строения к тому пентапептиду, который может образовываться в результате гидролиза грамицидина С. Для того чтобы иметь возможность осуществить их синтез, вначале были получены два трипептида, состоящих из б-лейцина, и соответственно б-фенилаланина и б-пролина, а затем эти трипептиды были сконденсированы с дипептидом, содержащим остатки б-валина, б-орнитина.

Синтез проводился, как и в цитированной выше работе через соответствующие карбобензоксипроизводные, но конденсация осуществлялась не через хлорангидриды, а через азиды.

Синтез грамицидина С включал в себя линейный декапептид с последовательностью аминокислотных остатков грамицидина С синтезирован в ряде лабораторий. Швицер и сотрудники разработали удовлетворительные методы циклизации линейных пептидов и этим путем получили грамицидин С. Таким образом, впервые был осуществлен полный синтез антибиотика циклопептидной природы. Исходные пептиды получали с использованием метода активированных эфиров. После превращения дипептида в соответствующий гидразид и каталитического гидрогенолиза трипептида их конденсировали. Затем продукт конденсации подвергали декарбобензоксилированию путем каталитического гидрогенолиза, после чего полученный пентапептид вновь защищали введением тритильной группировки.

Третий путь синтеза грамицидина С также предложен Швицером и Зибером. Поскольку отщепление азотозильной группы часто протекает с плохим выходом, то использовали другую комбинацию защитных групп, и в реакцию циклизации вводили пентапептид. Последний получали конденсацией гидролизом продукта конденсации в щелочной среде, взаимодействием полученного пептида с ди-(-нитрофенил)-сульфитом в пиридине с образованием соответствующего эфира и наконец отщеплением бутилоксикарбонильной группы под действием 3,4 н. раствора хлористого водорода в этилацетате. Продукт циклизация был очищен противоточным распределением (четыреххлористый углерод/метанол/вода, 10 9 1) и выделен в кристаллическом виде с 35%-ным выходом. Защитные группировки отщепляли путем обработки защищенного циклопептида бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте в течение 1 час 15 мин при 40° образовался с выходом 90%.

Эрлангер и сотрудники с целью изучения антимикробного действия линейных фрагментов грамицидина С осуществили синтез ряда их производных. Поскольку в этом случае не удалось выделить в достаточно чистом виде гидразид пентапептида, авторы предпочли синтезировать декапептид несколько иным путем, проводя конденсацию гидразида тетрапептида с эфиром гексапептида. Эфир декапептида и декапептид (были получены в кристаллическом виде лишь после хроматографирования на АlОз и флоризиле.

А. Н. Белозерский и Т. С. Пасхина провели обширное исследование состава и строения грамицидина-С. Из кислотного гидролизата грамици-дина-С они выделили и идентифицировали 5 аминокислот валин, лейцин, пролин, фенилаланин и орнитин. На основании полученных данных авторы пришли к выводу, что указанные аминокислоты входят в состав молекулы грамицидина и что грамицидин является пентапептидом. В нем были обнаружены свободные аминные группы (реакцией с азотистой кислотой) и свободная карбоксильная группа (титрованием спиртовой щелочью).

Проводя многократные опыты по выделению и очистке грамицидина, мы заметили, что основание антибиотика, и его хлористоводородная соль дают фракции, отличающиеся друг от друга по молекулярному весу и температуре плавления. Так, например, молекулярный вес грамицидина, рассчитанный на декапептид, составляет 1140 молекулярный вес, определяемый по Расту, 1060— 1340. Другими ученными выделена фракция основания грамицидина с мол. весом 1019 и т. пл. 256—258°, которая почти отвечает декапептиду. Далее выделены фракции, занимающие промежуточное положение, и, наконец, фракция грамицидина с молекулярным весом 382—400 и т. пл. 186—187,5. Эта фракция антибиотика как, но молекулярному весу, так и по температуре плавления не соответствует деканциклопептиду и приближается к пентапептиду.

Аналогичным путем был синтезирован пентапептид, содержащий остатокфенилаланина вместо D-аминокислоты, имеющейся в грамицидине G и в приведенном выше пентапептиде. При этом оказалось, что полученные пентапептиды обладают одинаковым антибактериальным действием (значительно меньшим, чем у циклического грамицидина), независимо от того, какой из оптических изомеров фенилаланина входит в состав их молекулы. Повидимому, активность антибиотиков-полипептиде связана с циклическим характером их структуры, а наличие остатка D-аминокислоты облегчает образование замкнутых форм из открытых.

При циклизации соответствующего пентапептида был также получен грамицидин С, а не циклопентапептид 1. На основании этих данных считают, что в синтетических циклопептидах всегда имеется четное число аминокислотных остатков.

Одновременно с биосинтезом одного пентапептида при участии идентичного мультифермента происходит образование аналогичного второго пентапептида. Два пентапептида затем соединяются, образуя циклический декапептид, названный грамицидином С.

Микроорганизмами вырабатывающими грамицидин С являются бактерии рода Bacillus brevis. Среди них лидирующее место занимает высокопроизводительный штамм 101.

Существующий периодический процесс получения грамицидина С при выращивании наиболее продуктивных штаммов Bacillus brevis, выбранный в качестве прототипа, который использовали для синтеза продукта при выращивании Bacillus brevis штамма 101, характеризуется тем, что производится одноразовая загрузка питательной среды в ферментер, инокуляция посевным материалом, культивирование при аэрации и перемешивании в течение 27 часов до достижения величины рН 6,0 и ниже.

Анализ этого способа показал, что ферментационная среда содержит весь запас питательных субстратов с момента посева. Следовательно, ранее при культивировании Bacillus brevis для роста и биосинтеза грамицидина С не использовали подпитки концентратами питательных растворов оптимизированного состава, как они использовались в. Питательная среда прототипа не оптимальна, поскольку недостаточна по отдельным элементам питания (фосфор и магний), и в то же время содержит в избытке другие (глицерин и щавелевокислый аммоний). В результате высокой ингибирующей концентрации глицерина и аминного азота (2,0−3,0 г/л) в среде рост продуцента замедлен. Вследствие недостатка минеральных компонентов концентрация биомассы составляла всего около 10 г/л в среднем и не более 15 г/л. Высокая концентрация молочной кислоты (10,5 г/л) способствует накоплению клонов, не продуцирующих грамицидин С. При выращивании продуцента на этой среде величину рН не регулировали, и она снижалась до значений ниже 6,0. Низкая скорость массопередачи по кислороду (1,28· 10 -2 г О2/л· мин) при аэрации 0,66 л/л· мин и перемешивании (259−303 об/мин) также не способствовала получению культуры с высокой концентрацией биомассы и продукта. По этой причине содержание грамицидина в культуре в лучшем случае составляло около 2 г/л. Этот метод был крайне неэффективным, и его усовершенствовалли, таким образом, что удалось получить более 3 г/л грамицидина с. С целью увеличения выхода грамицидина С при глубинном выращивании продуцента Bacillus brevis на синтетической среде выращивание производят на среде следующего состава:

— глицерин — 20 мл/л,

— пищевая 40% молочная кислота — 2−4 мл/л;

— автолизат дрожжей — 0,1 г/л (по аминному азоту);

— гидролизат казеина — 0,2 г/л (по аминному азоту);

— хлористый аммоний, NH4Cl — 0−3,4 г/л;

— двузамещенный фосфорнокислый аммоний, (NH4)2HPO4 (ДАФ) — 0,85−4,5 г/л;

— калий фосфорнокисный однозамещенный, KH2PO4 — 0−1,0 г/л;

— магний сернокислый, 7-водный, MgSO4· 7H2O — 0,9 г/л;

— натрий лимоннокислый, одноводный — 1,0 г/л.

Содержание в среде аминного (восстановленного) азота — 1,3−1,6 г/л.

Способ включает дополнительную подпитку концентрированным питательным раствором, в состав которого входят глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1: (0,008−0,032):(0,027−0,036):(0−0,008):(0,002−0,008), ввод которого производят при значениях аминного азота в культуральной жидкости ниже 1,4 г/л до достижения концентрации не более 1,75 г/л при ограничении роста недостатком кислорода в условиях плавного повышения интенсивности перемешивания по показателям скорости массопередачи кислорода с 0,25· 10−3 до 1,0· 10 -3 моль O2/л· мин и скорости перемешивания с 200 до 500 об/мин и поддержания парциального содержания растворенного кислорода в культуре, близкого к нулю (0−10%), поддержания значения рН на уровне 6,5−6,8 и при остановке процесса выращивания через 2−6 ч после начала стационарной фазы, о чем свидетельствует изменение концентрации биомассы (прирост или убыль) по оптической плотности, на величину не более чем на 1 г/л.

1.3 Характеристика продуцента

Brevibacillus brevis — грамположительные, анаэробные, спорообразующие бациллы обычно встречаются в почве, воздухе, воде, и в местах разложения органических веществ. Это редко, связанно с инфекционными заболеваниями. Антибиотики групп грамицидины и тироцидины впервые были выделены их этих бактерий.

Brevibacillus brevis представляют собой грамположительные палочки, t оптимального роста является 35−55°C. Это подвижные спорообразующие палочки которые обладают положительной активность на каталазу и желатин, но отрицательный на амилазу, казеин и индол. Большинство из них используют цитрат в качестве источника энергии. Некоторые штаммы способны окислять окись углерода в аэробных условиях.

Ранее известные как Bacillus brevis, виды были перенесены в род Brevibacillus в 1996 году.

2. ОРГАНИЗАЦИОННО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1 Характеристика условий культивирования Выращивание Bacillus brevis штамм 101 в ферментере емкостью 10 л. Характеристика посевного материала:

— объем 0,5 л,

— типичная морфология,

— биомасса 2,5−3,5 г/л,

— рН 6,4−6,7.

Таблица 1.

Состав среды для выращивания в ферментере

Рабочий объем ферментера 6 л, поэтому закладку компонентов на 6 л среды (с учетом ввода посевного материала) производили по табл.1.

Использовали концентрированный питательной раствор, в состав которого входили глицерин, пищевая 40%-ная молочная кислота, хлористый и двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний при соотношении концентраций глицерина, молочной кислоты, азота, фосфора и магния 1:0,009:0,038:0,008:0,008. Для поддержания рН на уровне 6,6−6,7 использовали 15% раствор едкого натрия. В случае необходимости и для предотвращения активного пенообразования добавляли пеногаситель лапрол, который не является компонентом питательной среды, до 1 мл/л культуральной жидкости. Среду, концентрат и раствор щелочи стерилизовали при температуре 120 °C в течение 30 мин.

Подачу концентрата осуществляли при снижении концентрации аминного азота ниже 1,4 г/л. Объем вводимого концентрата определяли, принимая во внимание, что подача 10 мл концентрата на 6 л вызывает повышение аминного азота в КЖ на 4,37· 10−2 г/л. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 об/мин до 472 об/мин, поддерживая рO2 на уровне 0−10%.

Таблица 2

Показатели процесса культивирования в ферментере емкостью 10 л

Данные табл.2 показывают, что выращивание продуцента в 10-литровом ферментере производили в течение 42 часов в условиях ограничения роста по кислороду. В процессе роста скорость перемешивания плавно увеличивали с 202 до 472 об/мин под контролем растворенного кислорода, удерживая рО2 на уровне 1,5−10%. Скорость массопередачи возрастала с 0,25· 10−3 моль O2/л· мин до 0,87· 10−3 моль O2/л· мин. В процессе роста, начиная с 7-го часа, в культуру вводили концентрат среды. Скорость подачи соответствовала потребностям культуры, о чем свидетельствуют низкие значения рO2 0−10% и концентрация аминного азота в культуре не выше 1,4 г/л. Это говорит о том, что удалось избежать ингибирования роста высокими концентрациями и ограничения роста недостатком питания.

Концентрацию водородных ионов в КЖ поддерживали введением 15%-ного раствора едкого натрия. По значениям концентрации биомассы, которую определили по оптической плотности, культура вышла в стационарную фазу роста на 39-й час роста. Выращивание было остановлено через 3 часа после прекращения роста. В результате была получена культура, содержавшая 29 г/л биомассы и 5,366 г/л грамицидина С с содержанием примесей 11,6% от содержания грамицидина С.

2.2 Технологическая схема получения готового продукта На ПО1

На ТП 1

На ПО 2

На ПО 3 В пр-во

2.3 Выбор и обоснование оборудования. Аппаратурная схема получения целевого продукта

Экспликация

Использование ферментатора для глубинного непрерывного культивирования продукта имеет ряд преимуществ, по сравнению с другими ферментаторами. Механическое перемешивание и непрерывная аэрация создают благоприятные условия для доступа питательных веществ и кислорода ко всем клеткам мицелия, обеспечивая одинаково благоприятные условия для роста и накопления продуктов метаболизма. Обязательным является условие соблюдения стерильности на всех этапах ферментационного процесса. Глубинный процесс более экономичен, так как при этом сокращается срок ферментации и увеличивается количество получаемого продукта. Непрерывное культивирование в 3—4 раза ускоряет адаптацию по сравнению со стационарной культурой.

На стадии фильтрации раствора используется фильтр-пресс. Основными преимуществами таких фильтров, являются:

1. высокое качество фильтрата;

2. возможность работы без подачи сжатого воздуха во время фильтрации и связанное с этим уменьшение расхода энергии; уменьшение расхода фильтровальной ткани благодаря работе без отдувки и наличию защитного слоя вспомогательного фильтрующего вещества.

2.4 Мероприятия по обеспечению асептики в соответствии с требованиями GMP

Изготовление стерильных лекарственных форм должно производиться в «чистых» помещениях. Это производственные помещения с чистотой воздуха, нормируемой по содержанию механических частиц и микроорганизмов.

При производстве стерильных лекарственных средств используются помещения разных классов чистоты. Всего 4 класса чистоты. На каждой стадия технологического процесса класс чистоты строго регламентируется. Например, в помещениях класса чистоты, А осуществляют:

· розлив растворов в ампулы, флаконы;

· фасовку стерильных порошков во флаконы;

· запайку ампул;

· загрузку ампул, флаконов на лиофилизацию;

· сборку стерилизующих фильтров и др.

В помещениях класса чистоты В:

· стерилизующую фильтрацию растворов,

· загрузку стерилизуемых в первичной упаковке растворов на стерилизацию, лиофильную сушку;

· приготовление, фасовку и укупорку нестерилизуемых в первичной упаковке лекарственных средств,

· сушку и упаковку технологической одежды и др.

В помещениях класса чистоты С:

· приготовление и предварительную фильтрацию растворов;

· выгрузку лекарственных средств после стерилизации;

· хранение лекарственных средств и вспомогательных материалов и др.

В помещениях класса чистоты D:

· просмотр, маркировку, упаковку готовой продукции;

· хранение готовой продукции Нестерильные лекарственные средства производятся в помещениях классов чистоты С и D.

При этом нормируется только содержание микроорганизмов в воздухе, количество механических частиц не нормируется. В помещениях класса чистоты D, где производятся стерильные лекарственные средства, допускается не более 200 микроорганизмов в 1 м³ воздуха, а в помещениях класса чистоты D, где производятся нестерильные лекарственные средстване более 500. Требования к производственным помещениям Все производственные помещения должны иметь гладкие внутренние поверхности (стены, пол, потолки) с минимальным количеством выступающих частей и ниш, должны быть непроницаемы для жидкостей и легко доступными для мытья и обработки дезинфицирующими средствами. К помещениям для изготовления стерильных лекарственных средств предъявляются дополнительные требования. Эти помещения должны быть:

· без деревянных поверхностей;

· стыки между стенами, потолками и потолками должны быть закругленной формы;

· подвесные потолки и фильтры тонкой очистки должны быть герметизированы;

· между помещениями различных классов чистоты должны быть переговорные устройства;

· вход персонала в «чистые» помещения должен осуществляться через воздушные шлюзы.

Требования к оборудованию:

· его поверхности должны быть гладкими, изготовленными из нетоксичного, стойкого к коррозии металла;

· доступными для мойки и обработки дезинфицирующими средствами или стерилизации;

· оборудование должно иметь регистрирующие устройства для контроля параметров процесса;

· должно быть снабжено устройствами сигнализации, извещающими о неисправности.

Подготовка производственных помещений к работе заключается в выполнении комплекса мероприятий:

· влажная уборка;

· дезинфекция;

· УФ-облучение.

Под подготовкой технологического оборудования подразумевается мойка и стерилизация отдельных частей или обработка внутренних и наружных поверхностей моющими и дезинфицирующими средствами.

Каждое предприятие должно иметь подробную программу проведения санитарных мероприятий, устанавливающую:

· перечень помещений и оборудования, подлежащих уборке и обработке,

· методы и периодичность их проведения;

· перечень инвентаря, материалов, моющих и дезинфицирующих средств;

· перечень сотрудников, выполняющих уборку и обработку помещений и оборудования.

Дезинфицирующие средства необходимо чередовать, чтобы предотвратить появление устойчивых к ним форм микроорганизмов.

Для достижения требуемой чистоты воздуха в производственных помещениях используют воздушные фильтры и УФ-облучатели. Последние представляют собой газоразрядные лампы низкого давления, излучающие УФ лучи с длиной волны 254 нм, соответствующей области наибольшего бактерицидного действия лучистой энергии.

Для очистки воздуха в производственных помещениях используют системы приточной и вытяжной вентиляции. Однако такие системы имеют ограниченную эффективность. Это связано с тем, что воздух с высокой скоростью подаётся в помещение через отверстия в стенах или потолке и удаляется через выпускные отверстия у пола. При этом в помещении возникает высокотурбулентный поток с перемешиванием слоев воздуха. Подающийся в помещение фильтрованный воздух смешивается с загрязненным воздухом, разбавляя его. При этом очистка воздуха от загрязнений не достигается, создается лишь избыточное давление, исключающее поступление загрязненного воздуха.

Наиболее эффективная очистка достигается при использовании устройств с ламинарным (слоистым) потоком воздуха. Ламинарный метод создания чистых пространств был разработан в 1961 году. В устройствах с ламинарным потокам вся масса воздуха, заключенная внутри пространства движется с одинаковой скоростью (около 0,5 м/с) параллельными слоями. Воздух, прошедший через префильтры и бактериальные фильтры, является, по существу, стерильным и вытесняет из ограниченного пространства через открытую сторону все взвешенные частицы. В рабочей зоне создается небольшое избыточное давление, исключающее попадание загрязненного воздуха из помещения. В ламинарных установках поток воздуха может иметь горизонтальное или вертикальное направление.

Воздушный поток, который всасывается внутрь такого шкафа, создает вакуумную завесу. Она уменьшает до минимума поступление аэрозоля из ламинарного шкафа в помещение. 75% от общего количества воздуха циркулирует внутри шкафа, а 25% выводится через микрофильтры в помещение или канал вытяжной вентиляции.

Ламинарные шкафы изготавливают из материалов, устойчивых к обработке антисептиками, например, из эмалированного стального листа, а рабочий стол — из нержавеющей стали. Передняя стенка рабочей камеры изготавливается из прозрачного, но не пропускающего ультрафиолет материала, например, поликарбоната или закаленного стекла.

Следует помнить, что любое ламинарное устройство не является средством стерилизации, оно лишь создает и поддерживает пространство, свободное от взвешенных частиц и микроорганизмов.

Рассмотренные схемы представляют собой схемы ламинарных шкафов, т. е. небольших пространств под ламинарным потоком.

В настоящее время реальностью являются целые"чистые" помещения, т. е. комнаты, которые впервые нашли применение на предприятиях электронной промышленности и на предприятиях по производству полупроводниковых приборов, а сейчас используются и в фармацевтической промышленности.

Следующий источник загрязнения лекарственных средств — персонал. ГОСТ 42–510−98 определяет требования к личной гигиене персонала, производственной одежде, а также обязанности персонала «чистых» помещений, например:

· ограничить перемещения в помещениях классов чистоты В и С;

· не наклоняться над открытым продуктом и не прислоняться к нему;

· не поднимать и не использовать предметы, упавшие на пол;

· избегать разговоров на посторонние темы и т. д.

1. http://www.freepatent.ru/patents/2 447 143

2. http://www.russian-chemistry.ru/medications/359

3. http://www.findpatent.ru/patent/125/1 255 920.html

4. http://knowledge./medicine/2c0b65625b3ac68a5d43b89521306c26₀.h tml

5. http://chem21.info/info/1 218 479/

6. http://prostuda.biz/book/576-osnovy-ucheniya-ob-antibiotikax/10-glava-6-vydelenie-producentov-antibioticheskix-veshhestv-i-metody-opredeleniya-ix-biologicheskogo-dejstviya-puti-povysheniya-antibioticheskoj-produktivnosti.html

7. http://www.5rik.ru/better/article-182 309.htm

8. http://referat7.ru/neo/source/edu-content-121 372.html

9. https://ru.wikipedia.org/wiki/%C3%F0%E0%EC%E8%F6%E8%E4%E8%ED_ %D1

10. http://prostuda.biz/book/576-osnovy-ucheniya-ob-antibiotikax/17-glava-12-xarakter-i-mexanizm-biologicheskogo-dejstviya-antibiotikov.html

11. http://en.wikipedia.org/wiki/Brevibacillus_brevis

12. http://www.scienceforum.ru/2014/598/952

13. http://medbe.ru/materials/mikrobiologiya-i-biotekhnologii/sistemy-glp-i-gmp-v-svyazi-s-kachestvom-biotekhnologicheskikh-produktov/

14. Антибиотики-убийцы: [история открытия, польза и вред, противопоказания], Москва: Эксмо, 2007 — 136 c.

15. Антимикробная химиотерапия: Материалы цикла усовершенствования врачей / Кафедра клинической фармакологии Рос. гос. мед. ун-та [и др.]; Под ред. В. П. Яковлева, М.: Центр по биотехнологии, медицине и фармации, 2002 — 81 с.

16. Виктор Корчагин и Александр Домогаров «Трансдинамическое понимание элементарных медицинских терминов»; издательство «Терра», г. Набережные Челны, 2003 — 98−101 с.

17. Виктор Новосельцев, Наталья Дерганосова «Анатомическое моделирование динамики биологических систем»; издательство «Кварта», Воронеж, 2003 — 66 с.

18. Возникновение и развитие химиотерапии, Зеленин К. Н. — 93 с.

19. Егоров Н. С., Баранова И. П. бактериоцины. Образование, свойства, применение. Антибиотики и химиотерапия, 2000 — 33−40 с.

20. Номера журнала «Человек и наука»: № 4/2001; № 8/2002. — 13−16 с.

21 .Организация рациональной антибиотикотерапии / И. С. Мылникова, М.: Изд-во ГРАНТЪ, 2001 — 152 с.

22. Основы противоопухолевой химиотерапии, Корман Д. Б. Издательство: Практическая медицина, 2006 — 211 с.

23. Сорокина Т. С. Истрия медицины: учебник для студ. высш. мед. учеб. заведений. — 3-е изд. — М.: Академия, 2004. — 560 с.