Другие серологические методы диагностики гриппа и других ОРВИ

Для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, определения природы эпидемических вспышек и этиологической структуры ОРВИ, мониторинга эпидемического процесса, а также для оценки иммуногенной активности гриппозных вакцин используются такие серологические реакции, как реакция торможения гемагглютинации (РТГА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) для диагностики гриппа Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител, содержание которых определяется титрованием с внесением заданной дозы вируса (рис. 10).

Рис. 10. Постановка РТГА для диагностики гриппа (фото Лисицына Д.И.)

При этом диагностика заболевания осуществляется на основании 4-х кратного и более увеличения титров антител в сыворотке больного, на стадии выздоровления (не ранее 10−14 дня болезни) при сравнении с сывороткой, полученной в начале (первые 3−4 дня) заболевания[3].

ПЦР диагностика гриппа и других ОРВИ

В последние годы для диагностики инфекционных заболеваний все большее применение находит метод амплификации нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР). В результате амплификации концентрация специфических геномных последовательностей возрастает в миллион раз.

Использование ПЦР для идентификации инфекционных агентов представляет интерес в силу ее высокой чувствительности и специфичности. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК (рис. 11).

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР — диагностика позволяет обнаруживать наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность метода составляет 10−1000 клеток в пробе. Материал для анализа может быть получен из любых тканей и жидкостей организма.

Сущность метода ПЦР-диагностики

Под амплификацией понимают умножение определенного гена или его фрагмента (рис.12).

Рис. 12. Этап амплификации по конечной точке на приборе Maxygene (фото Лисицына Д.И.).

Типичный процесс ПЦР заключается в большом количестве циклов синтеза специфической последовательности ДНК, при этом каждый цикл состоит из трех последовательных этапов:

Денатурация. Первый этап амплификационной системы ПЦР — это тепловая денатурация образца ДНК в результате повышения температуры в реакционной пробирке до 95 градусов. Кроме исходной ДНК, в реакционной пробирке содержится избыточное количество двух нуклеотидных праймеров, термостабильная ДНК полимераза и четыре дезоксирибонуклеотида. Высокая температура поддерживается в течение 1 минуты (рис. 13).

Ренатурация. На втором этапе температура в смеси медленно понижается до 55 градусов. На этом этапе праймеры спариваются с комплементарными им последовательностями в исходной ДНК.

Синтез. На третьем этапе температура поднимается до 75 градусов. Она является оптимальной для каталитической активности термостабильной ДНК полимеразы. Синтез ДНК инициируется с 3-х гидроксильного конца каждого праймера[15].

Каждый этап и смена температуры, необходимая для цикла ПЦР, обычно осуществляются в автоматическом программируемом нагревательном блоке, в котором находятся реакционные пробирки. Каждый цикл обычно продолжается 3−5 минут.