Подготовка исходного материала

Для успешного выполнения работ по микроклональному размножению необходимо соблюдать следующую технологическую цепочку, которая предусматривает стерильность получения исходных эксплантов и дальнейшую работу с ними в асептических условиях: мытье > сушка химической посуды > стерилизация посуды и других необходимых материалов сухим воздухом > приготовление искусственных питательных сред > их стерилизация под давлением в автоклаве > размножение растительного материала в условиях in vitro > получение корнесобственных микрорастений in vitro.

Инициация культуры in vitro

Для введения в культуру in vitro отбирают здоровые растения с типичными сортовыми признаками. В качестве экспланта используют апикальные меристемы. Очень важное значение при этом имеет размер экспланта: чем меньше его величина, тем большая вероятность получения абсолютно здорового материала. Оптимальный размер экспланта для винограда 0,2−0,3 мм.

Жизнеспособность апексов винограда в зависимости от срока их вычленения

Известно, что успех регенерации апикальных меристем в условиях in vitro зависит от срока их вычленения [7−11].

Апексы винограда можно вводить в культуру in vitro в следующие сроки:

• 1-й срок — февраль-март. При этом заготовленные с осени черенки винограда предварительно выдерживают в течение суток в растворе в-индолилуксусной кислоты (200 мг на 1 л Н ₂О), а затем ставят для проращивания в сосуды с водой или влажными опилками и оставляют в теплом помещении. Затем из проросших почек вычленяют меристемы и высаживают их на искусственную питательную среду in vitro;
• 2 -й срок — июнь — период активного роста;
• 3-й срок — август — период вторичного роста.

Однако регенерационная способность меристематических верхушек заметно колеблется от срока их вычленения и посадки в условия in vitro (табл. 1).

Таблица 1. — Выход пробирочных растений винограда в зависимости от срока посадки.

Таким образом, оптимальными сроками ввода апикальных меристем в культуру in vitro являются февраль-март и июнь, где выход регенерантов составляет 97,5 и 96,7% соответственно.

Рекомендуется следующий порядок подготовки эксплантов.

• 1. Из отобранных растений или пророщенных черенков отчленяются верхушки размером 1,0−1,5 см.
• 2. Для стерилизации верхушки помещаются в марлевые мешочки, этикетируются и промываются в слабом растворе моющего препарата тест-гель. Затем проводится промывка дистиллированной водой до полного очищения от моющего средства.
• 3. Промытый растительный материал переносится пинцетом в стаканы с крышкой и проводится стерилизация его при постоянном встряхивании по схеме:
  • § хлорсодержащий препарат «Белизна» в пропорции 1: 2,5 Н ₂О — 4 минуты или
  • § йодид ртути 0,1% раствор — 4,5 минуты с последующей отмывкой стерильной дистиллированной водой 5 раз по 5 минут. При этом в последнюю порцию промывочной воды добавляется цифотаксима натриевая соль из расчета 5 мг на 300 мл Н ₂О, что снижает риск инфицирования эксплантов на 35−40%.

Экспланты вычленяются в асептических условиях в ламинарных боксах под бинокулярным микроскопом (МБС-1) при 7-кратном увеличении с помощью скальпеля и пинцета на стерильных бумажных матрасиках.

Культивирование эксплантов проводится в пробирках размером 40−32 мм в специальных светозалах на светоустановках при температуре + 24° С и 16-часовом освещении с интенсивностью 6 тыс. люкс.

На этапах ввода в культуру in vitro и при последующем микроразмножении проводятся наблюдения за развитием регенерантов с периодичностью 10 дней.

При этом учитываются:

• 1) гибель эксплантов — сразу после посадки, до того как они начали развиваться или же вследствие занесения на питательную среду грибковой или бактериальной инфекции;
• 2) фаза вытягивания точки роста — начинается рост оставшихся и вновь образующихся листовых примордиев;
• 3) коэффициент размножения — количество микрорастений, развившихся из одного экспланта;
• 4) при укоренении полученных микрорастений in vitro проводится измерение длины корней и подсчет числа корешков.