Анаэробная биодеградация органических соединений

Нарастающая проблема загрязнения окружающей среды различными отходами может быть решена развитием более экологически чистых технологий. Однако, в развивающихся странах, на которые приходится все большая часть объемов общемирового производства и потребления, данная проблема становится все более острой. Значительное количество поллютантов органической природы являются биоразлагаемыми и могут быть частично ликвидированы в ходе самовосстановления загрязненных экосистем, являясь при этом объектом экологической биотехнологии. Основой экологической биотехнологии является управляемая система биологических процессов, обеспечивающая максимальную эффективность метаболизма молекул поллютанта. В зависимости от состава отходы могут быть подвержены биологической очистке с различной степенью эффективности в зависимости от наличия в среде очистки конечных акцепторов электронов, в том числе, молекулярного кислорода. Некоторым типам поллютантов, например, углеводородам, для эффективной биодеградации требуется молекулярной кислород как элемент катаболической модификации предельно восстановленных атомов углеродной цепи. Утилизация же углеводных молекул может происходить в полностью анаэробных условиях. В случае использования микробного топливного элемента, проблема конечных акцепторов электронов в восстановительной зоне решается наличием электропроводящей поверхности анода, объединенного внешней цепью с расположенным в окислительной зоне катодом. При этом, зоны должны быть разделены протонообменной системой. Разобщение восстановительной и окислительной зон обеспечивает возможность генерации во внешней цепи электрического тока, который может быть накоплен и использован для питания различных маломощных потребителей. микробный топливный анаэробный утилизация Использованные в работе микробные топливные элементы принадлежали к мембранному типу, их объем, устройство и состав элементов определялись задачами исследования (0,1 — 17,2 л). В качестве ионселективной системы использовали перфторированную мембрану МФ-4СК, в качестве электродного материала — углеродный войлок НТМ-200М. Катодная камера была выполнена по принципу воздушного катода, смачивание катода осуществлялось за счет капиллярных сил, принудительная аэрация не применялась. В качестве католита использовали дистиллированную воду.

Измерение ХПК в содержимом анодной камеры МТЭ проводили в соответствии с ПНД Ф 14.1:2.100−97.

Измерение тока и напряжения проводили с использованием потенциостата-гальваностата «Элинс» Р-8, а также вольтметра и амперметра.

Микроскопическое исследование электрогенной биопленки проводили на микроскопе Olympus CX41, оснащенном приставкой для люминесцентной микроскопии. Окрашивание микропрепаратов осуществляли акридиновым оранжевым.

Кубанский государственный университет традиционно выступает лидером в исследованиях по микробной биодеградации техногенных отходов на Юге России. Собственная добыча углеводородов на территории края и транзитные магистральные нефтепроводы к черноморским терминалам создали в регионе зоны хронического и аварийного загрязнения такими органическими поллютантами, как нефтепродукты. В условиях высокой плотности населения и необходимости сохранения уникальных кубанских чернозёмов, масштабное применение физических и химических методов ликвидации нефтеотходов затруднено. Экологичные биологические методы очистки доказали свою высокую эффективность. На кафедре генетики, микробиологии и биотехнологии была создана уникальная для региона коллекция бактерий-нефтедеструкторов [1], служащих основой для инновационных технологий микробной ремедиации в условиях Юга России [2, 3, 4, 5, 6, 7]. Эффективная деятельность по ликвидации нефтяных загрязнений, в том числе и сотрудниками КубГУ, повышение экологических требований к нефтедобыче привели в итоге к значительному снижению объёмов углеводородсодержащих отходов на территории Кубани.

Опыт, полученный в работах по микробной деградации нефтеотходов, позволил научному коллективу КубГУ начать параллельное развитие темы биодеградации органических отходов при помощи технологии микробных топливных элементов [8, 9]. В условиях развитого агропромышленного комплекса Краснодарского края, высокого уровня урбанизации образуется большое количество жидких и твёрдых органических отходов различного происхождения, в частности, сточные воды производственных предприятий, коммунальные ТБО, канализационные стоки и другие. Дополнение традиционных методов очистки анаэробным биоразложением в МТЭ не только снизит уровень токсического прессинга на окружающую среду, но и позволит получать дополнительную электроэнергию. Исследователями показана возможность масштабируемого получения энергии при помощи природных электрогенных микробов из сточных вод различного происхождения, содержащих различные поллютанты [10].

Химический состав углеводородов, в случае алканов выражающийся формулой C_nH_2n+2 обусловливает их биологическую устойчивость в местах залегания, а также в иных анаэробных экотопах, где нефтепродукты могут присутствовать уже в качестве загрязнителя (донные отложения прудов-отстойников, в нижних горизонтах шламовых амбаров и грунтовых карт). Это связано с ограниченностью биохимических превращений углеводородной молекулы в условиях недостатка кислорода. Механизмы биодеградации алифатических цепочек углеводородов связаны, в первую очередь, с образованием у одного из углеродных атомов ковалентной связи с атомом кислорода при участи оксигеназ. Для данного процесса, как и для последующего в-окисления жирных кислот, служащего основным путем дальнейшего окисления насыщенной линейной углеродной цепочки, в конечном итоге, требуется молекулярный кислород. Данная потребность биологических систем в кислороде как элементе модификации органической молекулы, обеспечивающем перераспределение заряда по молекуле, на стадии дыхательной цепи дополняется потребностью в конечном акцепторе электронов и протонов.

Таким образом, молекулярный кислород, присутствующий в зоне биоремедиации в необходимом количестве, зачастую является лимитирующим фактором при микробиологической деградации углеводородных поллютантов. Характерно, что зона биоремедиации, включающая клетки бактерий, биогенные макрои микроэлементы, воду, растворенные газы и источник углерода и энергии должна рассматриваться как гомогенная система в части объединения окислительных и восстановительных реакций, формирующих катаболизм углеводородов. Все реакции происходят внутри или вблизи бактериальной клетки, освобождающаяся в ходе разложения молекулы субстрата энергия используется в конструктивном метаболизме микроорганизма, а также рассеивается в пространстве.

Несмотря на то, что анаэробная утилизация нативных углеводородов значительно ограничена особенностями биохимии их микробного катаболизма, в 2013 году канадские исследователи обнаружили генерацию тока в мембранном топливном элементе при очистке жидких промышленных отходов, содержащем нафтеновые кислоты [11]. Данные соединения имеют в своем составе карбоксильную группу, что позволяет рассматривать их как гомолог некоторых продуктов аэробного биоразложения алканов, прошедших лимитирующие стадии первичного оксигенирования. Нафтеновые кислоты, в виде солей будучи водорастворимыми в слабощелочной среде, имели достаточную биологическую доступность для питания электрогенной анаэробной популяции в анодной камере МТЭ.

Потребление смешанными культурами органических загрязнителей, представленных в сточных водах, лежит в основе технологий анаэробной очистки жидких стоков [10, 12]. Состав сточных вод включает сбраживаемые органические соединения, а также разнообразные неорганические акцепторы восстановительных эквивалентов, обеспечивающие анаэробное дыхание микробных культур (нитратное, серное, сульфатное, железное и др.). Благодаря этому, органические соединения неуглеводородной природы успешно подвергаются биодеградации как в аэробных, так и в анаэробных условиях. При этом, часть энергии, заключенной в органическом субстрате, рассеивается в пространстве, поскольку реакции окисления субстратов и восстановления экзогенных и эндогенных акцепторов происходят в гомогенной системе и объединены пространственно.

Технология микробных топливных элементов основана на разобщении гетерогенной системы внешней электрической цепью и протонообменной мембраной на две зоны — анодную и катодную. В анодной зоне, где обеспечены бескислородные условия, происходят биологические реакции анаэробного окисления органических веществ. Микроорганизмы, осуществляющие данные реакции, находятся в планктонном состоянии, либо иммобилизованы на поверхности анода. Электроны поступают на анод и передаются по внешней электрической цепи на катод, отделенный от анодной зоны мембраной типа МФ-4СК, NAFION либо иной протонселективной системой. На катоде происходит восстановление молекулярного кислорода с участием протонов, прошедших протонообменную систему из анодной камеры и электронов, подведенных по внешней цепи. Проходящий при этом по внешней цепи электрический ток может быть использован для совершения полезной работы [8].

Таким образом, разобщение окислительной и восстановительной зон в микробном топливном элементе обеспечивает возможность выделения части энергии, освобождающейся при анаэробной биодеградации органических веществ в форме электрической энергии. Наличие анода-токоотвода, не требующего регенерации при выводе избыточных эквивалентов из восстановительной зоны, а также протонообменной системы, обеспечивает повышенную интенсивность анаэробного биоразложения в анодной камере МТЭ по сравнению с классическим метантенком.

Для оценки возможности выработки электроэнергии в микробном топливном элементе, на основе отечественных импортозамещающих комплектующих (перфторированная мембрана МФ-4СК [13, 14], углеродный войлок НТМ-200М) были изготовлены модели микробных топливных элементов мембранного безмедиаторного типа. В целях оптимизации конструкции была применена концепция воздушного анода [15], заключающаяся в редукции катодной камеры до пленки капиллярной воды, смачивающей развитую поверхность катода в среде атмосферного воздуха. Экспериментальным путем была установлена большая сравнительная эффективность воздушного катода по сравнению с обычной (неаэрируемой принудительно) катодной камерой, заполненной католитом.

Для определения мощностных характеристик экспериментального было исследовано влияние величины сопротивления на электрические характеристики. По литературным данным [8, 16], для МТЭ аналогичного размера величина оптимальной нагрузки варьирует в диапазоне от десятков до тысяч Ом. После подключения во внешнюю электрическую цепь магазина сопротивлений по схеме, приведенной на рисунке 1, снимались значения U и I. Через эмпирически установленные равные промежутки времени (120 с), достаточные для стабилизации показателей, ступенчато увеличивали сопротивление на 1 кОм в диапазоне (0 — 10) кОм. Для вычисления были использованы формулы (1) и (2):

P=IU (1).

P=U²/R, (2).

где Р — мощность;

I — сила тока;

U — напряжение;

R — сопротивление.

В общем случае, мощность тока возрастала по мере увеличения R в данном диапазоне. Аналогичное измерение выходной мощности в диапазоне 10 — 19 кОм показало снижение выходной мощности МТЭ при дальнейшем повышении величины сопротивления.

Проведенное по такой же схеме исследование ячейки большого объема показало значительное увеличение выходной мощности МТЭ, демонстрирующее близкую к линейной зависимость электрической мощности от объема анодной камеры и площади токособирающей поверхности анода.

Максимальная теоретически достижимая разность потенциалов между анодом и катодом составляет около 1,1 В [10]. На практике, на исследуемых лабораторных моделях МТЭ было достигнуто напряжение 0,7−0,8 В, что согласуется с литературными данными, ограничивающими эмпирически достижимый порог напряжения сходными величинами [8].

Для оценки возможности анаэробной очистки разных типов жидких отходов с помощью МТЭ исследовали изменения химического потребления кислорода (ХПК) в режиме короткого замыкания. Измеряли концентрацию субстрата до и после инкубации в анодной камере МТЭ. В ходе эксперимента была отмечена генерация электрического тока.

Как видно из таблицы, исследуемый МТЭ при выработке электрической энергии обеспечил снижение концентрации субстрата в 1,44 — 7,70 раза в зависимости от типа отходов, что показывает возможность использования данной технологии для очистки широкого круга жидких органических отходов. При этом, вырабатывающаяся энергия может быть накоплена и использована для практических целей с использованием соответствующих устройств.

Известно, что электрогенное микробное сообщество, формирующееся на аноде (анодофильное сообщество) и в непосредственной близости с ним функционально связано с токособирающей поверхностью процессом передачи избыточных восстановительных эквивалентов [16, 17, 18, 19 ]. Этот процесс может осуществляться посредством соединений (медиаторов), обеспечивающих передачу заряда от клетки к материалу анода. Медиаторы могут быть экзогенными (метиленовая синь и др.), либо эндогенными, являющимися продуктом метаболизма анаэробно катаболизирующих органические вещества бактерий. При проточном нециклическом режиме работе МТЭ, как планктонные клетки, так и медиаторы могут вымываться из анодной камеры, в связи с чем значительную роль играют культуры, способные к непосредственной передачи заряда на анод, в том числе, при помощи «нанопроводов» или выступов клеточной поверхности [8, 17]. Данные микроорганизмы формируют микроколонии на поверхности анода. Для их визуализации, а также оценки взаимосвязи присутствия биопленок на аноде и наличия электрогенеза, провели микроскопическое исследование материала анода. Использованный в качестве анода углеродный войлок НТМ-200М представлен рыхло расположенными карбонизированными (графитированными) волокнами диаметром около 20 мкм. Был проведен сравнительный анализ поверхности волокон двух различных анодов. Были подготовлены два аналогичных МТЭ — электрогенного (эксперимент) и неэлектрогенного (контрольная анодная камера). Конструктивно они отличались отсутствием у контрольного МТЭ протонообменной системы и замкнутой через сопротивление внешней электрической цепи между анодом и катодом. Строение анодной камеры, форма, размер и материал анода, химический состав анолита и инокулят были сходными. Экспериментальная ячейка генерировала напряжение около 0,4 В (без нагрузки). О формировании биопленки на аноде косвенно судили по установлению стабильного электрического тока во внешней цепи. Сравнение количества бактериальных клеток на единицу поверхности углеродного волокна показало, что колонизация подключенного к внешней электрической цепи анода происходила по меньшей мере на два порядка интенсивнее по сравнению с контрольным образцом, когда помещенный в анодную камеру углеродный войлок служил носителем случайным образом адсорбционно иммобилизующихся клеток.

Таким образом, микробный топливный элемент мембранного типа, использующий в качестве протонообменной системы мембрану МФ-4СК, а в качестве электродного материала углеродный войлок, способствующий эффективной колонизации анодофильной микрофлорой, может быть использован для создания систем энергоэффективной анаэробной биоочистки широкого круга жидких органических отходов.

• 1. Карасёва, Э. В. Нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythropolis B2 как основа создания биопрепарата для ликвидации углеводородных загрязнений и рекультивации земель / Э. В. Карасёва, Н. Н. Волченко, А. А. Худокормов, А. А. Самков, С. Г. Карасёв, Е. В. Батина, С. М. Самкова // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. — 2012. — № 83. — С. 154−167.
• 2. Пат. 2 311 237 Российская Федерация, МПК⁷ В09С1/10, С12N1/38. Способ микробиологической очистки нефтяных шламов и загрязненного нефтепродуктами грунта (варианты) / Карасева Э. В., Самков А. А. и др.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «КубГУ». — № 2 006 114 976/13; заявл. 02.05.2006; опубл. 27.11.2007, Бюл. № 33.
• 3. Пат. 2 317 162 Российская Федерация, МПК⁷ В09С1/10. Препарат для микробиологической очистки нефтяных шламов и загрязненного нефтепродуктами грунта / Карасева Э. В., Самков А. А. и др.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «КубГУ». — № 2 006 115 032/13; заявл. 02.05.2006; опубл. 20.02.2008, Бюл. № 5.
• 4. Пат. 2 365 438 Российская Федерация, МПК7 B09C1/10, C02F3/34,C12N1/26. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов / Карасева Э. В., Самков А. А. и др.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «КубГУ». — № 2 006 121 832/13; заявл. 21.06.2006; опубл. 27.08.2009, Бюл. № 24.
• 5. Пат. 2 320 715 Российская Федерация, МПК⁷ C12N1/20, C12N1/26, C12Q1/02, C12Q1/04. Способ отбора нефтеокисляющих бактерий-продуцентов биосурфактантов / Волченко Н. Н., Самков А. А., Карасева Э. В.; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «КубГУ». — № 2 006 115 033/13; заявл. 02.05.2006; опубл. 27.03.2008, Бюл. № 9.
• 6. Данилец, В. М. Комплексная биотехнология ликвидации и рекультивации накопителей опасных отходов в инфраструктуре нефтеперерабатывающего предприятия // В. М. Данилец, Э. В. Карасева, А. А. Самков, С. М. Самкова, А. А. Худокормов, Н. Ю. Алешина, С. А. Калитка, В. Г. Карпов // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. — 2011. — № 8. — С. 13−20.
• 7. Самков, А. А. Взаимосвязь конвективного переноса углеводородокисляющих микроорганизмов со степенью гидрофобности клеток и эффективностью биоремедиации / А. А. Самков, Э. В. Карасёва // Биотехнология. — 2007. — Т. 69. — № 4.
• 8. Logan, Bruce E. Microbial fuel cells / Bruce E. Logan // New Jersey, USA.: John Wiley & Sons, Inc. — 2008. — 200 p
• 9. Дебабов, В. Г. Производство электричества микроорганизмами / В. Г. Дебабов // Микробиология. — 2008. — Т. 7. — № 2. — С. 149−157.
• 10. Калюжный, С. В. Микробные топливные элементы /С.В. Калюжный, В. В. Федорович // Химия и жизнь. -2007. — № 5. — С. 36−39.
• 11. Jiang, Y Coupling bioelectricity generation and oil sands tailings treatment using microbial fuel cells / Yaxin Jiang, Ania C. Ulrich, Yang Liu // Bioresource Technology. — 2013. — V. 139. — P. 349−354.
• 12. Liu, H. Production of electricity during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell / Hong Liu, Ramanathan Ramnarayanan, Bruce E. Logan // Environ. Sci. Technol. — 2004. — V. 38. — P. 2281−2285.
• 13. Кононенко, Н. А. Электрокинетические явления в сульфокатионовых мембранах с ионами тетраалкиламмония / Н. А. Кононенко, Н. П. Березина, С. А. Шкирская // Коллоидный журнал. — 2005. — Т. 67. — № 4. — С. 485−493.
• 14. Сычeва, А.А. Р. Сорбционные и проводящие свойства перфторированных мембран МФ-4СК в водных растворах, содержащих ионы фениламмония / А.А.Р. Сычeва, И. В. Фалина, Н. П. Березина // Электрохимия. — 2009. — Т. 45. — № 1. — С. 114−121.
• 15. Logan, E. Bruce Microbial fuel cells: Methodology and technology / Bruce E. Logan, Bert Hamelers, Rene Rozendal, Uwe Shrхder, Jьrg Keller, Stefano Freguia, Peter Aelterman, Willy Verstraete, Korneel Rabaey // Environ. Sci. Technol. — 2006. — V. 40. — № 17. — P. 5181−5192.
• 16. Logan, E. Bruce Graphite fiber brush anodes for increased power production in air-cathode microbial fuel cells / Bruce E. Logan, Shaoan Cheng, Valerie Watson, Garett Estadt // Environ. Sci. Technol. — 2007. — V. 41. — P. 3341−3346.
• 17. Logan, E. Bruce Electricity-producing bacterial communities in microbial fuel cells / Bruce E. Logan, John M. Regan // Trends in Microbiology. — 2006. — V. 14. — №. 12. — P. 512−518.
• 18. Logan, E. Bruce Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells / Bruce E. Logan // Nat. Rev. Microbiol. — 2009. — V. 7. — P. 375−381.
• 19. Kiely, D. Patrick Long-term cathode performance and the microbial communities that develop in microbial fuel cells fed different fermentation endproducts / Patrick D. Kiely, Geoffrey Rader, John M. Regan, Bruce E. Logan // Bioresource Technology. — 2011. — V. 102. — P. 361−366.