Применение спектроскопии ядерного магнитного резонанса для определения биологически активных веществ в растениях-продуцентах в культуре in vitro и in situ

Растения являются единственными в природе организмами, способными синтезировать из неорганических веществ органические, необходимые для жизнедеятельности человека и животных. Другие живые организмы этим свойством не обладают. Следовательно, растение представляет собой сложную лабораторию, в которой из углекислого газа, воды и неорганических веществ синтезируется огромное количество различных соединений.

Целью дальнейших исследований является теоретическое обоснование и экспериментальная разработка основных принципов применения спектроскопии ядерного магнитного резонанса в фармацевтическом анализе для стандартизации и оценки качества БАВ.

Для достижения выше поставленной цели исследования необходимо будет решить следующие задачи:

• 1. Изучить основные направления развития, выявить и обосновать приоритетные области применения спектроскопии ядерного магнитного резонанса в анализе БАВ;
• 2. Получить спектры ЯМР наиболее распространенных БАВ в одинаковых условиях;
• 3. Провести и уточнить отнесение ряда сигналов в спектрах ЯМР изучаемых БАВ;
• 4. Сопоставить спектры ЯМР БАВ, близких по строению, для установления характера влияния на спектр различных заместителей;
• 5. Выявить наиболее важные аналитические сигналы в спектрах ЯМР, которые могут быть использованы для идентификации изучаемых БАВ;
• 6. Разработать унифицированные методики идентификации БАВ методом спектроскопии ЯМР;
• 7. Разработать методики определения компонентного состава БАВ, их примесей;
• 8. Получить сравнительные данные спектров ЯМР стандартных БАВ, выявить степень их соответствия;
• 9. Создать специализированную базу данных спектров ЯМР для целей стандартизации и оценки качества БАВ.

В лекарственном сырье наряду с действующими веществами содержатся и так называемые сопутствующие вещества, которые также могут обладать фармакологической активностью. Довольно часто сопутствующие вещества влияют на действие БАВ, потенцируя или ингибируя их фармакологический эффект. Качественный состав БАВ может быть различным в разных органах у одного и того же растения, это зависит от сроков заготовки лекарственного растительного сырья. Биологически активные вещества неравномерно распределяются по органам и тканям растений с преимущественной локализацией в определенных органах. На образование и накопление БАВ влияет и возраст растений. Это обязательно учитывают при культивировании растений [1].

Одним из важных показателей качества лекарственного растительного сырья является содержание основных биологически активных веществ. Их определение проводится с помощью химических и физико-химических методов анализа, основанных на физических, химических и биологических свойствах БАВ [2].

Известно, что на химический состав растений влияет ряд факторов:

• 1. Географический (т.е. в растениях южных широт накапливается больше эфирного масла и алкалоидов, в умеренной зоне — больше флавоноидов, дубильных веществ, в растениях северных широт — больше аскорбиновой кислоты, жирных масел и т. д.).
• 2. Климатический (тепло, свет, влажность). Количество тепловой, световой энергии, осадков и влажность окружающей среды оказывают существенное влияние на химический состав лекарственных растений, на накопление различных групп БАВ.
• 3. Эдафический (почвенный). На химический состав лекарственных растений оказывает влияние плодородие, механическая структура, влажность, pH почвы, ее химический состав, содержание в ней минеральных веществ. Орографический (рельеф). На химический состав лекарственных растений влияет высота над уровнем моря, экспозиция, крутизна склонов (например, Женьшень лучше растет и накапливает БАВ на восточных и западных склонах в кедрово-широколиственных лесах до высоты 700 м над уровнем моря.
• 4. Биотический. Окружающая живая природа также оказывает влияние на химический состав лекарственных растений, и прежде всего сказывается влияние растительного сообщества (фитоценоза) -фитоценотический фактор [3,4].

В настоящее время известно около 15 тыс. веществ — загрязнителей окружающей среды (атмосферы, воды, почвы). Наиболее опасны из них по токсикологическим признакам:

• — полициклические ароматические углеводороды (бенз (а)пирен); металлы — стронций (Sr), хром (Сг), селен (Se), магний (Mg), алюминий (Аl), никель (Ni), кадмий (Cd), свинец (Рb), медь (Сu), цинк (Zn), железо (Fe), марганец (Мn) и др.;
• — нитраты — калиевая, натриевая, кальциевая, аммиачная селитры, мочевина, аммофос, нитроаммофоска и др.;
• — гербициды, пестициды — прометрин, трифлурамин, 4,6-динитро-ортокерзол (ДНОК) и др.;
• — радионуклиды — стронций-90, цезий-137 и др. [5,6].

Таким образом, совокупность влияния онтогенетических факторов и факторов окружающей среды определяет химический состав лекарственных растений и его изменчивость, а соответственно и влияет на количественный и качественный состав БАВ в растениях.

Традиционно биологически активные вещества растений получают на основе использования природного сырья. Зачастую используют биомассу дикорастущих лекарственных растений, часть получают с полей специализированных хозяйств, где растения культивируют, повышают урожайность различными мероприятиями и собирают механическим способом. Широкое использование растений, для получения биологически активных веществ, привело к стремительному сокращению их в природе. Некоторые из них относятся к редким и исчезающим видам, многие растения долго восстанавливают свои площади произрастания.

Поэтому для получения и сохранения растений — источника биологически активных веществ, кроме традиционных методов, таких как интродукция, организация заповедников, заказников, создание плантаций, существуют иные методы. Одним из них является культура клеток и тканей высших растений in vitro.

Культура клеток и тканей высших растений является нетрадиционным методом охраны лекарственных растений, сохранения ценного генофонда древесных и травянистых растительных форм, методом получения, оздоровления, возобновления и размножения растений за счёт круглогодичного продуцирования регенерантов и массового выхода посадочного материала путём клонального микроразмножения [7,8,9]. Увеличения номенклатуры лекарственных растений, полученных методом культивирования invitro, используемых для производства БАДов, для использования в лечебно-профилактических и гомеопатических лекарственных средствах, в виде моносырья обусловлено рядом причин, а именно, увеличение доли препаратов растительного происхождения в общем объёме производства лекарственных средств во многих странах мира; увеличение числа фитопредприятий, а также специализированных производств, занимающихся выпуском БАДов на основе лекарственного растительного сырья; увеличение доли лекарственного растительного сырья, экспортируемого за рубеж, в связи с резко сократившимися во многих странах мира объёмами заготовок отечественного сырья[10].

Так как растения in situ, произрастая в неблагоприятных экологических условиях, накапливают несвойственные им химические вещества либо вещества в несвойственных растениям концентрациях. Загрязненное лекарственное растительное сырье и фитопрепараты, полученные из такого сырья, являются одним из источников поступления ксенобиотиков в организм человека. Они вызывают серьезные нарушения работы различных органов и систем организма, многие из них меняют в организме человека фармакологическую активность лекарственных веществ.

К основным антропогенным факторам, оказывающим наиболее существенное негативное влияние на дикорастущие лекарственные растения, относятся:

• — загрязнение окружающей среды промышленными предприятиями;
• — загрязнение окружающей среды автомобильным транспортом;
• — использование в сельском и лесном хозяйстве пестицидов, прежде всего средств борьбы с животными-вредителями (грызунами), насекомыми (родентицидов, инсектицидов); средств борьбы с сорняками (гербицидов), болезнями растений (нематоцидов, фунгицидов); азотных удобрений и других химикатов;
• — загрязнение окружающей среды в результате техногенных катастроф (аварии на атомных электростанциях, разрывы магистральных трубопроводов и т. д.)[11].

Наибольшее накопление веществ-загрязнителей происходит в растениях с крупными листьями, с листьями в прикорневой розетке, с опушенными листьями, образующих густые заросли.

Экологически чистое лекарственное растительное сырье, полученное путем культивирования in vitro, может использоваться не только для лечения различных заболеваний, а так же и в борьбе с последствиями экологических бедствий. Установлено, что основная часть токсинов при экологическом загрязнении переходит из крови в межклеточное, а затем и внутриклеточное пространство органов и тканей человека. Если вызываемые ими изменения не приняли еще необратимого характера, могут помочь некоторые лекарственные растения, обладающие эндоэкологическим действием. Они способствуют вымыванию токсинов из межклеточного, а некоторые и из внутриклеточного пространства.

Для установления структуры биологически активных веществ и изучения механизмов их действия было предложено использование применение ЯМР. Важной особенностью метода, особенно для биологии и медицины, является низкая энергия используемых в ЯМР излучений, что существенно снижает их вредное воздействие на организм.

Применение ЯМР для структурных исследований основано на том, что помимо внешнего магнитного поля на ядро в веществе действуют различные внутренние поля. Они приводят к сдвигу частоты резонанса, расщеплению на несколько или множество резонансных линий, т. е. к образованию спектра ЯМР, к изменению формы линий, времени релаксации. Изучение спектров ЯМР позволяет сделать вывод о химической и пространственной структуре различных веществ без проведения химического анализа. ЯМР является одним из наиболее эффективных аналитических методов [12].

С помощью ЯМР можно получить информацию:

— о подвижности ядер водорода и ее распределении в образце;

• — о соотношении твердой и жидкой фракций в образцах;
• — о скорости диффузии и самодиффузии;
• — о протонной плотности образца;
• — о спектральном распределении химически эквивалентных и неэквивалентных протонов[13].

Эффективность метода ЯМР обусловлена, в частности, тем обстоятельством, что для получения аналитического сигнала от органических веществ достаточно наличия в молекулах веществ атомов водорода (спектроскопия ¹Н ЯМР) или углерода (спектроскопия ¹³С). В спектрах ЯМР проявляются атомы водорода или углерода всех веществ, находящихся в анализируемой пробе образца. При этом нормированная под сигналом площадь (площадь, приведенная к одной молекуле, протонная единица) не зависит о того, в каком фрагменте молекулы или в какой молекуле находятся анализируемые атомы водорода или углерода, а также от концентрации веществ. Этим метод ЯМР выгодно отличается от других физических методов. Отношение нормированных площадей сигналов разных молекул равно отношению количества молекул этих веществ в анализируемом образце. Это свойство аналитического сигнала ЯМР весьма ценно для количественных измерений. ЯМР спектры экстрактов представляют суперпозицию спектров отдельных веществ, составляющих БАВ в соответствующих весовых соотношениях. Корреляция полученных ЯМР характеристик с химическим составом БАВ и литературными данными позволяет сделать вывод об эффективности ЯМР-спектроскопии в изучении химического состава и стандартизации БАВ и веществ, входящих в его состав [14].

Методика использования ЯМР спектроскопии позволяет не инвазивно в режиме реального времени отслеживать концентрации всех промежуточных продуктов обмена веществ в среде для культивирования. Данные, полученные этим методом, могут быть использованы для изучения процессов роста различных микроорганизмов.

В заключении можно отметить основные достоинства метода ЯМР:

• — высокая разрешающая способность — на десять порядков больше, чем у оптической спектроскопии;
• — возможность вести количественный учет (подсчет) резонирующих ядер.(это открывает возможности для количественного анализа вещества);
• — спектры ЯМР зависят от характера процессов, протекающих в растениях;
• — современная радиоэлектронная аппаратура и ЭВМ позволяют получать параметры, характеризующие явление, в удобной для исследователей и потребителей метода ЯМР форме (данное обстоятельство особенно важно, когда речь идет о практическом использовании экспериментальных данных);
• — высокая специфичность и оперативность метода ЯМР, отсутствие химического воздействия на растение, возможность непрерывного измерения параметров открывают многообразные пути его применения в биотехнологии [15]. Внедрению метода ЯМР препятствовали лишь сложность аппаратуры и ее эксплуатации, высокая стоимость спектрометров, исследовательский характер самого метода.

Последние революционизирующие изобретения в области ЯМР, включая удивительные методы получения ЯМРизображений, убедительно свидетельствуют о том, что границы возможного в ЯМР действительно безграничны. Замечательные преимущества ЯМР, которые будут высоко оценены человечеством и которые сейчас являются мощным стимулом стремительного развития ЯМР и широкого применения в биотехнологии и медицине, заключаются в очень малой вредности для изучения лечебных свойств растений.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 — 2013 годы" при финансовой поддержке Минобрнауки России (Соглашение № 14.В37.21.1110 от 14 сентября 2012 г.) с использованием оборудования ЦКП «ЭБЭЭ» ФГБОУ ВПО «ПГТУ».

спектроскопия магнитный резонатор биологический.

• 1. Бочарова О. А. / Вести РАМН. 2002. № 5. С. 49 — 53.
• 2. Бочарова О. А., Лыженкова М. А., Мезенцева М. Н. и др. / Бюллетень экспериментальной биологии. 2003. Т. 136. № 12. С. 670 — 673.
• 3. Государственная Фармакопея (XI издание). Т. 2. — М.: Медицина, 1989. С. 226 — 380.
• 4. Протасова Н. А. Микроэлементы: биологическая роль, распределение в почвах, влияние на распространение заболеваний человека и животных // Соросовский Образовательный журнал.? 2001.? Т. 7.? № 3.? С. 25−32.
• 5. Зенкевич И. Г., Багирова В. Л., Сокольская Т. А., Нечаева Е. Б. / Фармация. 2002. № 1. С. 43.
• 6. Stanway A. Trace elements. — London: Van Dyke Books, 1983. — 80 p.
• 7. Яковлева Г. П., К. Ф. Блиновой Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия СПб.: СпецЛит, 2004. 289 с.
• 8. Сергеев Р. В. Размножение invitro генотипов ивы с повышенным содержанием биологически активных веществ для плантационного выращивания на салицин / Р. В. Сергеев, А. И. Шургин // Лесной журнал. № 6. — 2009. — С. 40−45.
• 9. Бутенко, Р. Г. Культура изолированных клеток и тканей в решении задач физиологии растений // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С. 270.
• 10. Сергеев Р. В. Изучение влияния минерального и гормонального состава среды на размножение invitro генотипов ивы с повышенным содержанием биологически активных веществ / Р. В. Сергеев, А. И. Шургин // Вестник МарГТУ. № 2(9). — 2010. — С. 93−100.
• 11. Шилова И. В., Сырчина А. И., Краснов Е. А., Семенов А. А., Суслов Н. И. Химикофармакологическое исследование активной фракции Atragenesibirica L.// Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности: Матер. Междунар.конф. (27−29 июня 2000 г.). Томск, 2000. C. 72.
• 12. Nuclear Magnetic Resonance / ed. by H. F. Linskens and J. F. Jackson, Modern Methods of Plant Analysis, New Series. — Berlin: Springer, 1986. V. 2. — 196 p.
• 13. Гюнтер Х.

  Введение

  в курс спектроскопии ЯМР / пер. с англ. — М.: Мир, 1984. — 478 с.

• 14. Сильверстейн Р., Вебетер Ф., Кимл Д. Спектрометрическая идентификация органических соединений? М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011.? 520 с.
• 15. Лебедев А. Т. Масс-спектрометрия в органической химии? М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. — 493 с.