Методика проведения электрофореза в полиакриламидном геле (пааг)

Готовим разделяющий 8% ПААГ (осторожно — жидкий раствор полиакриламида токсичен, работать только в перчатках!). Для этого к 30 мл 8% АА, добавляем 113 мкл 10% PSA и 48 мкл. ТЕМЕД и немедленно заливаем в стеклянные пластины. Вставляем гребенку и оставляем полимеризоваться в течение 45−60 мин.

Осторожно вытаскиваем гребенку и промываем сформировавшиеся слоты геля 1х ТВЕ буфером для ЭФ. Наносим на слоты геля (с помощью микрошприца) по 5−7 мкл ДНК (предварительно добавив к 12,5 мкл. смеси амплификатов 2,5 мкл. буфера для нанесения образцов) и в крайние слоты — маркеры молекулярных масс.

Стеклянные пластины с гелем (желательно длиной не менее 20 см) помещают в камеру прибора для проведения вертикального электрофореза, заполненную буфером 1,0 х ТВЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 10−15 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 5−6 часов.

Снять осторожно гель с пластин, используя тонкую пластиковую подложку (гель толщиной 1 мм легко рвется). Далее гель окрашивают бромистым этидием (концентрацией 0,5 мкг/мл 1хТВЕ) в течение 15−20 мин, отмывают в дистиллированной воде до исчезновения фона и фотографируют в УФ-свете с помощью видеосистемы по 3.4.

Результат ПЦР анализа сохраняется в виде фотопленки (фотографии) или файл-паспорта на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер.