Гидродинамические параметры растительных тканей

Постановка проблемы и ее актуальность.

Проблема транспорта воды в растениях включает в себя вопросы идентификации путей переноса воды и определения условий их переключения, механизмов движущих сил, транспортных характеристик барьерно-регуляторных структур (клеточные стенки, мембраны, плазмодесмы, цитоскелет, сосудистая система), стоящих на пути движения воды. Решение этих вопросов позволит определить механизмы, обеспечивающие устойчивость растений к условиям водного дефицита — фактору, оказывающему наибольшее влияние на рост и продуктивность растений (Kramer, 1983). Наряду с этим, выявление механизмов регуляции водного транспорта позволит повысить эффективность обезвоживания растительных тканей в процессах переработки и хранения биологической продукции. Однако решение этих вопросов осложняется тем, что вода в растительной ткани движется по различным путям, взаимосвязанным между собой и регулируемым в зависимости от характера движущих сил (Steudle, 2002). Многофакторность проблемы транспорта воды, в свою очередь, определяет повышенные требования к методам исследования, задачам и объекту. При этом следует учитывать, что для экспериментального изучения транспорта воды необходимы методы, работающие на атомно-молекулярном уровне и ненарушающие функционирование водных транспортных каналов, в идеале работающие на интактных растениях. К числу немногих адекватных методов относятся импульсные методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые занимают особое место благодаря своей высокой чувствительности и возможности неразрушающего прямого контроля переноса воды и структурных параметров клеток (Анисимов и Раткович, 1992; Van As, 2007). До настоящего времени в большинстве экспериментов применительно к исследованию растений импульсные методы ЯМР используются как «брутто-методы» — в эксперименте регистрируется полный сигнал от всех молекул воды образца. Это приводит к вынужденному игнорированию различий клеток в разных областях образца ткани, в частности, по размеру, форме и степени вакуолизации. В свою очередь, эти параметры определяют время гидравлической релаксации клеток, эффективную трансклеточную проводимость, скорость релаксации ядерной намагниченности воды в компартментах клетки. Таким образом, применение «брутто-метода» приводит к усреднению экспериментально измеряемых характеристик по объему образца ткани, что допустимо только для однородных объектов, а в противном случае — зачастую приводит к многовариантности при интерпретации данных.

Пространственное разрешение сигнала ядерной намагниченности, ставшее возможным с применением магнитно-резонансной томографии (МРТ), снимает, в определенной степени, проблему усреднения. Однако использование техники МРТ сопряжено с рядом трудностей, связанных с широким спектром гетерогенности растительных тканей, как по структурным, так и функциональным параметрам. При исследовании транспорта воды ситуация усложняется динамичностью процессов водного переноса. В результате, на сегодняшний день методам МРТ при исследовании большинства тканей не хватает пространственного разрешения для достижения клеточного уровня и временного разрешения для фиксации быстро меняющихся процессов водного переноса. И, наконец, ограниченная доступность специализированной для исследования растений техники МРТ и, как следствие, недостаточное развитие методик обработки данных диффузионно-взвешенной МРТ усложняет интерпретацию полученных результатов на уровне физиологии растений.

Таким образом, наряду с техникой МРТ необходимо развивать селективные методы ЯМР для контроля водного переноса в тканях. С одной стороны, это расширит возможности метода МРТ применительно к растительным объектам. С другой стороны, позволит на более простом и доступном по сравнению с МРТ оборудовании решать широкий круг задач на клеточном и субклеточном уровнях.

Цель и задачи исследования

.

Целью работы являлось: селективное исследование гидродинамических параметров в отдельных компартментах растительных тканей импульсным методом ЯМР.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка методов исследования гидродинамических и структурных параметров компартментов клетки и межклеточных транспортных путей в растительных тканях на основе импульсных методов ЯМР.

2. Определение методом математического моделирования условий применимости метода ЯМР-диффузометрии для измерения диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.

3. Селективное исследование методом ЯМР-диффузометрии трансляционной подвижности воды в компартментах вакуолизированной клетки.

4. Исследование анизотропии диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода моркови (Daucus car ota).

5. Проведение сравнительного анализа температурной зависимости диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в корнях растений (Pennisetum americanum и Zea mays), различающихся по устойчивости к водному стрессу, в норме и в условиях осмотического стресса.

Научная новизна работы.

Предложено уравнение, позволяющее в общем случае описать зависимость коэффициента диффузии воды от времени диффузии в пористых (био-)системах и определить параметры, необходимые для расчета диффузионной проницаемости. Продемонстрирована возможность формализации процесса обработки экспериментальных данных ЯМР-диффузометрии, что необходимо для исследования диффузионной проницаемости методом МРТ и для серийных исследований.

Предложен метод оценки скорости потока воды в цитоплазме вакуолизированной клетки с использованием ЯМР-диффузометрии. Определена скорость потока воды в цитоплазме клеток паренхимы яблока.

Получены карты диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани с использованием диффузионно-взвешенной МРТ на примере корнеплода моркови (Daucus carota).

На основе карт диффузионной проницаемости установлено различие тканей корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.

При сравнении зерновых культур (кукуруза и просо), различающихся по устойчивости к дефициту воды, в условиях осмотического стресса обнаружено различие кортикальной паренхимы первичных корней: 1) по вкладу симпластного пути в суммарный межклеточный диффузионный перенос воды- 2) по температурной зависимости суммарной диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и диффузионной проницаемости симпластного пути.

Научно-практическая значимость работы.

Разработанные методы анализа трансляционной подвижности воды и полученные в результате исследований данные позволяют проводить исследование функционирования межклеточных водных транспортных путей на уровне ткани, группы клеток, компартментов клетки на интактных растениях. Полученные в ходе работы данные об особенностях температурной регуляции проницаемости межклеточных водных транспортных путей представляют интерес для специалистов в области биофизики и физиологии растений. Изучение реакции симпластного и трансклеточного переноса в ответ на сдвиг водного равновесного состояния осмотическим воздействием позволяет сфокусировать внимание на структурах и регуляторных ответах клеток, отвечающих за приспособляемость растений к дефициту воды. Понимание причин и следствий изменения проницаемости в ответ на изменение уровня водного дефицита создает перспективы для разработки новых технологических приемов оптимизации процесса обезвоживания при переработке и консервации биологической продукции.

Апробация работы.

Результаты диссертационной работы были представлены на 15 зарубежных и российских конференциях, в частности лично автором диссертационной работы на следующих конференциях: XIII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2006) — VI съезд общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007) — International conference «Modern developments in magnetic resonance imaging and spectroscopy in medicine» (Kazan, 2007) — International Conference «Modern Development of Magnetic Resonance» (Kazan, 2007) — European Magnetic Resonance Conference EUROMAR (St. Petersburg, 2008) — XVI Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2009) — итоговые конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2004, 2006, 2008, 2009).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликованы 22 работы, в том числе 3 статьи в центральных российских научных журналах и 4 статьи в рецензируемых сборниках трудов конференций.

Структура и объем.

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текстасостоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. В работе представлено 6 таблиц и 50 рисунков.

Список литературы

включает 135 источников, из них 14 — отечественных.

ВЫВОДЫ.

1. На основе диффузионно-взвешенной магнитно-резонансной томографии разработан метод получения карт диффузионной проницаемости пористых (био-)систем. Впервые получена карта диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.

2. Разработан метод оценки скорости цитоплазматического течения в вакуолизированной клетке на основе ЯМР-диффузометрии.

3. Методом математического моделирования показано, что в условиях быстрого диффузионного обмена воды между компартментами клетки различие компартментов клетки по скорости релаксации намагниченности протонов воды оказывает наименьшее влияние на значение диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей, измеряемое методом ЯМР-диффузометрии. Снижение скорости обмена приводит к увеличению влияния релаксации намагниченности на измерение проницаемости.

4. Методом диффузионно-взвешенной магнитно-резонансной томографии установлено различие тканей корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей. Обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости в тканях корнеплода.

5. Установлено, что клетки кортекса корней кукурузы и проса существенно различаются по температурной зависимости диффузионной проницаемости симпластного пути и суммарной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.

6. Обнаружено, что в условиях осмотического стресса у клеток кортекса корней проса симпласт является преимущественным путем для диффузионного переноса воды, тогда как у клеток кортекса корней кукурузы диффузионная проницаемость симпластного пути сравнима с проницаемостью трансклеточного и апопластного путей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Транспорт воды в растении является сложным динамическим процессом, изучение которого встречает ряд серьёзных методических трудностей. Основным требованием для проведения подобных исследований является работа с неповрежденным растением, сохраняющим все свои функциональные характеристики. В то же время для получения более полной информации необходимы методики селективного контроля подвижности воды как в отдельной клетке и ткани, так и в целом растении. Реализация такого методического подхода способна внести существенный вклад в развитие исследований в области транспорта воды, что в свою очередь позволит решить заявленные в статье «Геномика: биология растений в 2010 году» в журнале «Science» (Somerville and Dangl, 2000) задачи «.системного анализа поглощения, транспорта, запасания ионов и метаболитов».

Для решения поставленных задач наиболее адекватным подходом является использование методов ЯМР и техники МРТ. К сожалению, на сегодняшний день классическое применение ЯМР не позволяет проводить селективный контроль над водным транспортом по параллельным путям и определять размерные параметры клеток, а уровень развития техники МРТ не дает требуемого пространственного разрешения и ограничен числом методик наблюдения за динамическими процессами, такими как водный перенос. В связи с этим, необходимо развивать методы ЯМР для селективного исследования водного транспорта по тканям и компартментам клетки растения, чему и посвящена настоящая работа.

В данной работе предложены методы исследования диффузионного переноса воды в растительных тканях на основе измерения зависимости наблюдаемого коэффициента диффузии воды от времени диффузии методом ЯМР. В зависимости от условий эксперимента эти методы позволяют исследовать как межклеточный транспорт воды, так и перенос по отдельным компартментам клетки.

С помощью математического моделирования были определены границы целесообразности использования метода ЯМР-диффузометрии. В частности, выявлены условия и причины возможного отклонения измеряемых методом ЯМР-диффузометрии величин проницаемости и размеров клеток от определяемых другими методами значений. При этом для определения размеров клеток необходимо использовать именно метод ЯМР, поскольку в этом случае, в отличие от использования методов микроскопии, не происходит разрушения путей водного транспорта.

Используя анализ корреляции релаксационных и диффузионных спадов намагниченности в условиях медленного (в масштабе времени спин-спиновой релаксации намагниченности воды) диффузионного обмена воды между компартментами клетки, продемонстрирована возможность исследовать цитоплазматическое течение в вакуолизированных клетках.

С помощью метода диффузионно-взвешенной МРТ экспериментально показано, что диффузионная проницаемость зависит от функционального назначения клеток. Одновременно с этим в тканях, отвечающих за направленный перенос воды вдоль корня, обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей, способствующая более свободному транспорту воды в аксиальном направлении корня по сравнению с радиальным.

Совместное использование метода ЯМР-диффузометрии и метода парамагнитного допинга позволило выявить роль каждого пути межклеточного водного транспорта и их доли в суммарном транспорте воды. Сравнивая растения, различающиеся по устойчивости к засухе, установлено, что зависимость интенсивности радиального диффузионного переноса воды по симпласту от осмотического стресса и температуры более выражена для кортекса корней проса по сравнению с кукурузой. Данные, полученные в ходе этого эксперимента, позволяют заключить, что, по крайней мере, часть механизмов обеспечения устойчивости растений к осмотическому стрессу связана с особенностями процесса межклеточного транспорта по симпласту.

Таким образом, в настоящей работе не только представлена методическая база для исследования транспорта воды селективно по растительным тканям и компартментам клетки, но и продемонстрирована возможность их использования для решения конкретных физиологических задач.