Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сибиреязвенного микроба, усовершенствование методов их идентификации и дифференцирования от близкородственных бацилл

Актуальность пройдены. Снбирои* Я1*а • часто фитильная острая ионозная бактериальная инфекция человек л и животных" рала нваюшаяс ¦ при проникновении eiwp Bacfitus anthrocti «организм через поврежденные кожные покровы, ингаляционным путем или При зшгатыванни. Это эооиоч большинства млекопитающих. Особенно восприимчивыми считаются травоядные. Инфекции человека — результат контакт с больными животными или контаминнроваиными продуктами животного происхождения. Случаи передачи сибиреязвенной инфекции от человека в человеку неизвестны (Бургасо* П Н с соавт., 1970, Бургасов ПЛ., Рожков ГЛ, 19S4, Онищсико Г. Г с соавт., 1999) Сибирская язва имеет глобальную распространенность, неравномерно охватывая все континенты к не регистрируясь л нить на немногочисленных островных территориях (Бахулов И, Л, с соавт., 2001. Черкасский Б. Л. 2002). Заболеваемость сибирской язкой в России, также как н во всем мире, не имеет тенденции к снижению (МйрИнйн ЛИ с совит., 1999).

Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана с тем. что с давних времен ее возбудитель приобрел мрачную славу как потенциальный агент бактернолопгчтетт оружия (Christopher O.W. cl л! >997- IngJ"by T, V ct *l, 1999; Frischknech< F., 2003; Riedel S., 2004). Война 1991 г, в Персидском шик усилила осознание возможности применения В anthracis в качестве биологического оружия (ZJlirwkaj R. А-. 1997; Uiwnbcrg М, 2001), стала стимулом важных научных исследований, касающихся данного заболевания. И, наконец, события сентября — ноября 2Q01 г, и США, когда споры ипбудиталя сибирской язвы стали причиной многочисленных биотеррактов, сделали очевидной погенцнаяысую опасность применения этою патогена, что послужнло новым толчком для продолжения детального изучения этой инфекции и it возбудителя (ЛвбПи JO B. с соавт, 2002; Evsns R. G й al. f 2002; Jnglesby T V ct «I. 2002; Jemigan D. B, «a]-, 2002).

Сибиреязвенный микроб, В anihrocis, входит и группу близхородст ценных бацилл Bacillus areas, к которой, а связи е общностью свойств также относят Bacillus сета, Bacillus thuringiensu. Bacillus myvoides, Bacillus pstwdomycotiUt, а также пснхротолераитныК микроб Bacillus weiclKmn’phanenfis (Slsmii L., Lereclus D" 2005). H* фенотнпическое и генетическое сходство является причиной многих трудностей н ошибок в видовой идентификации бшдал. Основные фснотипические отличив В anthracti от других бацилл этой группы состоят в отсутствии экспрессии таких ферментов, как аеяициллиназа, mnvmi фосфат"", ряд фосфоянпм и прогеаз, неподвижности, чувствительности к специфическим бактериофагам, способности продуцировать подмглутаыиновую капсулу н три компонента экзотоксинов Однако наряду с типичными штаммами смбирсткшога микроба, обладающими всеми перечисленными признаками, в природе встречаются варианты, имеющие одно или несколько свойств, характерных для блнзкорюсткиных бацилл, например, устойчивость к фагам н пенициллину, отсутствие капсулообраэовання, способность к продукции лешттииазы или щелочной фосфатазы. Фсиотипнческая идентификация таких штаммов весьма затруднительна,.

Существует и другая проблема, связанная с генетической идентификацией Многие из перечисленных признаков детерминируются хромосомными генами, которые присутствуют в геноме всех бацилл, но не эхслресснруются у В anthracis. Поэтому только генетическая идентификация, основанная на определении зткх генов, не пояилит дифференцировать сибиреязвенный микроб от других бацилл этой группы. С другой стороны, основные факторы пагогенностн сибиреязвенного микроба — экзотоксины и капсула — кодируются генами плвзмкд pXOl и рХ02, гораздо более специфичными для лого патогена, однако к случае выделения атипичных штаммов енбнреяэвешюго микроба, которые могут быть лишены одной или обеих плазм и л, генетическая и дентификация также становится ненадежной,.

Помимо лого, существуют данные о налички последовательностей, подобных токсичной п капсульной шнэмншм сибиреязвенного микроба о геномах некоторых штаммов близкородственных бацилл.

Кроме того, что существуют трудные дл* идентификации природные атипичные штаммы В anthracii, вполне вероятным представляется конструирован^ искусственно тисненных вариантов с отличающимися от типовых признаками, которые могут быть исиольювлиы в качестве агентов бнотеррорими, летежима и цяеитифиншм которых также окажется непростой задачей.

Полому проводимые, а этой связи научные изыскания представляются в настоящее время весьма актуальными.

Цель нсслелоаанн": характеристика биологических с"Аст" атипичных штаммов сибиреязвенного микроба с использованием полученных данных для усовершенствования методов их идягтнфикации н дифференцирования от близкородственных бацилл, Ьничи исследования: 1 Оценить распространенность «типичных «пичмов сибиреязвенного микроба, выделенных в природных условиях. 2. Изучить фснотипичсскне свойства атипичных штаммов В anthracis и близкородственных бацилл группы В emus. 3 Усовершенствовать фенсгсминческий тест дня определения чувствительности к пенициллину 4. Сравнить геномные характеристики атипичных штаымо» сибиреязвенного микроба и бацилл группы В cercus. 5 Разработать вариант мультиплексной ПЦР тсст-смстемы для дифференциации типичных н атипичных гигам моя сибиреязвенного микроба от ипаимею близкородственных блинля.

6. Исследовать возможность использования метола ыноголо кус Кого анализа областей с вариабельным числом таидемных повторов (MLVA) для дифференциации бацилл ij. lfvnah w) iwi№.

Впервые оценена частота выделения атипичных штаммом возбудителя сибирской язвы, а также чистота ошибок в идентификации бациллярных штаммов, первично окарастерюованных выделившими их учреждениями left* В anlhracis н поступивших в лабораторию для проведения окончательной идентификации.

Впервые проведено сравнительное изучение фиютнпкческих свойств типичных, атипичных штаммов В. an throe is к близкородственных бацилл ГруПЛЫ В. Cfrpltl.

Усовершенствован феиотипичеекнй тест для определения чувствнтслынктн к пенициллину.

Впервые изучена специфичность ираймеров к ряду плазмндных н хромосомных генов бацилл. Получена сравнительная характеристика ма, тскулярио-биолопр<�сских свойств типичных, атипичных штаммом В anlhraclt и близкородственных сапрофитов.

Разработан вариант мультиплексной ПЦР тест-системы для дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором плагчнл от штаммов близкородственных бацнлл.

Геиотиинроиние по ыриабедмгиы хромосомным локусам «ггЛ, СсЬ-Bams 13 позволило обнаружить пггаммовыс различия между атипичными штаммами В anthrticis.

I Использование MLVA по шести хромосомным н одномулиум плазмидным докусам выявило ранее не описанные алледьные варианты.

Впервые определен характерный для беска"сульных атипичных природных штаммов ML V, А — re ногшг, присущий им независимо от (сографического происхождения.

Покпана возможность использования праймеров к локусу vtrA, а также 8-ми локусиого MLVA дли дифференциации штаммов возбудители сибирской ищи от бацилл рода Bacillus.

Пряитичссгаи значимость.

У совершенство влины ft фенотнпкчсский тест для определения чувствительности к пенициллину, рюриботмптй лариа"гг ыультиираймерной ПЦР тест-системы и использование праймеров к л Оку с у wrA, MLVA по В-ми докусаы для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл рода Вос<�Ни* внедрены в практику лаборатории сибирской цмшл СтмНИПЧИ.

Результаты проведенных исследований отряжены в следующих методических документах, нашедших применение в научно-исследовательской и практической длительностях учреждений здравоохранения:

1 Мегарпкиис рекомендации «Использование М1ЮголокуеиоЯ полимеразной ценной реакции для идентификации Bacillus arrthracis и оценки генетическое потенциала патогенное&trade-«, утвержденные директором СтапНИПМИ профессором В. И. Ефременко «июне 2002 г 2. «Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипнчсских признаков (гемолнтн'есской. протеолнтнчсской, децнтинаэной и пнгмеитсигтезируюшей активностей, способности ипаммамж’нзолятамн продуцировать капсулу н токсин ш vitro) культур В anihracis*, рекомендованные на заседании секции «Инфекционная патологий животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН академиком ИЛБкушш 28 моя 2004 г. протокол секции J6 2 и утвержденные директором СтявМИПЧИ профессором В. И Ефремснко 21 октября 2004 г, протокол заседания Ученого сонета St 9.

3, «Методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации группы баиилл. включающих Bacillus ал throe is», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В И Ефременко 27 мал 2005 г., протокол заседания Ученого совета №S.

4 «Методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов прн генотнпнровинни», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В И. Ефременко 27 мая 2005 г., протокол заседания Ученою совета Jft 5.

5 Учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты иол им с разной ценной реакции», утверждено директором СтавНИПЧИ профессором В И Ефременко 27 мая 2005 г., протокол заседания Ученого совета № 5.

Материалы диссертации пошли в заключительные отчеты, но НИР СтавНИПЧИ «Изучение феиогниической н генетической вариабслыгости штаммов сибиреязвенного микроба» Nt ГР 02 200 10 909], «(Изучение биологических, биохимических и молскулярно-генетичсских свойств микроорганизмов бактериальной природы, перснсипсжых, а плане разработки и опенки эффективности средств н методов диагностики особо опасных и социально» значимы к инфекций человека и животных", выполнен ной в соответствии с Договором № 7/56 от 04.02 2002 г.

OcnoBiiktf положения, вмноемчме ив lb опт.

1. Частота выделения атипичных штаммов сибиреязвенного микроба и пошм бяизморедегееишх бацилл, ошибочно идентифицированных как В anthracis, примерно одинакова.

2. Сравнительное изучение основных биологических свойств атипичных, типичных штаммов В antkraeb и близкородственных бацилл рода В сегеия выявляет как внутривидовые различия, так к межвидовые сходства фенотипнчсских признаков.

3. Замена трудно воспроизводимого и приводящего к неоднозначной интерпретации результатов теста ¦гжемчужного ожерельях на определение чувствительности к пенициллину метолом диффузии в агар с коммерческими дисками с пенициллином, позволяет получить четкую «пуши-му» картину и избежать сомнительных и ложноположнтельных результатов теста.

4. Дня атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы, помимо нраймеро* к плазмшшык J-емам, специфичными являются нраймеры к хромосомным последовательностям S-слоя sap и бактериофагосвязывакнцсму локусу Е4 irpu подборе оптимальной концентрации праймеров. Использование праймеров к бактсриофагосвязывающему локусу в одной амштнфнкацнониой смеси с праЯ мерам! к последовательностям cajtC (рХ02) и суа (pXOI) дает возможность применять зтот набор п качестве варианта мультиплексной ПНР для идентификации штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором платмид и даффереионацни отблтпкородственных бацилл.

5 Нраймеры EWA,.j к локусу vrrA. а также 8-ми локусиый MLVA могут быте. использованы как для генетического тнпнрокання штаммов В attihraai. так и для днфференииаиин штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл рода Bacillus.

Ли раба ним работы.

Материалы диссертации были представлены на t-ofl Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов. 2000). на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященный 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летню Талдыкорганской противочумной станции (Алматы, 2001), на юбилейной конференции, «освященной 50-летию СтааНИПЧИ — «Эпидемиологическая безопасность на Капкан: Итоги и перспективы.- (Ставрополь, 2002), на научно-црактнческом симпозиуме «Технологии теиодиагностнки в практическом здравоохранении» (Москва, 2002), на -4-Й и 5-й Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва. 2002; 2004), на юбилейной конференции, поепкпееннмй 75-леппо ИНН Микробиологии МОРФ (Киров, 2003), из конференции «Актуальные проблемы ийрщиш (Томск, 2004). ко V! Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарии охрана территорий государств-участников содружества нставиенных государств: проблемы биологической безопасности и противодействия бногерроризму в современных условиях», (Волгоград, 2005), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и решениях санкт*пстсрбургсхого саммита «группы цосьмп>» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств^ (Обо, тетех, 2006).

Материалы диссертации обсуждены н одобрены на межлабораторной конференции СТавНИПЧИ 28 нюня 2006 Г.

Публигании.

Основное содержание диссертации отражено в 26 опубликованных работах.

Структур* и обм-ч диссертации.

Работа изложена на 1% страницах машинописного текста и состоит из апедешгя. обзора дитеротуры. 4-х глав собственных исследований. заключения. выводов и списка литерату ры, включающего 269 работ, из них 86 на русском и ]8Э на шюстраниых язмкад. Материалы ндлюстрнреммы 20 рисунками н 24 таблицами.

выводы.

I Атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы составили II,] % от числа штаммов, идентифицированных как В anthracis Источниками нх выделения чипе всего были почва «старых» скотомогильников, материал от животных и несколько реже материал от больных людей, что может свидетельствовать в пользу существования механизмов изменчивости как при развитии во внешней среде, тах и в организме хозяина в ходе инфекции.

2. Атипичные штаммы сибиреязвенного микроба отличались измененными хультуралыю-морфояогическимн свойствами, капсулотоксинон спорообразованием, леиктиназиой и фосфатазной активностями, чувствительностью к сибнроязвешшм бактериофагам, способностью ЛИзировать отмытые эритроциты барана, протеолнпгчсской активностью по отноикнню к альбум нну. питательными потребностями Ряд штаммов близкородственных бацилл обладал одним или несколькими фенотип нческим и признаками, характерными для возбудителя сибирской язвы, включая рост m лиффереишшп. ио-диагностнческой среде для сибиреязвенного микроба, отсутствие подвижности, характер роста на питательном агаре и бульоне, каиеулообраэоваиие in vitro, елвбоположнтсльна* или отрицательная реакция в тесте на щелочную фосфатазу и лецитнназу, отсутствие гемолитической активности, чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу.

4 Замена теста нжемчужиого ожерелья" ввиду нечеткой ею интерпретации на определение чувствительности к пенициллину методам диффузии в агар с коммерческими дисками позволила избежать сомнительных и уменьшить частоту неверных результатов идентификаций,.

5. Инкубирование штаммов В a/tlhracts в атмосфере с 3% COj стимулировало гемолитическую активность по отношению к отмытым эритроцитам барана через 48 ч инкубации, а к 72 ч позволяло получить количественные характеристики этого Признака даже у атипичных штаммов с ниткой гемолитической аючвностыо.

Все штаммы возбудителя сибирской «вы, включая отличные, имели описаизтые как специфичные для этого патогена хромосомные и локализованные на юксииной штазмиде 1ены, при этом 6 штаммов не продуцировали токсины. Результаты ПЦР с примерами к pXQ2-локаллоааиным геном капсулообразояаиия сорС и каталитического домети аутолизлна ami могут дифференцировать атипичные бескапсульиые штаммы и служить дополнительным подтверждением наличия или отсутствия плазм или рХ02 в геноме изучаемых культур.

7. Для возбудителя сибирской к злы, помимо праймеров к хромосомным генам S-слоя iapt специфичными оказались также праймеры к хромосомному бактернофагосвазываюадсму участку Е4, что позволяет использовать их в мультиплексной ПЦР с п размерами к последовательностям сарС (рХ02) н суа (рХО!) дая идентификации типичных и атипичных штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором плазмнл и дифференциацин от близкородственныхбапилл.

8, Присутствие генов фосфатилил иношталомА фосфолицазы и ферригнн-подобиых белков В anlhracis характерно для всех без исключения бациллярных штаммов, а гены фосфатндил ннознтоловой фосфолиплзы В сеrem и В. ihuringicraLi, фосфатндил холиновой фосфолнпазы С В ihvrigietute, ингибитора иммунитета В anlhracis и знтеротокенна S В cereт и В thuringtejuii позволяют выявить межштпммовые различия как нзолятов возбудителя сибирской язвы, так и нссибнрсязвснных бацилл. Наличие обнаруживаемых в ПЦР генов транскрнппионного регулятора и каталитического домена аутолизнив Н anthraett подвержено внутривидовой вариабельности и позволяет дифференцировать штаммы.

9. MLVA ко 8 генетическим локусаы в сочетании с филогенетическим анализом л ал возможность дифференцировать две категории атипичных штаммов сибиреязвенного микроба — природные бсскапсульиые н штаммы раз"сии происхождения с комплексом атипичных свойств от типичных Штаммов н других категорий атипичных штаммов, а также дифференцировать любые штаммы В unthracU от прочих бацилл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы, т. е. штаммы, с отличными от типичных культур В, anthracis биологическими свойствами, в настоящее время не являются релкостью Наиболее часто выделяются культуры с измененной морфологией колоний, вирулентностью и квпеулообразоваиием, реже — штаммы, с отличающимися от ^тгапонньш* культур В. anthracis биохимическими свойствами (гемолитическая, протсолнтическая, фосфатмио* активности}, резистентностью к действию специфических сибиреязвенных бактериофагов и антибиотиков различных групп, спорообразованием.

Необходимо учитывать, что в природных условиях штаммы с атипичными свойствами часто выделяются нз почвы {Бср?зкина Г. П. с соавт. 1974; Гулый А. А., 1982; Буравиева НЛ. с соавт. 1983, Ипатенко Н-Г, с соалт., 1991; Еременко К. И. с соавт. 1993), откуда также изолируются бл из королствеиiгые споросбратующие сапрофнты Полому сункствузощая в настоящее время проблема недостаточной однозначности большинства фенотширксекнх к ыолекулярно-бнологическнх критериев идентификации В anthracis, зачастую затрудняет процесс идентификации и создает сложности, особенно прн дифференциации атипичных штаммов сибиреязвенного микроба от близкородственных бацилл группы В сети. Решение этой проблемы может быть найдено с усовершенствованием существующих схем исследования, а также в результате поиска новых надежных идентификационных признаков. Это позволит дать эпидемиологическую и эннзоотологнчсскую оценку выделенных июлятов, а также поможет в дифференциации представителей группы В. еегечг.

13 лаборатории сибирской язвы Ставропольского научно-исследовательского протнпочуммопз института проводилась окончательная идентификация 1092 штаммов микроорганизмов, выделенных различными медицинскими и ветеринарными учреждениями в период с 1953 по 2004 гг. и предварительно идентифицированными ими как В anthracis 64,84% (70В) нпамыов были) г"лированы в 33 регионах Российской Федерации, и" них 76,5% (542) штаммов выделено в республиках, краях и областях Южного Федерального округа. 33,79% (369) штвммоя были направлены на идентификацию in 6 стран ближнего зарубежья, большая часть из которых (57,45%, 212 штаммов) приходилась на Азербайджан, 1,37% (15) штамммов были производственными и вакцинными и получены нз ГИСК нм. Л. А. Тарясевича к ГНКИ ветпрепаратон.

Проведение окончательной идентнфнканин позволило сделать заключение, что 963 штамма (88,2%) являлись сибиреязвенными, из них свойства 107 культур отличались от типичных штаммов возбудителя сибирской язвы по одному или «скольким фенотнпнческнм признакам, что составило 9,8% от общего количества исследованных культур и 13,1% от числа Штаммов, идентифицированных как В anthracis.

Штаммы, с биологическими свойствами, не свойственными ТИИЧКЫЫ штаммам возбудителя сибирской язвы, были Ювлирошы на 9 территориях Российской Федерации и в 4 странах ближнего зарубежья. Часто объектом их выделения являлись почва «старых» скотомогильников (22%). Факт частого выделения атипичных штаммов нз почвы «старых* скотомогильников совпадает с имеющимися литературными данными (Бср?зкнна Г. П., 1978; Федотов B.C., 1978; Еременко EJL, 1997; Марин им Л.И. с соавт, 1999, Бакулов Н, А и др., 2001).

Столько же атипичных штаммов было выделено из почвы с места прирезки н падежа больных животных (22%). По существу, тги итоляты представлены возбудителем сибирской язвы, недавно попавшим в почву из организма больных животных, находящихся в нредтерминальноВ или терминальной стадии сибиреязвенной инфекции. В случае, когда нсктишм вылелеиня служил нехарактерный для сибиреязвенного микроба объект • труп серой полевки, то, схорее всего при жизни она также была комтамннирована спорами возбудителя из почвы В совокупности с другими штаммами, имеющими отношение к эпизоотическим и эпидемическим проявлениям сибирской язви, а именно, выделенными из обьектов окружающей среды, из организма больных людей и животных, а также продуктов животноводства, они составляют половину (50%) или ббдьшую часть всех атипичных штаммов. Однако, если учесть, что доля атипичных штаммов среди более 600 штаммов вишепри веденного происхождения составляет около 3,5%, в то время как из 2? штаммов, выделенных в старых скотомогильниках, более половины являются атипичными, следует признать наиболее частым их источником именно эти oCvcnu.

При исследовании фснотнпнчсскнх свойств атипичных штаммов были получены следующие результаты. Большинство штаммов (82) явились циничными по калсулообразованию- 81 штамм был лишен способности образовывать капсулу (л vivo к in vitro и авирулентен для белых мышей, одни штамм формировал капеулу ири культивировании как в ВОздушмсЯ атмосфере на агаре Хотпшгеро, так и в атмосфере, обогащенной СО, был вирулентным для мышей и морских свинок, ноавирулентиым для кроликов Для 41 культуры неспособность к капсулообразоваиию явилась единственной отлнчителыюй чертой от характерных для еибиреяэвенноге микроба свойств. У остальных 40 культур неспособность к капсулообразоваиию сочеталась с наличием от одного до четырех фснотнпнчсскнх признаков, не свойственных «эталонным» штаммам В anthracii нехарактерная бактериоскопнческая морфология, нетипичный для данного возбудителя рост на питательных агаре и в бульоне, слабоположительиэв реакция в тесте на щелочную фосфатазу, леиитииазная активность. Кроме тгого, в ходе исследования фенотнпическнх свойстп культур по тестам идентификации было выявлено 5 штаммов со елвбоположитедьной реакцией в тесте, но щелочную фосфатазу, 15 лецитниаэопознтнвных штаммов, 5 изолятов с сомнительным результатом фаголнзабельиоети сибиреязвенным бактериофагом, в то время как по остальным тестам идентификации их свойствах штаммов варьмромлн от одного до яеенаяинх прюнаков Так, 20 штаммов были W способны к продукции капсулы на t % бикпрбоивтном «таре н были авнрулентич для белых мышей. I штамм обрлйлялвпл капсулу Кох и воздушной атмосфере на агоре Хоттингера, так н на 1% бикарбонат ном агоре в атмосфере COj, он также отличался избирательной вирулентностью для белых ыыикй, но был авирулентным для кроликов, как и еще одни цшшм. У IS культур имя ilicji роад нчн uft уровень лецнтииj iiuiii активности, а этот признак у 6 штаммов сочетался е неспособностью к синтезу капсулы. 3 пквпеульных штамма обрпОШкик легкую пленку при росте на бульоне Хоттингера Тест ни щелочную фосфатюу был слабоположительным у двух штаммов: у одного штамма лот признак сочетался с отсутствием кансулообраювания, а у другого ¦ с замедленным енорообрмованием в течен»" первых пяти суток инкубации. Атипичное спорообразование отмечено сак у двух дошит: у одного нюдята выявлено «медленное образованием спор, большая часть которых характеризовалась нетипичной морфологией, у другого штамма скорость спорообразования была выше обычной, кроме ткмх», споры этого и", Чита могли прорастать только при наличии в среде аланнна.

Стабильными для возбудителя сибирской язвы фенотигичсскими характеристиками и данной выборке штаммов оказались неподвижность, чувствительность к лизису си&иреянкиным бактериофагом «Гамма Л-2&-1», к пенициллину в тесте «жемчужного ожерелья» н отсутствие гемолитической активности по отношению к чригроцктам на агаре с 3−5% дефибринированной крови барана. Достаточную стабильность проявил тест на мелочную фосфптазу.

Использование дополнительных тестов при сравнении фснотнническнх свойств типичных и атипичных штаммов сибиреязвенного микроба также отводило вытггь внутривидовые различия между игтаммамн.

Определение вирулентности штаммов В anthracts с исчислением LDW иокаддо, что 20 гапеулообразующих штаммов, также как и тнгтрольные типичные штаммы В anthraca, были вирулентны для белых беспородных мышей, значения их LDM не превышали 500 спор, SB исключением апамма с замедленным атипичным спорообразованием значение LD" которого составило 10 000 спор, а штамм расценен как слабовирулентный. У 20 акалсульных культур значения LD" превышали 10 000 спор, что соответствовало лвирулсктным штаммам.

При определении способности к капсуообразованню ш vitro на среде СОПОК были получены результаты, совпадающие с данными, выявленными при культивирования исследуемых культур на 1% бикарбонатом агаре.

Токсннообразовашк in vitro тяхже определяли на среде СОПЭК по наличию ореолов нммунолрецнпкттщни вокруг колоний. Большинство культур образовывали токсин, формируя ореолы преципитации на различном расстоянии от края колоний, 7 штаммов не образовывали ореолов, 2 штамма формировали невыраженные кольца у края колоний, в у одного штамма очень слабое кольцо нммунопрснишгпишн у самого края колонии становилось различимым лишь на &—е сутки выдерживания чашки с посевом при 4−10 °С.

При изучении минимальных питательных потребностей атипичных штаммов В anthracii на сшгтетичеекой среде «9А» были получены следующие результаты. 11 штаммов ис росли на минимальной среде, из них 7 культур, не синтезирующих токсин in vitro: 6 капсулообразующих штаммов, в том числе штамм, синтезирующий капсулу независимо от условий и среды выращивания, н один акапсульиый игтамм, Также на этой среде не давали роста одни вирулентный лецигиназоподожительный штамм н три акапсулысых штамма. 15 акапсуяьных и 2 капсулообразующнх иггачма росли на среде «9А» с задержкой — через 48 ч., остальные культуры, 13 вирулентны:* (в том числе 2 типичных) и I авирулентная, формировали колонии через 24 ч.

Изучение протеолнтнчсской активности по отношению к бычьему сывороточному альбумину и камину, а также способности лидировать отмытые зршрошгш барана выявило, что образование прозрачных зон гемолиза через.

48 ч инкубации в воздушной среде, совпадала с высокой протеолитнческой активностью и вирулентностью. Акапсулыше и «ТОКСНГСННЫС штаммы, а также культуры, обладающие комплексом атипичных свойств, ik расщепляли альбумин н не вызывали лизис отмытых эритроцитов, Исключение составили акапсульный штамм 13/39, который, о отличие от всех бескапсулииых штаммов, не имел дополнительных питательных потребностей, был протеолитически активным и формировал прозрачные зоны лизиса при посевах на чашки с отмытыми эритроцитами барана к инкубированных как описано шик, и протеолитически неактивный штамм 881, способный вызывать гемолиз в данных условиях. Полученные результаты подтвердили данные ряда автором (Еременко Е. И-, 1986; Цыганкова О. И., 1993; Буравцева НЛ. с соавт,. 1997; Соркисова II, В, 2002).

Интсрест, 1Ш наш вчгдяд. было оценить влияние углекислоты на способность штаммов В anthracis ШЗЫМть гемолиз прн посеве на aiap с 5% лефибрнннроваиной крови барана и на лизнс отмытых эритроцитов барана. Исследования покопали. что гемолиз иц 5% кровяном агаре в течение 4? ч отсутствовал как прн инкубировании в воздушной среде, так н, а атмосфере 3% CO., д лизис отмытых эритроцитов через 24 ч инкубации был менее выражен При культивировании с СО|, чем при инкубации в воздушной атмосфере. Напротив, более продолжительная инкубация в атмосфере с содержанием 3% СО} стимулировала гемолитическую активность по отношению к отмытым эритроцитам уже через 48 ч, а к 72 ч осе культуры проявляли способность лидировать отмытые эритроциты барана. При тгом протеолитически активные типичные вирулентные культуры и штаммы 13/39 и 881 с отличиями соответственно в капсулооброзовоини и спорообразовании формировали широкие прозрачные, а атипичные акалсульные, втокснгенные, протеолнтнчески неактивные культуры и штаммы с дополнительными питательными потребностями — узкие мутные зоны гемолиза. Менее всею гемолитическая активность была выражена у штаммов, имеющих комплекс атипичных свойств — шшгешкп, низкая нротеолитцческвя активность и д<�яюлиительные пнвтсл ьныс потребности,.

Сравнительное изучение штаммов близкородственных баонлл рода В ccnrui по основным для сибнрсюнснного микроба фенотяпНЧеслнм теспн вышило как межнттаммоаис отличи* сапрофнтов, так и сходства по ттнм признакам с исследованными атипичными и типичными штаммами В anlhracis. Все без исключения штаммы близкородственных садтрофнтои росли на дифференциально-диагностической среде для сибиреязвенного микроба, содержащей полимнкенн и трнметопркм. Палочки 31 культуры близкородственных бацилл были неподвижны, характер роста на питательном бульоне двух культур сапрофито" был не отличим от такового у двух iигамиов В anlhracisпристеночное кольцо или легкая пленка на поверхности прозрачного бульонарост на питательном агаре в R-форме с крупными, грубыми завитками, был характерен как для большинства сапрофнтов, так н для некоторых штаммов сибиреязвенного микроба, л одни «профит, ка* и одна культура В anlhracis, рос в SM-форме, т. е. формировал капсулу как на питательном агаре на воздухе, так и на 1% бикарбонат ном агаре в атмосфере повышенного содержания СО?. Слабоиоложитсльная активность в тесте на щелочную фосфатазу была присуща 7 штаммам близкородственных бацилл и 2 нзолятам сибиреязвенного микробаодни сапрофит фосфатазной активностью не обладал. При выращивании культур на азотной среде с желтком куриного яйца выявлено 11 лешгтинаэомегатнвиых епорвобразуюших сапрофитов (27 штаммов В anthracis) и 39 штаммов, облвдпюптих различным уровнем лецнтнназиой активности (15 штаммов В anihracu). Гсмолипгчески неактивными оказались б штаммов близкородственных бацилл.

Ряд штаммов близкородственных сапрофитов обладал сочетанием нескольких фенотнпических признаков, характерных как для типичных, так и «типичных нзолятов яозбу д^исля сибирской язвы, что создавало определенные трудности при проведении дифференциации. Наиболее значимым, па наш взгляд, явилось выявление трех культур неембнрапвеиных бацилл, сочетавших неподвижность с отсутствием гемолитической активности (тги штаммы также были лештпаооиетатгвнымн) Оби"руже"ше неподвижных Гром-положительных спорообразузосцих палочек, не обладающих гемолитической активностью, является с1н*иальным тестом для предварительной идентификации штамма кок В, anthracis нв первом уровне четырехступенчатой системы детекции возбудителя сибирской язвы как агента бнотсррор"пма, принятой в Департаменте здравоохранения США (Khan A Set al-, 2000; Miller J.M. 2001; Heller МЛ. e» al, 2002; Perkins B.A. el al, 2002). Потому, полученные нами результаты подтвердили данные некоторых исследователей (Gurunann D M, Ellax D J. 2000; Dib E G. et al., 2003) и свидетельствуют о том, что баниллы, ж обладающие нолвижностью и гемолитической активностью не всегда является возбудителем сибирской язвы, а сочетание этих двух свойств может быть присуще и другим представителям рода Bacillus.

В данной выборке отсутствовали штаммы близкородственных бацилл, чувствительные к действию сибиреязвенного бактериофага «Гамма А-26».

Особого внимания заслуживают результаты определения чувствительности к пенициллину сиорообразующнх сапрофитов в тесте «жемчужного ожерелья», который используется в качестве одного нз сигнальных методов при идентификации возбудителя сибирской язвы При постановке данного тесга как минимум 6 штаммов близкородственных бацилл из пашей выборки изменяли свою клеточную морфологию под действием 0,05 и 0,5 Ед/мл пенициллина в среде При микроскопии визуализировались несколько типов клеток: «классические» сфероплвсты, расположенные одиночно, попарно или короткими цепочками, раэдутые промежуточные формы и небольшое количество иитзхтиых палочек. На основании вышеизложенной картины тест «жемчужного ожерелья» у этих штаммов был расценен как сомнительный.

Сведения о нечетких результатах теста «жемчужного ожерелья» имеются и в литературе (Ипатенко Н.Г. с соввт, 1995) Кроме того, иг литературных данных следует, что чувствительность в ДАННОМ тесте проявляли около 5% близкородственных микробов (Груз ЕВ., 1965; Шляхов Э. Н. с совят., 1975; Мари unit Л И. с соавт., 1999), в отдичне от 12% штаммов в нашем исследовании Поэтому, исходя иг вышеизложенного, было произведено определение чувствительности в пенициллину методом днффушн в отар, в результате чего была выявлена однозначная резяететтюсп. к данному антибиотику всех штаммов слорооброзукниих сапрофитов, за исключением одного. Таким образом, замена трудно воспроизводимого и, зачастую ведущего к неоднозначной интерпрстадии результатов, теста «жемчужного ожерелья» на определение чувствительности к пенициллину методом диффузии в агор с коммерческими дисками с пенициллином, позволила избежать сомнительных результатов и уменьшить частоту встречаемости чувствительных к нацщиллииу штаммов бдизкородетвеиных баиилд с 12% до 2%.

Результаты проведенных исследований фенотнпических свойств близкородственных бацилл соответствует данным ряда исследователей {Мелихов А. Д, 1957; Груз 1965; НЕляхоа ЭЛ. с соавт-. I97SМаринин Л И. с соавт, 1999; Doucy D. et al" 2003 н др.), как и тот факт, что такие свойства как неподвижность, характер роста на плотных н жидких питательных средах, данные биохимических тестов, позволяют выявить внутривидовые рипдичня и межвидовые сходства штаммов возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл, что указывает лишь ив ориентировочную значимость этих признаков. Для идентификации н дифференциации культур необходимым является использование всего комплекса имеющихся на данный момент фенотип ических тестов.

Следующий этап нашей работы заключался о ргзученни геномных характеристик штаммов енбиреязвешюго микроба и близкородственных бацилл. Как известно, представители группы В сtrtus генетически чрезвычайно близки, о чем свидетельствует практически 100%-нвя гибришзацианим гомология нх хромосомной ДНК (Somerville H.J., Jones ML., 1972; КилеЬо Т, et at., 1978), Результат MEF-, сравнительного определения вуклсстндных последовательностей н секвенировоние I6S г RNA показали, что отдельные штаммы В сегеш были подобны или идентичны штаммам В ant гhrас, а и В thuringtensls {Kolsto А.В. et al., 1999; 2001). Данные о чрезвычайно близком родстве некоторых штаммов В ctreus и В thwingiensis нзолятам сибиреюкниосо микроба подтверждены результатами ссквенирования, сравнительного анализа п осле довотел ьносте ii генома и AFLP (Han C.S. et al., 2006), ПЦР по иисерцнонным сайтам рестрикции (RSI-PCR) (DafFonchio D. et al., 2006). Кроме лого, в геномах близкородственных бацилл подтверждено наличие последовательностей, подобных токенниой пяаэмиде pXOI (Pannocci J. et al., 2002;aНоГГтаНы A A. et al-, 2004; Rasko DA, et al., 2004; Ehling-Schul/, M et al 2006) и хвпеульной плазмнде pX02 В antrhracis {Pannucci J. ct al. 2002;bLuna V.A. et al, 2006).

Постановка ПЦР с праймерамн к локусу сарС, локализованному на плазмнде рХ02, выявили отсутствие амплификации с ДНК 20 штаммов В anthracis, что соответствовало нх акапсульному фенотип}', Пробы ДНК всех без исключения тестируемых штаммов В. anthracis амплифицнровалнсь с праймерамн к pXOIлокализованным генам, ответственных за синтез компонентов токсинов, pag. суа. Iff, и оперона прорастания спор В anthracis gar X, хотя 7 иггаммов фслотигтнчсскн |к мспресснровалн признак токсинообраэовання in vitro, Подобные нарушения синтеза токсина, по данным P.F. Fellow (1996) и Е. И. Еременко (1997), по всей видимости, обусловлены мутациями, а структурных и регуляторных генах. Все без исключения штаммы близкородственных бацилл продемонстрировали отрицательный результат ПЦР с праймерамн к последовательностям плазмндных генов сарС. pag, ста, lef и gcrX.

Апробация нраймеров к хромосомным последовательностям BaSI3, dhp73.009, гроВ (р-су^ьсднннив РНК-под имс разы В. anthracis), предложенных как вндоспецнфичные для возбудителя сибирской язвы, продемонстрировала их недостаточную специфичность Так, праймсры к вышеописанным локусам, работа* со всеми штаммами В anthracis, амплнфицчроваянсь также с ДНК некоторых штаммов несибиреяжничх бацилл: с ДНК 16 шгаымои при тестировании праймеров к последовательностям BaS/З и с&рУ} 009, с пробами ДНК 9 штаммов прн использовании праймеров к локусу гроВ,.

Высокую специфичность проявили п рай меры к хромосомному гену S-слоя юр, поддерживая ГИДР исключительно с ДНК В. anthracis. Использование зтой пары праймеров в мулътнпраймерной ГИДР совместно с праймерамн к генам суа, (pXOI), сарС (рХ02) позволяло как идетнфюшроватъ штаммы В anthracis с любым набором платмнд, так и дифференцировать их от несибиреяэвеииых бацилл рода Baciihts.

Постановка ПЦР с праймерамн к бак тсрнофагос вязы вающему хромосомному участку Е4 с соблюдением условий реакции, предлагаемых автором (Dwyer Кet al., 20CW), показала недостаточную иидоспецифичностъ. Оптимизация параметров ГИДР позволила добиться амплификации только с ДНК В anthracis, а использование праймеров к локусу Е4 в одной ямллкфнклцнонлой смеси с праймерамн к последовательностям он и сарС дало возможность применять тот набор, а качестве варианта мультиплексной ПЦР для идентификации любых штаммов сибиреязвенного микроба н их ДНффсрСКШВДНН от бл"гткорадствснных бацилл,.

Известно, что фенотипнчсские различия между В anthracis с одной стороны и В cereus — В thurtngiettiLj с другой, по крайней мере, частично могут быть связаны с тем, что плейотроиный регулятор Мстряцеддюмршга факторов галогенНОСТИ PlcR. выступающий регулятором большого количества генов у В cere us н В thurlngiemts, является функционально «безмолвным» у В anthratts (Agiiw Н. я я]., J 999, КоЫо Л, В. et а)., 2001 и др.). Поэтому было интересно выявить различия между штаммами В anthrac’a и нсснбнрсязвсннымн бациллами с использованием праймеров к фрагментам генов фосфатидил инозитол-епсцнфичес кой фосфолнпазы С в сегеш и В. ihur/ngicnsis ijripicbc), фосфатидил ииоэнтол-специфичсской фосфолнпазы С В anthrocis {piptcba). фосфатчднл-ходин-спеиифической фосфолвтзы С В thurigtensis (picА), а также ингибитора иммунитета ?1 anthrocis [InA) и энтсроюкспиа S В сета и В thuringtensis {en! 5), разработанных D M Gunman и DJ. ELIlar (2000). Последовательности, ам плифицнру юшнеся с праймерами к гену piplcba имелись у всех исследованных бациллярных штаммов ДНК большинства HXUttTOB епчрообразуюших сапрофитов поддерживали амплификацию с праймерами к последовательности гена ptplcbc, в отличие сп основного количества штаммов В. anthrocis. Амплнконы с праймерами к гену pic Л выявлялись с ДНК большинства штаммов нссибиреязвскиых бацилл, в изодятов В. anthrocis (рХОГ, pXOI"), но не определялись или были слабо выражены у штаммов В anthrocis (pXOI рХ02*) и остальных акапсульных культур, Основная чисть протестированных бацилл образовывала ампднкоиы с праймерами к гену ингибитора иммунитета В anthracii Продукты амплификации с праймерами к гену cnl S обнаруживались у большинства сапрофитов, вирулентных игтачмоп В anthrocis, lto не выявлялись или были слабоположтельиыми у большей части культур В anthrocis (pXOIpXffi").

Исследование ДНК штаммов В anthrocts с праймерами к последовательности гена транскрипционного регулятораp/cR (Еременко Е И, с соавт, 2004) позволило обнаружить этот фрагмент у 74% штаммов сибиреязвенного микроба.

Тестирование бациллярных штамма* ид наличие генов dip /. dip 2 ферритин-подобных белков В anthracii, претендующих на роль дополнительных факторов 1ыюгс1шкгн сибиреязвенного микроба (Papinutro Е. et aJ., 2002), не позволило выявить ни меж-, ни внутривидовых различий штаммов В anthracii и спорообразузоших сапрофитов. гены ферритинов были ндентнфи иированы у всех без исключения исследуемых бацилл, что добывает жшнениую ввжиОСТЪ их функции кож для сибиреязвенного микроба, гак и для прочилбацилл,.

Амплификация с првймсроми к рХ02-локалиэованной последовательности гена AMI аутолизинв Н anthracis, сшс одного фактора, предположительно участвующего в патогенеза сибиреязвенной инфекции fMcsnaye Я., Fouct Л., 2002), проходила у веек рХ02', но не у рХ02″ ипаммов сибиреязвенного микроба, что можег служить дополнительным подтверждением наличия или отсутствия плвМКДЫ рХ02 в геноме тестируемых иэолятов.

Геном В anthracis характеризуется высокой степень" гомогенности и мономорфностн, в отличие от полиморфных В. Crrru. f И Н ihuringiensis (Keim P et iL, 1997; 1999; Helgason Ё el al-, 1998) Но обнаружение маркеров полиморфизма, включающих в себя пилотные повторы (VNTR), а также использование MLVA стали толчком в развитии молекулярного тклироваиня штаммов В. anthracis и предоставили надежные критерии для дифференциации различных изолятов сибиреязвенного микроба (Keim Р, е (а!., 2000).

Предварительное генотипиромише, но вариабелыюму локусу vrrA показало, что изучаемые штаммы В anthracis были представлены тремя категориямиVNTRj, VNTR* и VNTR, с преобладанием самой распространенной в мире J-оЙ VNTR-кате горн и Было выявлено, что ауксотрофиые штаммы и их прототрофные варианты относились к различным VNTR-катсгориям,.

Определение генотипа по схеме PKeim el al- (2000) с использованием только хромосомных л о кусов (ипгА, wrB|, vrrBi, v/rC), vrrCj н CG3) дало возможность разделить штаммы на 7 ГеИОТНПОВ.

Последоватсльность с вариабельными тандемнымн повторами СеЬ-Вап" 13 (l, e Flech Р el al., 2001) гена ЬсМ кодлагеноподобиого поверхностного гликопротеина в изученной выборке штаммов сибиреязвенного микроба была представлена четырьмя аллсльнымн вариантами Вариабельность числа тандемных повторен и гене ЬсМ, ответственного за синтез этого нммуиоломннаитиого белки, прямо связана с длиной филамешов экэоспориума < Sylveslre P. ct al, 2003),.

Анализ вариабельности по хромосомному локусу Ceb-Bams 13 выявил такое же распределение по генотипам, как н по системе P. Кот et al. (2000).

MI.VA по шести вышеописанным хромосомным н двум лдаэмидным локусам (pXOl-dal, рХ02-й) распределил изучаемые оттаммы В anshracis на 12 генотиповшесть из них соответствовали описанным ранее (пять полных и один неполный в связи с отсутствием амплификации с праймерами к локусу рХ02-аИ), остальные шесть наборов омплнконов отличались от известных генотипов, но одному и более локусам и ранее описаны не были (пять полных it один)"с1Юлиый) Анализ ноаучеииых генотипо* позволь отнести изучаемые штаммы к пяти различным подгруппам обоих известных кластеров A (Al a, Alb, A3, л, А4) и В (BI) В ходе исследования было выявлено, что штаммы 228 и, НО П с комплексом атипичных свойств, ¦тмчшнцни нарушение токсниобразования, гемолитической и протеолитической активности, дополнительные питательные потребности, их производные с такими же свойствами (генотипы 93 и 1С new) имели отличия от вариантов этих штаммов, типичных по всем перечисленным свойствам, и типичных природных штаммов (генотип 95), в размерах амплкконо" мши из шести хромосомных локусоп (итА, vrrB], ittCi, vrrCi, CG3) и плазмзиного локуса pXOl-aot.

С целью определения возможности использования праймеров EWAi. j к локусу w*A н 8-и локуе|юго MI. VA для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл роля ВасгИю была проверена их специфичность при постановке ПЦР с ДНК близкородственных сапрофитов. Амплификация с праймерами EWAi-j была получена с пробами ДНК 57,5% штаммов н ее ибире язвенных бацилл, при этом злектрофорстнчеснм подвижность омплнконов 15 штаммов была близко к подвижности вмштнконов В mthracis, но ни у одного штамма сапрофитов не было выявлено ампликоноа с размерами. идентичными В anlhracis. Результаты MLVA с пробами близкородственны* бацилл показал, что ДНК этих штаммов либо не амплифицироващю. с прайм срами ко веем хромосомным по* у сам, либо темериропади амплчкоиы с праймерами к отдельными локусам, но при этом размеры фрагментов н их совокупности отличались от размеров, описанных для В an throe и, а амплификация с праймерамн к нлазмндным локусам не происходила.

Нами было показано, что MLVA обнаруживает, помимо общепризнанной географической привязки определенных генотипов. характерные геиотнтш для атипичных штаммов с измененными феиотнническими признаками капсуло-, токеинообрлзовання, гемолитической, протсолитнчсской активное&tradeи ростовых свойств.

MLVA также позволяет одновременно и с высокой достоверностью определить генотип, отличить некоторые атипичные штаммы сибиреязвенного микроба от типичных и дифференцировать любые штаммы В anlhracis от прочих бацилл.

Полученные данные дают возможность применения вышеописанных праймеров для дифференциальной диагностики штаммом возбудителя сибирской язвы и спорообратуюших сапрофнтов.

Таким образом, атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы не является редкостью, а частота их выделения приблизительно равна таковой иеснбнреязвешшх бацилл, ошибочно идентифицированных выделившими нх учреждениями как В anlhracis. Проведение сравнительного изучения фенотипических и молекулярио-бнологических свойств типичных, атипнчтшх штаммов В anlhracis и близкородственных бацилл позволило сделать заключение как о внутривидовой вариабельности, так и о межвидовых сходствах бациллярных штаммов Оптимизация процессов идентификации и дифференциации может быть достигнута при использовании ««амеи теста «жемчужного ожерелья» в существующей схеме межвидовой дифференциации метода диффузии в агар с коммерческими лисками с пенициллином, а н дополнение к тгой схеме и для внутривидовой дифференциации Использовать предложенный вариант мультипраЙмерноИ ПЦР и метод MLVA по 6 хромосомным и 2 плазмндным локусам (Keiin P. et aL, 2000) в нашей модификации (Цыганкова О.И. с еоплпч 2002).