Исследование иммунновоспалительных маркеров развития атеротромботического ишемического инсульта и механизмов реализации ишемического повреждения головного мозга

Медико-социальные аспекты проблемы церебрального инсульта.

Согласно международным эпидемиологическим исследованиям ежегодно^ в мире регистрируется более 30 миллионов случаев инсульта, из них умирают 4,7 млн человек. По данным ВОЗ, за 2004 г инсульт занимает первое и второе' место среди ведущих причин смерти в странах со средним и< высоким уровнем дохода соответственно, и в целом — второе место в мире, уступая лишь ишемической болезни сердца [12].

Инсульт является одной из ведущих причин смерти и инвалидизации в Европе, и по мере старения населения бремя этого заболевания для общества будет становиться все тяжелее [28].

По данным современных крупных международных исследований {STONE, Syst-Eur, NICS), в структуре сердечно-сосудистой патологии инсульты стали преобладать над инфарктами миокарда по частоте примерно на 30% («инсультный парадокс») [15]. Существует множество объяснений «инсультного парадокса». Наиболее обоснованной представляется связь инсульта с продолжительностью жизни [15,90]. Ежегодный риск инсульта в возрастной группе 45 — 54 года составляет 0,1%, 65 — 74 —1%, старше 80 лет -5% [30,89].

По данным регистра инсульта, в России ежегодно переносят инсульт более 450 тысяч человек, т. е. каждые 1,5 минуты у кого-то из россиян впервые развивается данное заболевание, при этом до 200 тысяч случаев заканчиваются летальным исходом, а из выживших пациентов до 80% остаются инвалидами разной степени тяжести. Доля острых нарушений мозгового кровообращения в структуре общей смертности в нашей стране составляет 21,4%, уступая лишь смертности от ишемической болезни сердца, а инвалидность после перенесенного инсульта достигает 3,2 на 10 тысяч населения, занимая первое место среди всех причин первичной инвалидности. Лишь около 20% выживших больных могут вернуться к работе [5]. Уровень заболеваемости инсультом в-Москве за последние 20 лет вырос с 2,2 до 3,5 на 1000 населения. [3].

Согласно Хельсингборгской декларации о европейских стратегиях в" отношении инсульта (2006 г.), приоритетным направлением в области научных исследований и разработок является, наряду с другими, разработка новых методов лечения ишемического инсульта, таких, как нейропротекторные препараты и другие лекарственные препараты и гипотермия.

Для этих целей необходимо изучение механизмов, реализующих формирование очага ишемии, степени вовлечения и влияния иммунной системы, в том числе элементов врожденного иммунитета, воспалительного" ответа и других факторов на патологический процесс, а соответственно и степень тяжести заболевания. Известно, что доформирование очага церебрального инфаркта происходит за счет активации генома с включением генетически-запрограммированных молекулярных механизмов, ведущих к развитию иммунных изменений, локального воспаления в очаге ишемии, апоптозу и апо-некрозу [4].

Новым направлением в изучении патогенеза ишемического инсульта является исследование значения системы врожденного иммунитета. Было показано, что активация клеток врожденной иммунной системы происходит через особые рецепторы — То11-подобные рецепторы (ТЬЯ), принадлежащие к семейству трансмембранных рецепторов, в результате чего происходит выработка разнообразных эффекторных молекул (цитокинов и других медиаторов иммунного ответа, воспаления и регенерации). Намодели экспериментального инсульта получены убедительные данные, подтверждающие участие ТЬЯ4 в формировании очага ишемии, а также возможность активации этих рецепторов эндогенными лигандами — белками теплового шока 70 (БТ1И70) [56,165]. При этом БТШ70 могут как активировать синтез провоспалительных медиаторов посредством активации ТЪЯ4, так и выступать в качестве нейропротекторов и защищать клетки от апоптоза [17].

В результате исследований FasL-индуцированного апоптоза, произведенных на модели ишемического инсульта Н. Mehmet и MartinVillalba-и соавт., было показано, что нейтрализация FasL приводит к уменьшению объема очага ишемии у экспериментальных животных, [122,127].

Последние десятилетия активно изучается роль ФНО-а и ИЛ 10 в ишемическом повреждении головного мозга. Ряд основополагающих работ был проведен на кафедре фундаментальной и клинической" неврологиии нейрохирургии РГМУ. Был выявлен дисбаланс цитокинового статуса с дефицитом защитных противовоспалительных интерлейкинов и трофических факторов [23*24], определена теснаякорреляция ' выраженности иммунобиохимических изменений с тяжестью и клиническим исходом инсульта. При этом установлена неодназначная роль при ишемическом инсульте некоторых регулирующих молекул, в том числе ФНО-а, которому свойствены как нейропротективные, так и агрессивные свойства. Аналогично ФНО-а, ряд работ выявили признаки разнонаправленного действия «противовоспалительного цитокина» ИЛ 10 [85, 97].

Интересна роль матриксных металлопротеиназ (ММП) в ишемическом повреждении головного мозга. В работе Рамазанова Г. Р. с соавт. была установлена роль ММП-9 в формировании осложнений после проведения тромболитической терапии у пациентов' с ишемическим инсультом [19]. Ряд исследований описывают повреждающее воздействие высоких концентраций ММП при экспериментальном ишемическом инсульте [153,154].

Несмотря на большой объем исследований иммунно-воспалительного статуса пациентов с ишемическим инсультом, многие вопросы остаются открытыми. Так, экспрессия TLR4 не изучена в клинических условиях у пациентов с ишемическим инсультом. Требует исследования комплексное взаимодействие системы врожденного иммунитета и индуцированных в ответ на ишемию воспалительных реакций и апоптоза при ишемическом инсульте. Все это определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.

Цель: Исследование иммунных, воспалительных процессов и параметров апоптоза у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта в зависимости" от особенностей клинического течения заболевания.

Задачи исследования,.

1. Оценка уровня экспрессии поверхностных ТОМ клеток периферической крови (моноцитов и гранулоцитов), ее динамики и клинической значимости у больных с ишемическим атеротромботическим инсультом и в контрольной группе.

2. Определение содержания и динамики изменений внутриклеточных БТШ70 мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови у больных с ишемическим инсультом, определение взаимосвязи их концентраций с клиническими особенностями заболевания и размерами очага поражения головного мозга.

3. Определение уровня и динамики сывороточного вРавЬ, ФНО-а и ИЛ 10 у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта в зависимости от его клинических особенностей и размеров очага поражения головного мозга.

4. Изучение активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом в первый день заболевания и в динамике острого периода в зависимости от клинических особенностей течения заболевания, а также от уровня таких регуляторов, как БТШ70, ББазЬ, ФНО-а.

5. Определение динамики концентрации циркулирующей ММП-9 у пациентов в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта и оценка ее клинической значимости, сопоставление с размерами очага ишемического повреждения головного мозга.

Научная новизна.

1. Впервые был изучен уровень экспрессии ТЬЯ4, отражающих состояние системы врожденного иммунитета, на моноцитах и гранулоцитах периферической крови пациентов с атеротромботическим ишемическим-инсультом. Показано, что уровень экспрессии поверхностных ТЪЯ4 на моноцитах больных с изучаемой патологией коррелирует со степенью тяжести состояния пациентов в остром периоде заболевания (г=0,79, р=0,03'), что, возможно, свидетельствует о клинической значимости активации экспрессии ТЬЯ4 моноцитов периферической крови в патогенезе ишемического инсульта.

2. Впервые исследован уровень активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом, выявлено его достоверное повышение по сравнению с контрольными значениями (р<0,05) и максимальное нарастание к 7-м суткам заболевания.

3. Впервые исследовано содержание и динамика изменений внутриклеточных БТШ70 мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом. Определена обратная зависимость интенсивности спонтанного апоптоза клеток периферической крови пациентов с ишемическим инсультом и уровня внутриклеточного БТШ70, что отражает антиапоптотическую направленность этого шаперонного белка.

4. Впервые проведена комплексная оценка иммунных, воспалительных маркеров и параметров апоптоза, изучено их клиническое значение у больных в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта. Определена временная взаимосвязь между развитием воспалительной реакции и активацией системы апоптоза при атеротромботическом ишемическом инсульте, нарастающая к 7-м суткам заболевания и формирущая единый пул «отдаленных последствий ишемии».

Научно-практическая значимость работы.

1. Лейкоцитоз в 1-е сутки атеротромботического ишемического инсульта, следует рассматривать как предиктор тяжести заболевания (г=0,47- р<0,01), при отсутствии сопутствующей патологии, влияющей на данный показатель.

2. Достоверное различие концентрации сывороточной ММП-9 на 1-е и 7-е сутки заболевания у тяжелых и среднетяжелых пациентов, по-сравнению с легкобольными (р<0,006 ир<0,01), а также наличие статистически значимой, корреляционной зависимости между уровнем сывороточной ММП-9 и тяжестью инсульта на 1-е сутки (г=0,436- р<0,03) позволяют рассматривать ММП-9 как показатель тяжести ишемического инсульта.

3. Связь экспрессии ТЬЯ4 на моноцитах периферической крови и уровня циркулирующей ММП-9 с тяжестью атеротромботического ишемического инсультаа также подтверждение в клинических условиях антиапоптотических свойств внутриклеточного БТШ70 свидетельствуют о возможности разработки новых нейропротекторов, действие которых будет направлено на представленные молекулярные мишени.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлена клиническая значимость активации экспрессии рецептора врожденного иммунитета — ТЫ14 моноцитов периферической крови в патогенезе ишемического инсульта, что выражается повышением уровня экспрессии поверхностных ТЪЫ4 на моноцитах больных с атеротромботическим ишемическим инсультом, по сравнению с контрольными значениями, и его корреляцией со степенью тяжести состояния пациентов в остром периоде заболевания (г=0,79- р=0,03).

2. Показано, что уровень активности спонтанного апоптоза клеток периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно выше контрольных значений (р<0,05) в остром периоде заболевания, максимально нарастая к 7-м суткам и снижаясь до исходного уровня к 14-м суткам. Содержание индуктора апоптоза зРаэЬ в сыворотке крови также достоверно нарастает к 7-м суткам (р<0,05) у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом вне зависимости от тяжести заболевания.

3. Выявлено повышение уровня внутриклеточных белков теплового шока 70 в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта, по сравнению с контрольными значениями (р<0,05), и отрицательные корреляции их уровня с активностью спонтанного апоптоза периферических клеток крови (г=-0,75- р<0,01), что, возможно, отражает антиапоптотические свойства этого шаперонного белка.

4. Показано, что уровень сывороточной ММП-9, обладающей деградирующими свойствами в отношении соединительнотканных структур, отражает тяжесть течения атеротромботического ишемического инсульта: достоверно повышается на 1-е (р<0,01) и 3-е (р<0,03) сутки заболевания, по сравнению с контрольными значениями, коррелируя со степенью тяжести заболевания по №Н (г=0,44- р<0,03).

5. Проведенное комплексное клиническое и иммуннобиохимическое исследование маркеров развития атеротромботического ишемического инсульта установило временные взаимосвязи между инициацией и развертыванием процессов, участвующих в формировании отдаленных последствий ишемии (реакция системы врожденного иммунитета — ТЫ14, локальный воспалительный ответ — ФНО-а, апоптоз на примере спонтанного апоптоза клеток периферической крови и исследования индуктора апоптоза БраэЬ) и активацией компенсаторных защитных механизмов (синтез внутриклеточных БТШ70, регуляторных цитокиновИЛ 10).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 4 в отечественной центральной печати.

Апробация диссертационной работы.

Апробация диссертации состоялась на конференции кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии и НИИ инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (протокол № 12 от 04 июня 2010 года).

Основные результаты исследования были доложены на научных конференциях кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО РГМУ, И Российском международном конгрессе «Цереброваскулярная патология и инсульт» 17 сентября 2007 года, Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение», Пятигорск,.

20 мая 2010 года.

Внедрение результатов исследования.

Основные положения диссертации внедрены в лечебную работу отделений неврологии инейрореанимации ГКБ № 31 Департамента здравоохранения г. Москвы, научно-исследовательскую работу НИИ цереброваскулярной патологии и инсульта ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 20 таблиц, 16 рисунков, 3 клинических случая. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, 2 глав собственных результатов исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы состоит из 187 источника, включая 31 отечественных и 156 зарубежных.

ВЫВОДЫ:

1. Уровень экспрессии маркеров врожденного иммунитета — поверхностных ТЫ14 на моноцитах периферической крови достоверно повышается у больных с ишемическим атеротромботическим инсультом, начиная с 1-х суток заболевания (р<0,05), по сравнению с контролем, и к 14-м суткам коррелирует с тяжестью состояния больных (г=0,8- р<0,03).

2. Уровень спонтанного апоптоза клеток периферической крови (моноцитов и гранулоцитов) статистически значимо повышается у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом, начиная с 1-х суток (р<0,01), по сравнению с контролем, достигая своего максимума к 7-м суткам заболевания (р<0,002).

3. Содержание одного из индукторов апоптоза эРаэЬ в сыворотке крови достоверно нарастает к 7-м суткам ишемического инсульта (р<0,05), при этом концентрация зРаэЬ значимо не отличается у пациентов в зависимости от тяжести состояния, что, вероятно, отражает равную степень реализации РавЬ-индуцированного апоптоза при ишемическом инсульте разной степени тяжести.

4. Содержание внутриклеточных белков теплового шока 70 в клетках периферической крови в конце 1-х суток ишемического инсульта достоверно превышает контрольные значения (р<0,05). Уровень белков теплового шока 70 на 1-е, 7-е и 14-е сутки инсульта обратно коррелирует с уровнем спонтанного апоптоза периферических клеток крови (г~0,75- р<0,01), что подтверждает антиапоптотические свойства внутриклеточного БТШ70.

5. Уровень ФНО-а у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно выше, чем в контроле, в течение всего острого периода заболевания. К 7-м суткам заболевания происходит достоверное нарастание концентрации сывороточного ФНО-а (р<0,05) по сравнению с 1 ми сутками только в группе тяжелых инсультов, что отражает роль локального воспаления в патогенезе церебральной ишемии.

6. Сывороточный ИЛ10 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом нарастает на 3-й сутки заболевания (р<0,02), по сравнению с контрольными значениями, и проявляет модуляторные функции при ишемическом процессе в головном мозге: с одной стороны, положительно коррелируя с концентрацией индуктора апоптоза — БРаэЬ (г=0,04- р<0,05), а, с другой — повышаясь у пациентов с более выраженной положительной динамикой восстановления неврологического статуса.

7. Уровень сывороточной ММП-9 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом достоверно повышается на 1-е (р<0,01) и 3-е (р<0,03) сутки заболевания, по сравнению с контрольными значениями, и отражает тяжесть течения инсульта, значимо преобладая у пациентов с тяжелым и среднетяжелым состоянием, по сравнению с легкобольными (р<0,006 и р<0,01), и коррелируя со степенью тяжести заболевания по N111 (г=0,44- р<0,03).

8. Уровень лейкоцитов на 1-е сутки заболевания статистически значимо коррелирует с объемом очага ишемии на 6−7-е сутки (г—0,47- р<0,01) и, тяжестью состояния в остром периоде заболевания (г=0,41- р<0,01), что позволяет расценивать лейкоцитоз в периферической крови в 1-е сутки ишемического инсульта как предиктор тяжести заболевания при отсутствии сопутствующей патологии, влияющей на данный показатель.

9. Проведенное комплексное клиническое и иммуннобиохимическое исследование маркеров развития атеротромботического ишемического инсульта установило временные взаимосвязи между инициацией и развертыванием процессов, участвующих в формировании отдаленных последствий ишемии (реакция системы врожденного иммунитета, воспалительный ответ, апоптоз) и активацией компенсаторных защитных механизмов (синтез внутриклеточных БТШ70, регуляторных цитокинов).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проблема церебрального ишемического инсульта является одной из наиболее актуальных проблем социальной и медицинской значимости в связи с высокой частотой развития заболевания, постоянным омоложением контингента заболевших, большим процентом инвалидности и смертности [4]. Изучение роли иммунного ответа, воспалительной реакции в развитии ишемического инсульта, влиянии на тяжесть заболевания и его исходов имеет важное значение с целью открытия новых подходов к диагностике, прогнозированию заболевания и поиску новых молекулярных мишеней для терапевтического воздействия.

Большое количество исследований, проведенных, в том числе, на кафедре фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, расширили представления об участии иммунновоспалительных процессов, генетических и молекулярных механизмов апопотза в патогенезе ишемического инсульта. Было показано, что при формировании инфарктных изменений в ткани мозга человека, имеется дисбаланс цитокинового статуса с дефицитом защитных противовоспалительных интерлейкинов и трофических факторов [8,9,23,24]. Была также выявлена тесная корреляция выраженности иммунобиохимических изменений с тяжестью и клиническим исходом инсульта [9], определена значимая роль аутоиммунных процессов в ишемическом повреждении головного мозга [3,6]. Изучено влияние ММП-9 на развитие осложнений после проведения тромболитической терапии [19]. Были проведены исследования, доказывающее влияние полиморфизма различных генов, в том числе индуктора апоптоза — гена Fas, на формирование очага ишемии при ишемическом инсульте [22].

В то же время, появляются новые сведения о роли врожденного иммунитета в формировании ответа головного мозга на ишемию. Так, продемонстрировано участие рецепторов врожденного иммунитета — Toll-подобных рецепторов 4 (TLR4), в развитии экспериментального церебрального инфаркта [167,180]. Результаты многих клинических исследований, например, по роли цитокинового статуса в патогенезе инсульта противоречивы. Исследования последних лет установили, что разнонаправленность эффектов ФНО-альфа может быть в частности связана с наличием двух типов рецепторов к данному цитокину [93]. Активно исследуются значение различных медиаторов апоптоза, в том числе Fas-лиганда (FasL), в патогенезе ишемического инсульта, возможное нейропротекторное действие белков теплового шока 70 (БТШ70), а также роль металлопротеиназ в развитии инфаркта головного мозга. [107,122]. Требуют дальнейшего изучения причины разного течения заболевания у пациентов с ишемическим инсультом при изначально одинаковых степени тяжести и локализации сосудистого поражения, что обуславливает поиск новых методов диагностики и прогнозирования течения ишемического инсульта. Все это определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.

В соответствии с целью и задачами, было обследовано 107 пациентов с церебральным ишемическим инсультом, из которых в исследование были включены 58 пациентов с атеротромботическим патогенетическим вариантом инсульта по критериям TOAST. Контрольную группу составили 20 пациентов без эпизодов ишемии в анамнезе, сопоставимые по половозрастным признакам и сопутствующим заболеваниям с основной группой.

В основную группу были включены пациенты с впервые возникшим атеротромботическим ишемическим инсультом, определяемым по критериям TOAST, поступившие в клинику в течение 24 часов от начала развития заболевания. Средний возраст составил 68,55±11,2 лет. Мужчин было 35 (60,3%), женщин — 23 (39,7%).

Для объективизации тяжести состояния, выраженности очагового неврологического дефицита и оценки динамики клинических показателей использовали шкалу инсульта NIH и оригинальную шкалу оценки неврологического статуса Е. И. Гусева, В. И. Скворцовой. Клинические исходы заболевания оценивали по модифицированной шкале Рэнкина на 14 сутки.

Лабораторные исследования включали в себя выполнение следующих анализов: общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, коагулограмму (АЧТВ, ПВ, ПТИ, MHO, фибриноген, тромбоциты).

Специальные методы исследования включали твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с использованием коммерческих имму, но ферментных наборов и тест-систем для определения содержания ММП-9, ИЛ 10, ФНО-а, sFasL в сыворотке крови и метод проточной цитофлоуриметрии для определения внутриклеточного БТШ70 и поверхностных TLR4 на клетках периферической крови, анализа интенсивности спонтанной программированной внутриклеточной гибели.

Компьютерно-томографическое исследование головного мозга проводили при поступлении пациента в стационар и на 6−7-и сутки инсульта. На томограммах определяли локализацию, характер и объем очага поражения головного мозга.

С целью верификации патогенетического варианта ишемического инсульта всем пациентам выполняли ультразвуковое исследование: дуплексное сканирование магистральных артерий головы, транскраниальную допплерографию и Эхо-КГ. Эхо-КГ исследование выполняли с целью исключения возможной кардиоэмболии.

Оценка неврологического статуса пациентов в первые сутки заболевания выявила ведущие неврологические синдромы, к которым относились пирамидная недостаточность (93,1%), речевые расстройства (37,8% по типу афазии и 53,4% по типу дизартрии) и нарушение чувствительности (48,3%). У 10 (17,2%) пациентов имелись расстройства уровня сознания.

Средний бал по шкале инсульта NTH на первые сутки заболевания составил 11,4±6,2, по оригинальной шкале оценки неврологического статуса 37,7±5,8. Инсульт с легким неврологическим дефицитом наблюдался у 17.

29,3%) пациентов, у 20 (34,5%) пациентов — средней степени тяжести и у 21 (36,2%) тяжелый инсульт. Средний возраст и пол пациентов статистически достоверно не различались в зависимости от тяжести инсульта. Более значимая положительная динамика на 14-е сутки наблюдения была у пациентов с инсультом средней тяжести и тяжелым.

При оценке восстановления неврологических функций по. модифицированной шкале Рэнкина на 14-е сутки заболевания благоприятные исходы чаще наблюдались у пациентов с инсультом с легким неврологическим дефицитом, по сравнению с пациентами, у которых состояние при поступлении в клинику оценивалось как среднетяжелое и тяжелое (р<0,001).

По результатам КТ головного мозга все инсульты были полушарными: правополушарная локализация ишемического очага повреждения была выявлена у 27 (46,5%) пациентов, левополушарная — у 31 (53,4%) пациентов. При проведении КТ на 6−7-е сутки инсульта, чаще всего ишемический очаг локализовался в теменно-височной области (41,7%) и в подкорковых структурах головного мозга (19,2%).

Наблюдалась закономерная прямая достоверная корреляция между объемом очага и степенью тяжести пациентов (г=0,73- р<0,05) и статистически значимые различия между объемом очага у легкобольных по сравнению со среднетяжелыми и тяжелыми пациентами (р<0,01). Была выявлена прямая корреляция высокой степени достоверности между уровнем лейкоцитов в периферической крови на 1-е сутки заболевания и объемом очага ишемии (г—0,47- р<0,01), что указывает на отрицательное значение бессимптомного лейкоцитоза на 1-е сутки ишемического инсульта и соответствует литературным данным [182]. В исследовании, посвященном изучению предикторов развития осложнений при проведении тромболитической терапии, также было указано на увеличение риска развития летального исхода у пациентов с ишемическим инсультом при повышенном содержании сегментоядерных нейтрофилов, вне зависимости от проведения тромболитической терапии [19].

Ультразвуковое исследование магистральных артерий головы у всех пациентов основной группы выявляло гемодинамически значимые стенозы (более 50% согласно критериям TOAST) причинных сосудов на стороне поражения. Не было выявлено достоверной разницы между степенью стеноза в зависимости от тяжести состояния пациентов, их пола и возраста.

Важным компонентом врожденной иммунной системы являются эволюционно законсервированные TLR, которые распознают как высоко консервативные структурные мотивы, экспрессируемые на патогенных микроорганизмах, так и эндогенные лиганды, к которым относят БТШ70, домен, А фибронектина, гиалурон [34,170]. В то время как физиологические концентрации эндогенных лигандов не вызывают активации клеток иммунной системы, при повреждении тканей их концентрация значительно возрастает, активируя TLR [68], что приводит к экспрессии широкого спектра генов провоспалительных молекул [18].

Результаты работ на экспериментальной модели ишемического инсульта показали, что TLR4 вовлечен в становление воспалительного ответа и влияет на формирование очага ишемического повреждения. S. Tang и соавт. выявили, что нейрональные TLR4 играют ведущую роль в индуцировании нейрональной смерти в течение первых нескольких часов после инсульта, а активация TLR4 микроглии поддерживает воспаление в зоне пенумбры [167]. Повышение уровня TLR4 ассоциировалось с нейрональной гибелью, инфильтрацией ткани мозга лейкоцитами [180].

Полученные экспериментальные данные определили необходимость исследования рецептора врожденного иммуннитета TLR4 в клинических условиях.

Известно, что TLR4 имеют практически повсеместную распространенность в организме человека, экспрессируются на клетках, осуществляющих первую линию защиты (нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки), на эндотелиальных и эпителиальных клетках слизистых тканей и др. [34].

Так же их эндогенные лиганды могут циркулировать в периферической крови, что делает возможным исследование экспрессии ТЬЯ4 в клетках периферической крови при ишемическом инсульте.

При исследование экспрессии Т1П4 на моноцитах и гранулоцитах у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом было выявлено, что экспрессия ТЬЯ4 на моноцитах основной группы была достоверно выше уровня экспрессии ТЬЯ4 на моноцитах группы контроля на 1-е сутки (р<0,05) заболевания.

Экспрессия гранулоцитарного ТЬЯ4 у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом на 1-е, 7-е и 14-е сутки достоверно не отличалась от таковой в группе контроля.

Таким образом, мы впервые выявили, что у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом экспрессия ТЬЯ4 на моноцитах периферической крови превышает экспрессию рецептора на гранулоцитах в острый период заболевания.

Было получено 2 типа экспрессии ТЬЯ4 на моноцитах в образцах крови, взятых у одних и тех же пациентов: достоверно высокая за весь наблюдаемый период ((р<0,000) и достоверно низкая (р<0,001) по сравнению с контрольными значениями.

Возможно, данное различие экспрессии ТЬЯ4 на моноцитах у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом объясняется наличием цикличности процесса экспрессии рецептора, при котором у части моноцитов уже запущены генетически-молекулярные программы, направленные на максимальную экспрессию рецептора, в то время как другая часть моноцитов еще не активирована. Кроме того, это может быть связано с естественным циклом синтеза/распада рецептора на поверхности моноцитов. Учитывая небольшую группу наблюдения, включенную в наше исследование, полученные данные требуют дальнейшего изучения.

Было показано, что стимуляция ТЬЯ4 приводит к усугублению патологического процесса, увеличению размера инфаркта головного мозга [92]. В работе ХЯ. СаБО с соавт. было обнаружено достоверное уменьшение зоны, инфаркта у мышей нокаутных по ТЬЯ4, по сравнению с диким типом [56].

В настоящей работе корреляционный анализ выявил статистически значимую достоверную прямую взаимосвязь между экспрессей ТЫ14 на моноцитах на 14-е сутки и степенью тяжести состояния пациентов по N11188 на.

1-е (г=0,74- р=0,03), 7-е (г=0,75- р=0,05) и 14-е (г=0,79, р=0,03) сутки заболевания, что указывает на клиническую значимость ТЬЯ4 в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта.

Таким образом, нами впервые показано, что у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом экспрессия ТЬЯ4 на моноцитах достоверно повышается на 1-е сутки по сравнению с группой контроля, в то время как экспрессия ТЬЯ4 на гранулоцитах достоверно не превосходит контрольные значения. Полученные прямые достоверные корреляции уровня экспрессии ТЬЯ4 на моноцитах на 14-е сутки с тяжестью состояния пациентов, на 1-е, 7-е и 14-е сутки, позволяет говорить о вовлечении ТЬЯ4 в патогенез атеротромботического ишемического инсульта.

Установлено, что при развитии инфаркта мозга наряду с некротической гибелью клеток, в очаге ишемии происходит активация апоптоза. Механизмы апоптоза включаются позже быстрых реакций некротических каскадов и начинают проявлять себя в полной мере через 12 часов, достигая максимума на.

2−3-и сутки инсульта, участвуя в «доформировании» очага ишемии [4].

Вследствие ишемии тканей, возникает каскад сигнальных взаимодействий, вызывающих программированную клеточную гибель не только в тканях, но и в циркулирующих клетках иммунной системы [132], что объясняет интерес к изучению уровня спонтанного апоптоза клеток периферической крови при ишемическом инсульте.

Исследование уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом выявило достоверное повышение его уровня по сравнению с контрольными значениями на 1-е (р<0,003), 7-е (р<0,003) и 14-е (р<0,01) сутки" заболевания для моноцитов и на 1-е (р<0,01) и 7-е сутки (р<0,002) для гранулоцитов. К 7-м суткам уровень спонтанного апоптоза у пациентов с ишемическим инсультом достоверно повышался (р<0,01), достигая максимальные значения за весь период наблюдения. К 14-му дню регистрируемый уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов пациентов основной группы достоверно снижался (р<0,05).

Универсальным регулятором апоптоза, играющим мультифункциональную роль в патогенезе ишемического инсульта, является sFasL. Fas-L реагирует с тремя молекулами Fas, вызывает активацию апоптоза каспазным путем и без участия каспаз [27].

Проводимые исследования доказали положительный эффект от нейтрализации FasL на модели ишемического инсульта, проявляющийся уменьшением размера очага ишемии и улучшением исходов заболевания у экспериментальных животных [122]. Ряд работ выявил повышение экспрессии FasL на клетках микроглии при ишемически-гипоксическом воздействии на нее, и определил, что микроглия и периферические иммунные клетки могут выполнять свои функции в доформировании очага ишемии только при наличии sFasL [127, 176].

Исследование sFasL у пациентов с ишемическим инсультом выявило достоверное увеличение его уровня на 7-е (р<0,000) сутки по сравнению с группой контроля. На 1-е и 3-й сутки уровень sFasL достоверно не отличался от контрольного, что подтверждает отсроченное действие факторов апоптоза в патогенезе ишемического инсульта.

На 1-е сутки заболевания у тяжелых пациентов отмечалось незначимое повышение концентрации сывороточного sFasL, по сравнению с пациентами средней тяжести и легкими (р>0,05). В динамике у всех пациентов основной' группы происходило увеличение концентрации sFasL к 7-м (р<0,05) суткам^ заболевания, без значимых различий в зависимости от тяжести состояния, что отражает равную степень реализации FasL — индуцированного апоптоза у пациентов с ишемическим инсультом не зависимо от степени тяжести.

Сравнительный анализ спонтанного апоптоза клеток периферической крови и изучение уровня sFasL, как апоптозмодифицирующего фактора, показал, что концентрация sFasL в сыворотке крови у пациентов с ишемическим инсультом, также как и уровень спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов, нарастает к 7-му дню заболевания, по сравнению с 1 -ми сутками.

В задачи нашего исследования не входило изучение механизмов реализации спонтанного апоптоза клеток периферичексой крови у пациентов основной группы. Известно, что кроме sFasL в качестве индукторов апоптоза могли выступать другие физиологические индукторы, как напрмер TNFb (лимфотоксин), TRAIL (Apo2L), CD40L, CD27L, CD30L, OX40L. Кроме того существую другие пути передачи сигнала апоптоза: с участием эндоплазматического ретикулума и митохондрий [27,29].

Однако, оценивая результаты проведенного исследования можно сделать вывод, что, несмотря на различные сигнальные пути индукции апоптоза в том или ином случае, апоптотические системы реализуют свое действие практически одновременно.

Таким образом, за наблюдаемый нами период, уровень sFasL достоверно не отличался у пациентов разной степени тяжести и к 7-м суткам статистически значимо нарастал у всех пациентов с атеротромботическим инсультом, одновременно с уровнем спонтанного апоптоза клеток периферической крови, что предполагает универсальное участие sFasL-индуцированного апоптоза и различных апоптозмодифицирующих систем в формировании ишемического повреждения головного мозга.

Учитывая, что- «доформирование» очага ишемического повреждения достигается путем апоптоза и апо-некроза, возникает необходимость поиска новых нейропротекторных веществ, обладающих, в. том числе,-антиапоптотической активностью. Известно, что под воздействием внешних стрессовых факторов и при развитии многих заболеваний (в том числе и ишемических повреждениях) в организме повышается уровень БТШ, что защищает клетку, стабилизируя денатурированные или неправильно свернутые пептиды. Ряд исследований выявили, что среди представителей семейств БТШ наиболее мощным протективным эффектом обладают БТШ70 [112, 135, 141]. На модели экспериментального инсульта Z.H.Lee и соавт. подтвердили нейропротекторную роль БТШ70: они обнаружили у мышей, нокаутных по БТШ70, больший объем зоны инфаркта по сравнению с диким типом [107].

Последние годы резко возросло число исследований, нацеленных оценку терапевтических приложений протективных свойств БТШ70. Применение БТШ70 в терапии ишемического инсультана экспериметальной модели заболевания, показало положительные результаты и улучшило исходы инсульта [178]. Авторы полагают, что антиишемический эффект БТШ70 связан с вовлечением его в антиапоптозный, антинекротический и антиагрегационный механизмы [79,80].

У' пациентов с ишемическим инсультом X. Jin и соавт. исследовали зависимость тяжести заболевания от уровня лимфоцитарного БТШ70 [96]. Были получены отрицательные статистически значимые корреляции между уровнем БТШ70 и тяжестью неврологического дефицита, что косвенно доказывало нейропротекторные свойства БТШ70 в клинических условиях.

Исследование уровня внутриклеточных БТШ70 моноцитов и гранулоцитов периферической крови в сравнении со степенью активности спонтанного апоптоза тех же клеток у пациентов с атеротромботическим инсультом, позволит непосредственно изучить их возможные цитопротекторные свойства.

Содержание внутриклеточного БТШ70 в гранулоцитах на 1-е (р<0,05), 7-е (р<0,05) и 14-е (р<0,005) сутки ишемического инсульта было достоверно выше, содержания БТШ70 в гранулоцитах контрольной группы. Уровень БТШ70 в моноцитах на 1-е (р<0,001) и 14-е (р<0,01) сутки заболевания был достоверно выше контрольных значений.

В динамике уровень внутриклеточного БТШ70 на моноцитах и гранулоцитах достоверно снижался к 7-м суткам заболевания (р<0,05) и достоверно повышался к 14-м (р<0,05) суткам.

Наблюдаемая динамика уровня внутриклеточного БТШ70 может быть связана с истощением его содержания в клетке вследствие реализации им определенных функций при развитии ишемического повреждения, а так же с выбросом БТШ70 во внеклеточное пространство, и последующим его ресинтезом.

Исследование взаимосвязи экспрессии БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах пациентов с ишемическим инсультом и уровня спонтанного апоптоза в соответствующих клетках выявило, что статистически значимое снижение уровня БТШ70 (р<0,05) сопровождалось достоверным повышением процентного содержания апоптозных клеток в анализируемых образцах крови в динамике к 7-м суткам (р<0,01). Достоверное повышение уровня БТШ70 в моноцитах и гранулоцитах, происходящее на 14-ый день заболевания (р<0,01), сопровождалось достоверным снижением спонтанного апоптоза соответствующих клеток периферической крови (р<0,05).

Корреляционный анализ выявил наличие статистически значимых отрицательных корреляций между уровнем спонтанного апоптоза моноцитов и уровнем моноцитарного внутриклеточного БТШ70 на 14-е сутки заболевания (г=-0,81- р=0,02б) а также отрицательные корреляции высокой степени достоверности между уровнем спонтанного апоптоза гранулоцитов и уровнем внутриклеточного БТШ70 на 1-е (г=-0,75- р=0,012) и 7-е (г=-0,73-р=0,023) сутки заболевания.

В результате проведенного нами исследования, была выявлена обратная зависимость интенсивности спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с ишемическим инсультом от уровня экспрессии этими клетками внутриклеточного БТШ70, что свидетельствует в пользу антиапоптотических свойств БТШ70 и согласуется с данными литературы.

Полученные результаты имеют большое значение для разработки новых стратегий цитопротекции — защиты головного мозга от повреждающих факторов ишемии в остром периоде ишемического инсульта.

В условиях ишемии микроглиальные клетки индуцируют синтез не только нейротоксичных веществ, но и сигнальных молекул, клеточных регуляторов, трофических факторов [42]. Вещества, обусловливающие в очаге ишемии как повреждение, так и систему поддержки жизнеспособности клеток, представлены широким спектром регуляторных пептидов, включающих цитокины [103]. В течение острой фазы инсульта повышается количество моноцитов и мононуклеарных клеткок, секретируемых ФНО-а, ИЛ12, ИЛ6 и ИЛ 10, по сравнению с их количеством у здоровых людей.

До настоящего времени остается неясным вопрос о взаимоотношении нейротоксичности и нейропротективных свойств ФНО-а. Аналогично ФНО-а, ряд работ выявили признаки разнонаправленного действия «противовоспалительного цитокина» ИЛ 10.

Эксперименты in vitro показали, что ФНО-а может способствовать регенерации поврежденных аксонов и защищает культивированные нейроны [50]. С другой стороны, имеются данные, что при внутрижелудочковом введении ФНО-а крысам с окклюзией СМА, отмечалось увеличение объема инфаркта, а при введение антител к ФНО-а наблюдался меньший очаг ишемического повреждения [38]. Дуализм в свойствах ФНО-а может быть обусловлен тем, что активация специализированного рецептора ФНО-а р55 может передавать сигналы как на апоптоз так и на выживание клетки [93].

Ряд исследований выявлили нейропротективные свойства ИЛ 10. Было показано, что при ишемическом инсульте происходит снижение уровня ИЛ 10 по сравнениюс группой контроля, а нарастание уровня ИЛ 10 в первые сутки может служить предиктором благоприятного течения и исхода заболевания [10, 134, 143, 174, 175].

С другой стороны, некоторые авторы не выявили достоверных изменений уровня ИЛ 10 в плазме крови у пациентов с ишемическим инсультом [85], а при геморрагическом инсульте уровень ИЛ 10 в сыворотке крови достоверно повышался у пациентов с неблагоприятными исходами заболевания[97].

В работе, выполненной ранее на кафедре фундаментальной и клинической неврологии, и нейрохирургии РГМУ, был выявлен дисбаланс про-и противовоспалительных цитокинов в сторону повышения уровня провоспалительных агентов по сравнению с контролем (ФНО-а 22,8±4,7 и 11±0,9 пг/млр<0,05). Было выявлено достоверное нарастание уровня ФНО-а в спинномозговой жидкости через 6−12 часов после развития ишемического повреждения [24]. Отмечлось так же повышение уровня ИЛ10 на 3-й" сутки заболевания, однако, была получена отрицательная корреляция ИЛ 10 с СРБ, что косвенно свидетельствовало о противовоспалительном характере данного цитокина.

Таким образом, несмотря на наличие множества исследований, посвященных изучению роли цитокинов в формировании ишемического повреждения головного мозга, остается неразрешенным ряд вопросов о направленности действия цитокинов, их взаимодействии друг с другом, с медиаторами апоптоза, возможных механизмах реализации вызываемых ими эффектов, что делает интересным и актуальным их дальнейшее изучение.

Исследование уровня ФНО-а у пациентов с ишемическим инсультом по сравнению с группой контроля выявило достоверное повышение уровня ФНО-а в течение всего периода наблюдения (р<0,05). При этом в динамике отмечалось достоверное нарастание уровня ФНО-а на 7-е сутки заболевания (р<0,05), по сравнению с 1-ми и 3-ми сутками.

На 3-й сутки заболевания отмечалось достоверное повышение уровня ФНО-а у тяжелых пациентов по сравнению со среднетяжелыми (р<0,01). В динамике отмечалось достоверное увеличение уровня ФНО-а у тяжелых, пациентов к 7-м суткам заболевания (р<0,05).

В результате проведенного исследования, не было выявлено достоверных корреляций уровня сывороточного ФНО-а у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом со степенью тяжести состояния, объемом очага поражения и степенью восстановления неврологических функций по шкале МШР на 14-е сутки заболевания. Однако, значимое повышение уровня сывороточного ФНО-а у пациентов основной группы по сравнению с группой контроля с 1-х суток заболевания и достоверное нарастание его к 7-м суткам за счет группы тяжелых пациентов, свидетельствуют, скорее, в пользу провоспалительного характера данного цитокина.

При проведении сравнительного анализа динамики уровня сывороточного ФНО-а, эБавЬ и степени спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов периферической крови у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультом, было выявлено, что максимальное нарастание уровня ФНО-а совпадает с максимальной концентрацией зБаэЬ в сыворотке крови и степенью спонтанного апоптоза клеток периферической крови. При этом повышение уровня ФНО-а опережает повышение сывороточного уровня ББазЬ. Это подтверждает литературные данные о том, что ФНО-а способен выступать в качестве апоптозиндуцирующего фактора при атеротромботическом ишемическом инсульте [13].

Исследование уровня ИЛ 10 у пациентов с ишемическим инсультом на 1-е, 3-й и 7-е сутки заболевания по сравнению с группой контроля выявило достоверное повышение уровня ИЛ 10 у пациентов с ишемическим инсультом на 3-й (р<0,002) и 7-е (р<0,05) сутки заболевания.

В динамике уровень ИЛ 10 достоверно повышался с 1-х по 3-й сутки (р<0,001), что соответствует данным исследований, ранее проведенных на нашей кафедре, и не зависил от степени тяжести пациентов.

При этом было выявлено 2 типа реакции ИЛ 10 на возникновение ишемического повреждения головного мозга: в первом случае значение сывороточного ИЛ 10 было на уровне контрольных цифр и достоверно от них не отличалсь, во втором отмечалось достоверное повышение уровня сывороточного ИЛ 10 по сравнению с контрольными значениями на 1-ф<0,000), 3-й (р<0,000) и 7-е (р<0,000) сутки. Высокие значения сывороточного ИЛ10 отмечались только у пациентов средней тяжести и тяжелых, и не были определены ни в одном случае у легкобольных, тогда как низкие значения ИЛ 10 встречались у пациентов независимо от степени тяжести состояния. Кроме того, у пациентов с высоким уровнем ИЛ 10 отмечалась более выраженная положительная динамика по шкале МН (р<0,0б) к 14-м суткам заболевания.

В настоящей работе при проведении сравнительного анализа сывоторочных уровней ИЛ 10 с ФНО-а и РаэЬ было выявлено однонаправленное измениение их концентрации — постепенное нарастание их сывороточного уровня от 1-х к 7-м суткам. Кроме того были установлены прямые статистически значимые корреляции между уровнем ИЛ 10 на 1-е (г=0,45- р<0,028), 3-й О''=0,43- р<0,041) и 7-е (г=0г043- р<0,046) сутки и уровнем сывороточного БрайЬ на 1-е сутки заболевания у пациентов с атеротромботическим ишемическим инсультомю.

Однако, в отличие от ФНО-а, концентрация ИЛ 10 достоверно нарастала к 3-м суткам заболевания и статистически значимо не отличалась у пациентов разной степени тяжести, и у пациентов с высокими значениями ИЛ 10 в сыворотке крови имела место более выраженная положительная динамика в неврологическом статусе к 14-м суткам заболевания.

Таким образом, результаты исследования взаимодействия прои противовоспалительных цитокинов, а также индукторов апоптоза на примере ФНО-а, ИЛ 10 и эБазЬ показали однонаправленную динамику изучаемых маркеров. При этом повышение уровня ФНО-а с 1-х суток заболевания, опрережающее нарастание уровня БравЬ, а также достоверный рост концентрации ФНО-а у тяжелобольных пациентов к 7-м суткам указывает на провоспалительную и проапоптотическую роль данного цитокина в патогенезе атеротромботического ишемического инсульта. Динамика уровня ИЛ 10 и соотношение его концентраций со степенью восстановления неврологического дефицита выявляет модуляторные функции ИЛ 10 при ишемическом процессе в головном мозге: с одной стороны, активация экспрессии ИЛ 10 в ответ на развитие фокальной ишемии, с другой стороны, активация регенераторно-репаративных процессов.

Наряду с компелесным изучением прои противовоспалительных факторов, индукторов апоптоза и анти-апоптозных систем, элементов врожденного иммунитета, был исследован уровень фермента семейства цинковых металлопротеиназ — ММП-9. ММП-9 играют центральную роль в процессах морфогенеза, ремоделирования и резорбции тканей, их функция связана с обменом соединительнотканного матрикса [25]. На культуре макрофагов, полученных из человеческих моноцитов, было показано, что разрушение фиброзной покрышки атеросклеротической бляшки связано с повышенной активностью интерстициальной коллагеназы и желатиназы [81].

При острой ишемии головного мозга продемонстрирована роль ММП в частности ММП-9, в повреждении гемато-энцефалического барьера, разрушении и перестройке нейроваскулярного матрикса, ассоциации уровня ММП-9 с риском отека мозга и геморрагической трансформации очага ишемического повреждения [74].

Имеются морфологические данные, 4 что именно в очаге ишемического повреждения головного мозга наблюдается рост концентрации ММП-9 [60]. Результаты исследований показали, что ингибирование экспрессии ММП-9 приводит к уменьшению размеров очага ишемии в головном мозге [154, 36]. Была выявлена взаимосвязь тяжести заболевания с экспрессией ММП-9 в раннем периоде ишемического инсульта у человека [99], что делает актуальным исследование ММП-9 как диагностического маркера и возможную мишень для терапевтического воздействия.

Исследование концентрации сывороточной ММП-9 в остром периоде атеротромботического ишемического инсульта выявило достоверное повышение ее значений на 1-е (р<0,01) и на 3-е (р<0,03) сутки заболевания по сравнению с группой контроля. На 1-е сутки заболевания было выявлено максимальное значение ММП-9 у пациентов основной группы, затем происходило достоверное снижение уровня к 7-м (р<0,01) суткам.

Было выявлено, что на 1-е (р<0,006) и 7-е (р<0,01) сутки заболевания концентрация ММП-9 была достоверно выше у пациентов средней тяжести и тяжелых по сравнению с пациентами с минимальным неврологическим дефицитом.

Следует отметить, что на 3-й сутки заболевания значения сывороточной ММП-9 были на одном уровне у пациентов с инсультом разной степени тяжести. Но на 7-е сутки, как и на 1-е, уровень ММП-9 вновь был достоверно выше у пациентов средней тяжести и тяжелых по сравнению с легкобольными. Возможно, это связано с вторичным повреждением вещества головного мозга вследствие развития вазогенного и цитотоксического отека или с большей активацией коллагеназ с целью резорбции некротических тканей у тяжелых и среднетяжелых пациентов.

Корреляционный анализ выявил статистически значимую прямую зависимость между уровнем ММП-9 и тяжестью состояния пациентов по шкале инсульта №Н (г=0,436- р<0,03) на 1-е сутки заболевания, что согласуется с литературными данными [99].