Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулёзом в нашей стране носит характер эпидемии (Онищенко Г. Г., 2002; Пунга В. В., Капков Л. П., 1999). По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) в промежутке времени с 2000 по 2020 гг. туберкулёзом в мире заболеют около 200 млн. человек, умрут около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек (WHO Fact Sheet, 2000). В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надёжных (активных и специфических), простых в использовании и дешёвых средств для быстрого выявления возбуди- -теля в исследуемом материале.

В нашей стране при диагностике туберкулёза большое внимание уделяется культуральным методам, за рубежом — микроскопии мазка. Но оба эти метода имеют существенные недостатки. Культивирование с момента посева составляет три месяца, причём положительных результатов- 0,5−14% (Клименко М.Т. с соавт, 1985; Клименко М. Т. с соавт., 1987; Литвинов В. И., 1996). При микроскопии мазка (флуоресцентной) наблюдается до 14% положительных результатов (Канюк А.Н., 1995). Таким образом, данные методы не могут претендовать на роль основных в лабораторной диагностике туберкулёза. Известны способы диагностики туберкулёза с помощью эритро-цитарных диагностикумов (Архангельский Н.И. с соавт., 1985), реакции аг-регатагглютинации (Хоменко А.Г. с соавт, 1992), реакции агглютинации латекса, масс-спектроскопии (Маякова Т.И. с соавт., 1995), но данные методы трудоёмки и малоактивны. Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и поэтому распространения ещё не получили. В связи с этим, актуальным является разработка диагностических препаратов и методов исследований, обладающих высокой специфической активностью, экспрессностью и информативностью.

ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Цель диссертационной работы: совершенствование биотехнологий иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза.

Основные задачи исследования:

• отработать методические подходы по извлечению полноценных антигенных комплексов из микробных, биомасс возбудителя туберкулёза и получить высокоактивные иммунные туберкулёзные сыворотки;

• разработать магнитные сорбенты с фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов для удаления из туберкулёзных иммунных сывороток неспецифических антител;

• отработать биотехнологию изготовления высокочувствительных и стабильных туберкулёзных липосомально-иммунопероксидазных конъюгатов;

• разработать эффективные способы получения суспензионных диагности-кумов на основе полиакролеиновой (латексной) и алюмосиликатной матриц для реакций агглютинации;

• отработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами для диагностики туберкулёза в экспрессных методах (иммуноферментном анализе — ИФА, количественном иммунофлуоресцентном анализе — КИФА);

• определить диагностическую ценность применения разработанных иммунобиологических препаратов на экспериментальном и клиническом материале.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ Полученные в результате исследований данные представляют интерес с точки зрения поиска путей извлечения полноценных специфических водорастворимых антигенных комплексов из микобактерий туберкулёза.

Разработан и применён аффинный магносорбент при проведении им-муносорбции гетерологичных антител из иммунных туберкулёзных сывороток, позволяющий получать специфичный препарат с сохранением его первоначальной активности, ускорять и упрощать процесс сорбции.

Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства липосомальных туберкулёзных иммуноферментных конъ-югатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью.

Разработаны приёмы по предварительному селективному концентрированию микобактерий туберкулёза и их антигенов на магноиммуносорбен-тах (МИС) с последующим проведением экспрессных методов (ИФА, КИ-ФА), позволяющие исследовать объекты внешней среды, материал от больных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограниченного объёма пробы с низкой концентрацией микобактерий с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы.

Приоритетность ряда выполненных исследований подтверждена 2 патентами РФ на изобретения: № 2 192 265 «Способ получения комплекса фос-фолипидов» (2002 г.) и № 2 195 296 «Способ получения ганглиозидов» (2002 г.).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Основная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определении научно-методических аспектов разработки иммунобиологических препаратов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза, которые учитывают характерные особенности антигенной структуры микобактерий, свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокрем-незёмы, латексы) природы, методы конъюгации лигандов и маркёров, определяя направления последовательных стадий и операций биотехнологии производства диагностических туберкулёзных препаратов.

Разработанные научно-методические приёмы по получению полноценного антигенного материала из бакмасс микобактерий, высокоактивных иммунных сывороток, удалению из них перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов. Оптимизация параметров иммобилизации антител обеспечила конструирование высокоактивных и специфических диагностических препаратов (иммуноферментных, суспензионных латексных и алюмосиликатных для реакции агглютинации, магноиммусорбентных).

Разработанные методические подходы по ковалентной фиксации на поверхности мембраны липосом ферментов и иммуноглобулинов позволили повысить стабильность и увеличить срок годности диагностической системы без потери активности с сохранением каталитических свойств.

Сконструированные туберкулёзные магноиммуносорбенты в сочетании с экспрессными методами диагностики повышают их чувствительность до 50−100 микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения анализа до 1−1,5 часов за счёт селективного концентрирования на своей поверхности микобактерий, ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов.

Результаты проведённых исследований по сочетанным методам магно-иммуносорбции с экспрессными анализами и использование липосомальных препаратов дополняют новыми научными данными сведения о возможности использования иммобилизованных систем, способствующих стабильности, увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции микобактерий туберкулёза.

Материалы научных разработок легли в основу двух методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Главным Государственным санитарным врачом России Г. Г. Онищенко 06.04.2000 и «Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберкулёза», утверждённых директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).

На Федеральном уровне утверждены зам. главного санитарного врача E.H. Беляевым технические условия (ТУ) 9154−00−1 897 080−2004 на фосфо-липиды для получения липосом (письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г). На учрежденческом уровне утверждены два регламента: на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.2004 г.) и на тест-систему липосомально — иммунопероксидазную магноиммуносорбент-ную для выявления антигена туберкулёза иммуноферментным методом, утверждённую директором СтавНИПЧИ (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 3 от 3.03.2005 г.).

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ по экспресс-диагностике туберкулёза и применению магноиммусорбентных препаратов в мониторинге микобактерий.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Научно-методические подходы к получению высококачественного биологического сырья (антигенов и антител) для производства противотуберкулёзных препаратов. Получены водорастворимые антигены микобактерий, содержащие полный набор высокоэффективных антигенных комплексов с высокой активностью (1:32—1:64 в РИД). Подобрана производственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами антител, основанная на оптимальной комбинации комплекса специфических антигенов и им-муномодуляторов.

2. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбентов с магнитными свойствами при проведении иммуносорбции неспецифических антител из иммунных туберкулёзных сывороток. Разработанные сорбенты с иммобилизованными гетерологичными антигенами и метод сорбции позволили за один этап получить не только высокоспецифичную иммунную сыворотку, но и сохранить её первоначальную серологическую активность.

3. Научно-методические основы изготовления липосомально — иммуноперок-сидазного конъюгата для выявления антигена туберкулёза иммунофермент-ным методом. Иммобилизованные на мембране липосом фермент и туберкулёзные иммуноглобулины повышают свою стабильность, что приводит к увеличению срока годности диагностической системы.

4. Биотехнология производства суспензионных латексных и алюмосиликат-ных диагностикумов, обеспечивающая высокую эффективность обнаружения микобактерий туберкулёза в экспериментальных и клинических условиях. Разработанные препараты по чувствительности аналогичны традиционным методам (РИФ, ИФА, РИГА), но превосходят их по простоте изготовления и экспрессности (постановка и учёт результатов реакции с алюмосиликатным диагностикумом в течение 1−3 мин).

5. Научно-методические основы биотехнологии изготовления твёрдофазных микрогранулированных аффинных магноиммусорбентов для избирательного концентрирования микобактерий и их использования в экспрессных методах (ИФА, КИФА). Разработанные препараты позволяют повысить чувствительность более чем в 1000 раз при увеличении вероятности выявления микобактерий за счёт селективного концентрирования антигена на антителах, находящихся на твёрдой матрице.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология XXI века» (Саратов, 28−30 сентября 2004 г.) — 1-й Всероссийской конференции «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 10−11 октября,.

2004 г.) — региональном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Ставрополь, 17 февраля 2005 г.) — научно-практической конференции «Актуальные вопросы эпиднадзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа» (Ставрополь, 14−16 апреля.

2005 г.) — на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных научных работах (2 патента на изобретение, 1 депонированная работа и 7 трудов в научных сборниках).

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Она изложена на 178 страницах, содержит 18 таблиц и 19 рисунков.

Список литературы

включает 178 отечественных и 99 зарубежных литературных источников.

ВЫВОДЫ.

1. Сочетанное использование водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции позволило выделять из обеззараженных ацетоном микобактерий туберкулёза полноценные антигенные комплексы с серологической активностью 1:32—1:64 в реакции иммунодиффузии с туберкулёзной сывороткой. Данная биотехнология оказалась пригодной для изолирования антигенов из близкородственных возбудителю туберкулёза в серологическом отношении микроорганизмов.

2. При получении высокоактивных туберкулёзных иммунных сывороток для иммунизации кроликов применяли выделенные антигенные комплексы с иммуномодуляторами феракрилом, тималином и циклофосфаном. Специфическая активность полученных сывороток в непрямой реакции иммунофлуоресценции достигала 1:400 -1:600, а в реакции иммунодиффузии-1:32—1:64.

3. Удаление из туберкулёзных иммунных сывороток перекрёстно реагирующих антител с помощью магнитных сорбентов с ковалентно фиксированными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов обеспечило получение сырья, пригодного для конструирования различных диагностических препаратов.

4. Разработанная биотехнология изготовления липосомальных туберкулёзных иммунопероксидазных конъюгатов обеспечила получение высокочувствительного, специфического диагностикума, отличающегося повышенной стабильностью при хранении по сравнению с традиционным им-мунопероксидазным конъюгатом.

5. Впервые осуществлена научная разработка биотехнологии производства серии высокоспецифических диагностических препаратов и иммобилизованных систем для выявления возбудителя туберкулёза и его антигенов в искусственно контаминированных пробах и в клиническом материале от больных (моча, мокрота).

6. Чувствительность разработанного туберкулёзного латексного диагно-стикума в реакции агглютинации латекса (РАЛ) составила 3,9×10 5−7,8×105 м.к./мл, а алюмосиликатного туберкулёзного диагностикума в реакции суспензионной агглютинации (РСА) на стекле- 7,8×105−1,56×106 при учёте результатов РАЛ через 16−18 ч, а РСА — через 1−3 мин. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных туберкулёзом специфические антигены микобактерий выявлены в РАЛ в 66% случаев, в РСАв 65%.

7. Туберкулёзные магнитные иммуносорбенты, полученные по разработанной биотехнологии, способны селективно концентрировать на своей поверхности микобактерии туберкулёза, его антигены из исследуемых проб большого объёма, включая клинический материал от больных туберкулёзом, и выступать в качестве твёрдой фазы при осуществлении имму-ноферментного и количественного иммунофлуоресцентного анализов, обеспечивающих с высокой специфичностью выявление туберкулёзного микроба в течение 1−1,5 ч с чувствительностью 1×10 м.к./пробе.

8. В клиническом материале (моча, мокрота) у больных различными формами туберкулёза специфические антигены микобактерий при использовании туберкулёзных магнитных иммуносорбентов в сочетании с имму-ноферментным и количественным иммунофлуоресцентным методами выявлены в 91%, что подчёркивает высокую диагностическую ценность разработанных препаратов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Проводить извлечение антигенного материала путём водно-солевой экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции для получения активных антигенных комплексов микобактерий туберкулёза.

2. Для повышения специфичности сыворотки проводить их иммуно-сорбцию от гетерологичных антител с помощью аффинных магноиммуно-сорбентов, полученных иммобилизацией с гетерологичными антигенами, что упрощает и ускоряет процесс очистки.

3. При конструировании суспензионных латексных и алюмосиликатных диагностикумов необходимо опытным путём подбирать нагрузку лиганда, временные и температурные параметры.

4. При получении магноиммуносорбентов для ИФА и КИФА использовать в качестве носителя — алюмосиликат, модификатора — полиглюкин, активатора — вторичный алкилсульфат натрия.

5. Проводить селективное концентрирование на магноиммуносорбенте туберкулёзных антигенов из объектов внешней среды и клинического материала, используя постоянный магнит, магнитные ловушки, с последующей постановкой ИФА, КИФА. Для постановки анализов следует использовать флаконы, пробирки, планшеты.

6. Для получения положительных результатов клинических испытаний препаратов необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, правильно проводить подготовку и сбор исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих составляющих зависит качество диагностики.