Первичные физико-химические механизмы токсического действия меди на бактерии

Содержание

• Актуальность проблемы

Устойчивый интерес к различным аспектам токсического действия тяжелых металлов на микроорганизмы сформировался уже к началу XX века и был связан прежде всего с поиском и созданием на их основе эффективных лекарственных препаратов против инфекционных заболеваний. Актуальность этого направления исследований в настоящее время не только не утрачена, но даже возросла в связи с обнаружением лекарственной устойчивости у микроорганизмов после длительного применения антибиотиков в медицинской практике.

Вместе с тем в последние десятилетия результаты деятельности человека характеризуются резким возрастанием в окружающей среде различных токсичных веществ и соединений, среди которых тяжелые металлы занимают одно из первых мест. В этой связи проблема прогнозирования отрицательных последствий антропогенного загрязнения тяжелыми металлами как индивидуально, так и в комбинации с другими воздействиями, приобретает особую актуальность.

Кроме того, в последнее время микроорганизмы широко применяются для очистки сточных вод от тяжелых металлов и в качестве тест-организмов для определения качества воды. Можно надеяться, что более глубокое понимание физико-химических механизмов взаимодействия клетки с металлами позволит эффективнее использоппть микроорганизмы для решения этих прикладных задач.

Среди группы наиболее токсичных металлов для различных организмов (А£, Си, Щ) медь привлекает в последнее время наиболее пристальное внимание исследователей. Во-первых, это связано с широкими масштабами загрязнения среды указанным металлом, источником поступления которого является не только промышленность и энергетика, но и сельское хозяйство, где медь широко используется в качестве фунгицидного препарата. Во- вторых, это единственный элемент из данной группы металлов, 'ущест-венно необходимый для жизнедеятельности многих организмов.

В настоящее время накоплена обширная

литература по различным аспектам токсического действия меди на клетки и отдельные биологические структуры. Установлены первичные химические реакции, запускающие процессы повреждения различных биологических макромолекул. На целых клетках различных типов и органеллах показано ингибирование медью различных биохимических процессов, включая АТФазу, цикл трикарбоновых кислот, синтез белков и нуклеиновых кислот, глутатионредуктазы, дыхания, снижение общего уровня восстановленных тнолов и ввН в клетках. Установлено также нарушение барьерных свойств мембраны. Однако, несмотря на широкий круг проведенных исследований, цельная картина развития медь-индуцированных нарушений в клетках до сих пор отсутствует.

Основная проблема заключается в том, что при действии тяжелых металлов на клетки (ЗюЬв, Bagch?, 1995), как и при других типах воздействия (Владимиров, 1975), многие из зарегистрированных функциональных нарушений могут иметь вторичное происхождение, тогда как локализация и механизмы повреждения первичных мишеней в клетке, определяющих специфику развития патологического процесса, оставались неизвестными.

ПсрПН’ШЫМ жшнмолсПетпиям моли о клеточной шшорхносгмо «ПОЛОМ II о нисншсй стороной цитоплазматической мембраны в частности, которые, по-видимому, и должны формировать направление развития процесса повреждения, до сих пор уделяли слишком мало внимания. В значительной степени это связано с получившей широкое распространение точкой зрения, согласно которой активный транспорт меди в микроорганизмы с помощью спсцяалюмроййнноП системы прсдетптмется необходимым уелоин-ем се токсического действия на клетки (Ховрычев, 1974- ОзЬшш й а), 1987).

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы заключалась в изучении первичных механизмов действия меди ва структурно-функциональное состояние бактериальной мембраны (клеточной поверхности) и формировании на их основе концепции развития шшрежлемнй Оймфрнинмшй «метки шжелммн мяшшями пик индминдунныю, Iми и н комбинации с другими факторами внешней среды.

Задачи исследования.

1. Сравнительное исследование основных факторов токсического действия различных неорганических соединений металлов (ПДП, пшроксиди, соли).

2. Исследование мест связывания меди бактериями во взаимосвязи с профилем электрического потенциала на клеточных структурах и в зависимости от энергетического состояния клеток.

3. Изучение физико-химических механизмов мсдь-нпдуцироишиюИ проводимости мембраны и характеристика проводящих путей.

4. Обоснование наиболее общих принципов усиления активности тяжелых металлов в комбинации с другими факторами внешней среды.

Положения, преде: авлеиные к защите.

К защите представлены выдвинутые в работе положения, согласно которым первичные механизмы токсического действия различных неорганических соединений меди (в том числе и ВДП) включают в себя 2 этапа:

Взаимодействие ионов с мишенями 1 типа (восстановленными тиолами, экспонированными на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны) с образованием вонов Си*.

Взаимодействие ионов Си* с мишенями 2 типа с последующей активацией динамических неселективных проводящих путей (каналов) в мембране с эффективным радиусом — 0,5 нм, проницаемых для самой меди и других гидрофильных ионов и молекул. При этом специфический профиль электрического потенциала на мембранных структурах бактерий обеспечивает преимущества для индуцированного транспорта в цитоплазму различных веществ катионной природы, в том числе и лекарственных препаратов.

В соответствии с развиваемыми представлениями мстолл-индуцированный транспорт и цитоплазму рассматривается как один из наиболее общих принципов развития патологического процесса при контакте бактерий с тяжелыми металлами и усиления активности антимикробных препаратов при комбинированном воздействии.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований впервые установлено, что медь-индуцированные ионные утечки через цитоплазматическую мембрану — результат ее модификации при двухстадийном взаимодействии ионов Си2* с тиолами на внешней стороне мембраны, а не следствие активного транспорта меди в цитоплазму.

Впрвые выявлено, что истинная причина энергетической зависимости накопления меди в клетках и ее токсичности заключается в энергозависимой активности восстанавливающих центров на внешней поверхности мембраны.

Впервые показано, что большая часть накопления бактериями меди в цитоплазме осуществляется в процессе автоиндуцированного транспорта катионов металла через индуцированные в мембране проводящие пути.

Впервые установлена динамическая природа медь-индуцированных проводящих путей в мембране и охарактеризованы их основные свойства (эффективный радиус ~ 0,5 нм, низкая ионная селективность). Показано,.что через эти пути может осуществляться транспорт в цитоплазму различных токсикантов, причем при прочих равных условиях вещество катионной природы транспортируется более эффективно в соответствии с градиентом электрического потенциала между внешней средой и цитоплазмой, обеспечивая элекгронейтральность цитоплазмы в процессе массивной потери клетками катионов К*. Отрицательный доннановский потенциал в периплазме способствует проявлению катионной селективности процесса накопления, эффективно концентрируя катионы из среды и обеспечивая их высокий начальный градиент на цнтоплазматическоА мембране.

На основании проведенных исследований впервые предложена и научно обоснована физико-химическая модель индукции проводимости мембраны бактерий, согласно которой редокс-процсссы ш> ее внешней стороне с учпетием меди н белкоп управляют проводимостью встроенных в нее каналов и в конечном итоге определяют развитие патологического процесса в цитоплазме в результате автоиндуцированного транспорта меди к чувствительным мишеням в этом отсеке бактериальной клетки.

Проведенные исследования привели к заключению о том, что в основе усиления активности антимикробных препаратов тяжелыми металлами прежде всего может лежать облегчение их транспорта к мишеням действия через металл-индуцированные проводящие пути в мембране.

Научно-практическое значение работы.

Вскрытые в работе первичные механизмы токсического действия меди на клетку открывают реальные перспективы для прогнозирования эффективности комбинированных воздействий с участием тяжелых металлов и могут быть использованы при прогнозировании последствий комплексного антропогенного загрязнения окружающей среды, фиксируя шшмлпио ия то* споПстлях дополнительных потлеПстпнП. которые могут окп-зать решающее влияние на эффективность суммарного действия с участием меди и, возможно, других тяжелых металлов.

Проведенные исследования открывают также подходы к направленному поиску эффективных металлсодержащих композиций для дезинфекции ран, санитарной обработки питьевой йоды, профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на Украинской республиканской конференции «Применение радиоэлектроники и псслсдошшии сперхслмЛмх свечений биологических объектов"(Киев, 1978), Международной конференции «Вода и ионы в биологических системах» (Бухарест, 1980), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Республиканской конференции «Ферменты, металлы, металлоферменты в диагностике и лечении» (Ивано-Франковск, 1982), 16-й Международной конференции ФЕБО (Москва, 1984), I Советско-германском международном симпозиуме «Микроскопическая фотометрия и акустическая микроскопия в науке» (Москва, 1985), Всесоюзной конференции «Биохемилюминесценция в медицине и сельском хозяйстве» (Ташкент, 1986), Республиканской конференции «Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней» (Харьков, 1987), Всесоюзном семинаре «Современные проблемы антибиотикорезистентности» (Москва, 1988), Международном симпозиуме по биофизической химии «Успехи биоэлектрохимии биополимеров и мембран» (Йена, 1988), Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма» ((Пупшно, 1989), Всесоюзной конференции «Магнитный резонанс в биологии и медицине» (Звенигород, 1990), 2 Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 1995).

Личный вклад автора. Все вошедшие в диссертацию результаты получены лично автором либо при его непосредственном участии. Рад теоретических расчетов и экспериментов осуществлен в творческом сотрудничестве с коллегами из ИХФ, которым автор выражает искреннюю признательность.

Объем работы. По представленным на защиту материалам автором опубликовано 46 печатных работ.

II, КРАТКОЙ СОДЕРЖАНИЙ ПРЕДСТАВЛЕННЫХ К ЗАЩИТЕ МАТЕРИАЛОВ

Глава 1. Сравнительная характеристика токсичности тяжелых металлов в ионной форме и в виде высокодисперсного порошка (ВДП). Основные факторы, определяющие токсичность ВДП меди для бактерий в водной среде [1−16,19,21−23,29].

Интерес к всестороннему изучению биологической активности ВДП металлов был связан с выдвижением в конце 70-х годов идеи использовать их для создания в организме животного искусственного депо металлов, способного после однократного введения длительное время обеспечивать поступление необходимого элемента с целью коррекции обмена веществ или ликвидации дефицита металла в организме, возникшего в связи с тем или иным заболеванием (Федоров и др., 1979). В ходе дальнейших исследований продемонстрирована пониженная токсичность металлов при такой форме их введения в организм животных и высокая биологическая активность как в норме, так и при некоторых экспериментальных заболеваниях. При этом обычно полагают частицы ВДП биологически инертными, способными проявлять активность исключительно путем генерации ионов металла в процессе саморастворения в биологической среде. Наличие такого пути проявления активности ВДП не вызывает сомнения. Вместе с тем далеко не очевидно, что этот путь единственный. Действительно, процесс саморастворения металлов может сопровождаться образованием активных форм кислорода (ОЬапс1еЬап е (а1., 1976), участие которых в патологических процессах на различных уровнях организация биологических систем надежно установлено, и изменять состав среды (рН и содержание Ог). Кроме того, малый размер частиц (~10 от) и высокая кривизна поверхности могут существенно повлиять на скорость и направление реакций, протекающих в среде, при контактных взаимодействиях с ВДП (Морохов и др., 1977). Представленные ниже данные сравнительного изучения токсического действия ряда металлов в виде растворимых солей и ВДП на бактерии в значительной степени проясняют эту проблему.

1.1. Влияние металлов в виде солн и ВДП иа рост бактерий.

Анализ влияния на рост клеток представляет собой простой и удобный метод интегральной оценки биологической активности различных препаратов. В опытах использовали 18-ти часовую культуру бактерий Escherichia coli В, выращенную на синтетической глюкозоминеральной среде М9 в стационарных условиях при 37 °C. ВДП металлов Ag, Си, Zn, AI с размером частиц -100 нм были получены в Институте химической физики АН СССР. Навески ВДП диспергировали ультразвуком в дистиллированной воде. П исходной суспензии концентрация металла составляла 1мг/мл. Для сравнения использовали растворы солей AgNO). CuCh, ZnClAICI3 и супернатанты исходных суспензий порошков.

Опыты с добавками металлов в ростовую среду показали, что алюминий не оказывал влияния на рост бактерий ни в виде соли, ни в виде ВДП даже при максимальной концентрации металла в среде. Влияние остальных металлов, вводимых в виде ноаов или ВДП, зависело от их концентрации в ростовой среде. При низких концентрациях часто наблюдалась стимуляция роста культуры. Сравнительную эффективность металлов характеризуют данные, представленные в таблице 1.1.

Та&чица 1.

Эффективность подавления роста Е. coll В в среде М9 металлами в виде ВДП и солей.

Ингибированне роста бактерий, % Концентрация металла в солн я порошке, мкг/мл

AgNO, Ag CuCl, Си ZnCl, Zn

50 0,06 15 0.27 0,7 — —

25 — — —

Как видно из таблицы, эффективность подавления роста бахтерий ионами металлов снижалась в ряду А^*>Сиг*>2пг*>А13*, что находится в согласии с данными других исследователей. Активность ВДП металлов была ниже, чем соответствующих ионов из солей. В ряду убывания токсичности металлов Си>А%>2п>А1 в сравнении с аналогичным рядом для ионов медь и серебро поменялись местами.

Как показали специальные исследования, количество новов первоначально присутствующее в суспензиях ВДП было явно недостаточно для того, чтобы за счет них объяснить наблюдаемое бактериосгатическое действие порошков. Основной эффект, очевидно, обусловлен действием самих ВДП металлов. Растворимость ВДП меди в воде была выше, чем ВДП серебра. Возможно, именно поэтому ВДП меди обладал наибольшей активностью, хотя в ионной форме активность этого металла уступала серебру.

Таким образом, представленные здесь данные предполагают два необходимых условия биологической активности ВДП металлов:

1. ВДП металлов должны растворяться в среде инкубации клеток.

2. Ионы этих металлов должны обладать биологической активностью.

1.2. Особенноств нарушения энергетических функций клетки тяжелыми металлами.

Индивидуальные особенности действия металлов на клетки лучше проявляются на начальных этапах повреждения бактерий, связанных с нарушением тех или иных функций мембраны. К одной из наиболее чувствительных функций у микроорганизмов относят энергозависимый выброс протонов из бактерий при метаболизме глюкозы (Hugo, 1976). На рисунке 1 представлены кинетические кривые выброса протонов из голодающих клеток, суспендированных в дистиллированной воде (плотность культуры составляла ~1010 кл/мл), в контрольном опыте (кривая 1) и после преинкубации в течение 30 мин с различными ТМ (кривые 2−4). н 1 4 Ч

Концентрация соли, Мкм

Рис. 1.1. Влияние ТМ на кинетику лихом протонов ю бактерий при метаболизме глюкозы (стрелками МиГ указаны соответственно моменты введения в суспензию Е. coli металлов и глюкозы): 1 — контроль- 2—14 мкМ AgHOi или 56 мкМ Hg (CH?00), — 3 — 64 мкМ СиСЫ 4—120 мкг/мл ВДП меди.

Рис. 1.2. Изменение средней скорости выброса протонов из бактерий при метаболизме глюкозы под действием солей тяжелых металлов: 1 — AgSOf, 2 — Hg (CH!COO)J 3 — CuCl,.

Видно, что все изученные металлы тормозили энергозависимый выброс протонов из бактерий, однако характер торможения зависел от вида металла. Если замедление выброса протонов из бактерий под действием солей серебра и ртути начиналось непосредственно с момента введения глюкозы в суспензию, то под действием меди в виде соли или ВДП на начальном этапе выброс протонов происходил обычно с той же скоростью, что и в контроле, а через 1−2 минузы торможение прогрессивно усиливалось. Это различие четко прослеживается и на концентрационных зависимостях эффективности торможения выброса протонов (Рис. 1.2). Ряд эффективности металлов (Ag>Hg>Cu) был таким же, как и в опытах по выживаемости, однако медь в отличие от серебра и ртути была не способна полностью подавить энергозависимый выброс протонов из бактерий. Остаточный уровень энергизации сохранялся даже при увеличении концентрации меди в среде до 1 мМ. Эти факты указывают на то, что доступность чувствительных мишеней, ответственных за энергозависимый выброс протопоп из бпктериП, для Ag* и tlg3' не заниеит, а для Си1* зависит от внешних источники" энергии, что не противоречит известным представлениям о роли клеточной энергетики в токсическом действии на микроорганизмы серебра и меди (Ховрычев, 1974- Голубович, 1975).

Нами получены также данные, указывающие на определенные различия в действии меди в виде соли и ВДП на энергозависимый выброс протонов из бактерий. Несмотря на внешнее качественное сходство характера подавления выброса протонов при метаболизме глюкозы ионами меди и ВДП (рис. 1.1), предельная эффективность подавления выброса протонов последним была по крайней мере в 3 раза выше [16]. Это означает, что действие ВДП меди на бактерии не можег быть сведено исключительно к генерации ионов металла в среду в процессе электрохимического растворения, и одновременно указывает на наличие каких-то иных форм биологической активности ВДП металла, реализующихся в процессе его растворения.

К середине 80-х годов сложились достаточно четкие представления об электрохимическом растворении меди в водных растворах (Лаврентьев, Хидекель, 1983). Процесс происходит с кислородной деполяризацией и сопровождается защелачнванием среды по суммарному уравнению: 2Си° + О? + 2НтО —> 2Си2* + 40Н~, которое может быть представлено совокупностью следующих элементарных стадий:

С учетом того, что растворение ВДП меди в воде подчиняется тем же самым закономерностям [15], генерация ионов Си" при инкубации ВДП с бактериальной суспензией должна сопровождаться:

Защелачнванием среды инкубации в процессе растворения ВДП (что отчетливо видно на рис. 1.1) —

Снижением содержания в среде кислорода-

Образованием в среде активных форм кислорода-

Промежуточным образованием в процессе растворения меди- ионов Си'.

Действие любого из этих факторов может в принципе внести свой вклад в токсичность ВДП (Gadd, Griffiths, 1980- Passow et al, 1961- Самойленко и др., 1983). Реальное представление об их влиянии на энергозависимый выброс протонов при взаимодействии ВДП меди с бактериями получено в работе [29]. Показано, что защелачивание среды с одновременной генерацией ионов Си** при растворении ВДП в суспензии бактерий хорошо моделирует Си (ОН)2. Скорее всего такой эффект вызван сдвигом равновесия Cu (OH)i ←+ Си2* + 20Н~ вправо при связывании Си2* с бактериями. Установившееся значение рН зависело от концентрации Си (ОН)2 и физиологического состояния бактерий. Процессы потребления О2 и генерации #??>?, происходящие при электрохимическом растворении ВДП, п дшшой системе отсутствуют, облегчая интерпретацию донных. Отмечено следующее отличие в действии CuCl) и Си (ОН)2 на энергозависимый выброс Н* из Е. coli. Некоторое замедление скорости выброса Н* из бактерий гидро-ксидом меди в сравнении с контролем могло осуществляться непосредственно с момента добавления глюкозы, тогда как CuCh на начальном этапе такого действия не оказы-нает (рис. 1.1).

Си0 Си + е~, Си' + О- -* Си2' + О/, Н* + 02~-+Н0% НО°} + НО°2 →Н202 + 02.

1) (2)

Эффективности ингибирования выброса Н*, рассчитанные, как в работе [16], приведены в таблице 1.2 (ч.1). Как уже было отмечено выше, этот показатель достигает насыщения в опытах с CuCh уже при концентрации 12,8 мкг/мл (по металлу), тогда как с увеличением содержания в суспензии Cu (OH)i он продолжает возрастать. Особенно отчетливо это проявляется в опытах на свежесобранной культуре, где при использовании одинаковых концентраций CuCh и Си (ОН)2 (25,6 мкг/мл) эффективность последней в 3,7 раз выше и это не предел. Отсутствие эффекта насыщения в опытах с Си (ОН)г в той области концентраций, где он отчетливо проявляется у CuCh, и более высокая активность гидроксида указывают на наличие иных закономерностей действия последнего на активный выброс it из К coli, в сравнении с CuCh. В их основе может лежать известное влияние pH на токсичность различных металлов (Gadd, Griffiths, 1980), обусловленное либо отличием в токсичности Си2* и Cu (OH)i, либо опосредованное через увеличение реакционной способности мишеней на клеточной поверхности и/или ростом трансмембранного и поверхностного потенциалов клетки при подщелачивании среды инкубации с соответствующим ростом связывания металла с бактериями. Независимо от конкретного механизма влияния pH очевидно, что аналогичным образом может формироваться и более высокая токсичность ВДП меди в сравнении с CuCh.

Поскольку стехиометрия образования Си2* и ОН при растворении ВДП и Си (ОН)г одинакова, появляется возможность проанализировать количественное соответствие активности указанных соединений меди при одинаковой степени их растворения. С этой целью через 30 мин после введения 240 мкг/мл ВДП в аэрируемую суспензию бактерий перед добавлением глюкозы регистрировали квазиравновесное pH в среде инкубации. В параллельном опыте добивались установления такого же значения pH среды титрованием культуры клеток суспензией Cu (OH)i, после чего сравнивали эффективность ингибирования выброса Я* из? coli указанными соединениями. Эквивалентные концентрации Cu (OH)i для одной и той ж концентрации ВДП сильно варьировали в различных сериях экспериментов, однако обычно проявлялось хорошее соответствие между действием на клетки ВДП и Си (ОИ)з. При этом максимальные эффекты были отмечены на свежесобранной культуре. В таблице 1.2 (ч.2) приведены типичные данные таких опытов. Анализ причин отмеченной вариабельности показал, что она в значительной степени связана с различной скоростью старения Е. coli в разных опытах, как было установлено по кинетике изменения pH суспензии клеток при аэрации по методике, предложенной в работе (Конев и др., 1982). Данные представленных опытов указывают на то, что в условиях аэрация активность ВДП меди обусловлена главным образом его растворением с одновременным увеличением pH среды инкубации.

Об этом же свидетельствуют опыты, показавшие отсутствие влияния НзОг на активность Сг/2* (таблица 1.2, ч. З). Из представленных в ней данных видно, что добавки к CuCh Я fit в количествах, способных образоваться при электрохимическом растворении ВДП, не изменяют активности Си'*, несмотря на известную способность tf^Oj повреждать мембрану бахтерий (Самойленко и др., 1983). Возможно, такая концентрация H-?j недостаточна для ее повреждения.

В условиях ограниченного доступа? воздуха к суспензии бактерий токсичность меди может быть модифицирована расходованием кислорода на электрохимическое растворение ВДП. Это следует из того факта, что в условиях анаэробиоза эффективность действия меди на энергозависимый выброс протонов из бактерий резко увеличивается (таблица 1.2, ч. З).

Таким образом, из приведенных данных следует, что в основе более высокой предельной способности ВДП меди подавлять энергозависимый выброс протонов из Е. coli в сравнении с CuCh лежат следующие причины:

Иные закономерности действия меди на бактерии при повышенных pH, создающихся в процессе электрохимического растворения ВДП.

Снижение концентрации кислорода в суспензии при растворении ВДП.

Тойтца 1.

Эффективность подавления энергозависимого выброса Н* из? coli различными соединениями меди в зависимости от состояния культуры и наличия в среде Hfi,

Номер Ингибнрующее соединение Концентрация меди, мкг/мл Эффективность, отн. ед. Состояние культуры

CuCI, 12,1 1,0 ±0,05 Свежесобранная

Cud, 25,6 1,0 ±0,

Си (ОН), 12,8 U ±0,

1 Си (ОН)} 25,6 3,7 ±0,

Cud, 12,8 1,0 ±0,04 Голодаюшал

CuCI} 25,6 1.

Си (ОН)г 12,8 1,1 ± 0,

Си (ОН), 25,6 2,1 ±0,

Си (ОН), 30,7 5,7 ±0,17 Свежесобранна*

2 ВДП 30,7* 5.2 ±0,

Си (ОН), 12,3 1,1±0,06 Голодающая

ВДП 12,3* 1,1± 0,

CuCI, 16 1.0 ±0,03 Голодающая

3 CuCI, + НОмкМНгО, 16 1,1 ± 0,

CuCI, 16 >10 Голодающая анаэробная Указаны эквивалентные концентрации Cu (OH)h обеспечивающие такое же подщелачнвание суспензии, как 240 мкг/мл ВДП.

Иначе говоря, с точки зрения ингибирования выброса Я* из Е coli при метаболизме глюкозы ВДП можно рассматривать как генератор Си (ОН)2 с одновременным поглощением кислорода из среды инкубации.

Интересно отметить, что энергетические требования, отчетливо проявляющиеся при ингибировании выброса Н* ю Е. coli под действием CuCh, существенно снижаются при защелачивании среды инкубации и совершенно отсутствуют в анаэробных условиях. В последнем случае качественные различия по этому показателю между Ag", Hg2* и Си2*, характерные для аэробных условий, практически снимаются.

1J. Структурные изменеиия клеточной поверхности бактерий под действием ТМ.

После приведения в контакт с клетками тяжелые металлы, как и любые другие химические реагенты, должны в первую очередь взаимодействовать с легкодоступными структурами оболочки бактерий, экспонированными в окружающую среду (Passow et al, 1961, Hugo, 1976). Результаты такого взаимодействия ТМ с поверхностью Е. coli прослеживаются в структурных изменениях оболочки бактерий, выявляемых методом хе-милюминесцентного (ХЛ) зонда.

Этот метод основан на анализе кинетики ХЛ, сопровождающей проникновение 0,1% КМпО< в микробные клетки [3,7,10]. ХЛ возникает преимущественно в реакции между Мп (111) и карбоксильными группами белков. Кинетика ХЛ, представленная на врезке рис. 1.3, включает в себя быструю 00 и медленную (Ь) компоненты, отражающие соответственно количество и реакционную способность карбоксильных групп белкой, доступных для окислителя с наружной и внутренней стороны цитоплазматической мембраны. Развитие медленной компоненты ХЛ во времени, оцениваемое по параметру т (время достижения амплитудного значения медленной компоненты ХЛ), служит показателем проницаемости мембраны для окислителя.

0,0039 0.

Концентрация соли, мМ

0.0039 0,

Концентрация соли, мМ

Рис. 13. Влияние солей тяжелых металлов на параметры ХЛ бактерий: II (А) и 1/т (Б), возникающей под действием КМпО" 1 — Л^Оу, 2 — Н^^И^ОО),-, 3 — СиС1>

Влияние солей тяжелых металлов на параметры ХЛ Е. соН (I) и 1/т) под действием КМп04 представлено на рис. 1.3. Из него видно, что все изученные соли, начиная с некоторой концентрации, увеличивают проницаемость клеток (1/т) для окислителя. По эффективности действия на т они располагаются в следующий ряд: А^О) > Н^(СНзСОО)з > СиСЬ. Причем рост 1/т под действием Аг1Ю} характеризуется отчетливо выраженной Э-образной формой зависимости от концентрации соли.

Интересно отметить, что однонаправленным изменениям проницаемости бактерий сопутствует качественно различный характер влияния указанных выше солей на 1| (рис. I .ЗА). А^О} уже в малых концентрациях увеличивает доступность и/или реакционную способность ХЛ центров на внешней поверхности клеток. Под действием Hg (CHзCOO)2 этот показатель также увеличивается, но это происходит практически параллельно с ростом проницаемости бактерий, тогда как СиС1г в области концентраций, увеличивающих проницаемость оболочки бактерий для окислителя, снижает 1ь по-видимому, путем экранирования медью внешних ХЛ центров от окислителя [7]. Такое отличие действия О/С/? на реакционную способность ХЛ центров от солей серебра и ртути хорошо согласуется со способностью ионов Си3*, но не Ag* и Н^*, координировать кислород при связывании с биологическими структурами (Эйхгорн, 1978) в том числе и на внешней поверхности микроорганизмов (КЖп е (а!., 1987). Примечательно, что энергизация глюкозой бактерий, преинкубиро ванных с 125 мкМ CuCh, (условия активации ингибнрующего действия меди на энергозависимый выброс протонов из Е coli) вызывала освобождение от меди центров связывания металла на внешних структурах и активировала рост проницаемости клеток для XJ1 зонда [21].

Таким образом, несмотря иа определенные различия в связывании ТМ с внешней поверхностью бактерий, их действие на проницаемость клеток для ХЛ зонда имеет аналогичный характер. Как следует из сопоставлекня кинетических кривых ХЛ при обратимых и необратимых повреждениях мембраны бактерий [7, 10]. зарегистрированные нами изменения проницаемости Е coli под действием ТМ носят обратимый характер и могут рассматриваться в качестве одной из наиболее ранних стадий повреждения клеток тяжелыми металлами.

1.4. Эффективность комбинирования ТМ с различными лекарственными препаратами.

Сделанные выше предположения о первичном характере структурно-функциональных изменений в оболочке 'бактерий под действием ТМ были проверены нами по изменению чувствительности К coli к различным лекарственным препаратам в условиях роста клеток в синтетической среде в присутствии ТМ. В основе этого подхода лежит идея, впервые выдвинутая рядом ученых (Nikaido, 1976, Williams, 1979- Кузнецова, 1983), согласно которой различные антибиотики проникают в клетку к своим мишеням действия различными путами. Причем в зависимости от характера структурных изменений в оболочке под действием ТМ возможно изменение чувствительности клеток к определенной группе лекарственных препаратов.

В экспериментах использовали водные растворы AgNO} и CuCl?, ВДП меди и лекарственные вещества: стрептомицин (СТР), неомицин (НЕО), тетрациклин гидрохлорид (ТРЦ), эритромицин (ЭРМ), левомицетика сукцинат (ЛВМ), грамицидин С (ГТМ), ак-рифлавин (АКР) — различающиеся физико-химическими свойствами (молекулярной массой, сродством к линидам, электрическим зарядом на молекуле) и механизмом действия на микробную клетку. Все лекарства использовали в суббакгериосгатических концентрациях, концентрациями металлов варьировали для получения различной степени подавления роста культуры Б. coli.

Экспериментальные данные по эффективности подавления роста Е. coli В при совместном использовании ТМ в суббактериостатических концентрациях и лекарственных веществ представлены на диаграмме 1.1. В качестве критерия эффективности использована величина К&bdquo- которая показывает во сколько раз подавление роста в опыте больше аддитивного от лекарства и металла.

Видно, что величина К, существенно зависит как от типа использованного лекарственного препарата, так и от металла. Однако, наличие общих закономерностей при комбинировании всех исследованных ТМ с лекарствами не вызывает сомнений. Так для ЭРМ, ЛВМ, ТРЦ значения К, для любого из испытанных ТМ близки к 1. Это указывает на аддитивный характер их взаимодействия с суббактериостатическими концентрациями ТМ. Сопмсщснис остальных лскарстнсннмх псщестя с ТМ приводило к увеличению К,. Эти препараты по эффективности совместного действия с ТМ располагаются в следующем порядке: UEO «СТР > АКР > ГРМ.

Диаграмма 1.

Эффективность подавления роста Е. coli при комбинировании ТМ и лекарственных препаратов (I)

1,5 2 2,

К эффективности, отн. ед.

С увеличением концентрации ТМ в пробах (диаграмма 1.2) для НЕО, СТР, АКР. ГРМ синергидное действие сохраняется, несколько меняясь в цифровом выражении, в то время как для ЭРМ, ЛВМ, ТРЦ наблюдаемый эффект зависит от типа использованного металла. Для высокой дозы СиСЬ сохраняется аддитивный характер взаимодействия с указанными препаратами, тогда как для ВДП меди ТРЦ становится синергидным препаратом, а для А%ЫОз синергидное действие распространяется также на ЭРМ и ЛВМ.

Диаграмма 1.

Эффективность подавления роста Е. coll при комбинировании TM е лекарственными препаратами (II)

4 в а

К эффективности, отн. ед.

Указанные факты могут означать, что низкие дозы использованных ТМ имеют идентичный механизм воздействия ва бактерии, сохраняющийся неизменным с увеличением дозы CuCh и способный модифицироваться с ростом концентрации ВДП меди и AgNO}, по-видимому за счет подключения дополнительных мишеней бактериальной клетки, чувствительных к повышенным дозам последних.

Анализ физико-химических свойств и мишеней действия в клетке исследованных лекарственных соединений, представленных в табл. 1.3, показывает, что в группу препаратов, синергидно действующих с низкими концентрациями ТМ, входят соединения с различной молекулярной массой и сродством к липидам. Мишени их действия в клетке также различаются. Единственное свойство, которое их объединяет — высокий положительный заряд на молекуле в растворе (?+2). В группу препаратов, неэффективных при комбинировании с низкими концентрациями ТМ, напротив, входят препараты с отрицательным зарядом (ТРЦ, ЛВМ) и ЭРМ с зарядом +1 на молекуле. Низкая эффективность последнего при комбинировании с металлами возможно связана с тем, что в отличие от других положительно заряженных препаратов, использованных в работе, для ЭРМ основное препятствие ва пути к мишеням в клетке представляет внешняя, а не цитоплазматическая мембрана бактерий Е. coli.

Таблица-1.}

Физико-химические характеристики исследованных лекарственных соединений.

Лекарственное соединение Молекулярная масса Сродство к липндам Мишень Заряд неоншшн 615 гидрофильный рибосомы + стрептомицин 581.6 гидрофильный рибосомы + акрифлавин 224 амфифильиый ДНК + грамицидин С 1100 амфифипьный мембрана + тетрациклин 479 амфифильиый рибосомы левомицетина сук-цинат натрия 428 амфифнльный рибосомы эритромицина фосфат 734 гидрофобный рибосомы +

Из представленных выше данных следует, что наличие положительного заряда на молекуле лекарства — скорее всего необходимое условие достижения высокой антимикробной активности при его комбинировании с препаратами меди и серебра. С учетом того факта, что для большинства из изученных соединений мишени расположены в цитоплазме бактериальной клетки, увеличение чувствительности бактерий к катион-ным лекарствам под действием ТМ может быть обусловлено влиянием, этих металлов на процессы транспорта указанных соединений в микроорганизм.

На нуги транспорта лекарств из внешнего раствора к расположенным в цитоплазме мишеням (ДНК и рибосомы) лежат два основные препятствия: внешняя и цитоплазматическая мембраны (рис. 1.4). Первая из них представляет собой липидный бислой, покрытый липополиспхприлами и пронизанный белковыми каналами с диаметром пор ~1 им. Л шорня — лшшдиый Спелой с пстросплмми м него белками, расположенными на его поверхности или пронизывающими его.

С точки зрения проницаемости для различных молекул эти мембраны существенно отличаются друг от друга. Благодаря белковым каналам внешняя мембрана легко проницаема для гидрофильных молекул и ионов малого размера. С увеличением гидрофобно-сти растворенных в окружающей среде веществ сопротивление каналов для них резко увеличивается. Через липидные гидрофобные участки внешней мембраны такие вещества не могут проникать, поскольку обычно доступность этих участков сильно ограничена расположенными на внешней стороне липополисахаридами. внешняя мембрана каналы периплазма внешней мембраны белки рибосомы цитоплазматическая липополисахариды цитоплазма мембрана

Рис. 1.4. Схема бактериальной клетки с мишенями действия исследованных лекарств.