Биотехнология аспарагиновой и глутаминовой аминокислот

Министерство образования и науки Украины Национальный технический университет

«Харьковский политехнический институт»

Кафедра промышленной биотехнологии и аналитической химии Диплом бакалавра Биотехнология аспарагиновой и глютаминовой аминокислот Выполнила: студентка гр.0−57а Сидоренко С.О.

Руководитель: проф. Давыдов В.В.

Харьков 2011

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1Характеристика продукта Аспарагиновая кислота, аминоянтарная кислота, COOHCH2CHNH2COOH, одна из дикарбоновых аминокислот, имеет слабокислые свойства (изоэлектрическая точка при pH 2,77), молекулярная масса 133,10. Кристаллизуется в виде ромбических призм, плохо растворимых в холодной воде. А. к. в значительных количествах входит в состав белков животных и растений, играет важную роль в обмене азотистых веществ. Участвует в образовании пиримидиновых оснований, синтезе мочевины. Наряду с глутаминовой кислотой играет важнейшую роль в реакциях переаминирования. Аспарагиновая кислота может быть синтезирована в животном организме.

HOOC — CH2 — CH — COOH

NH2

Аспарагиновая кислота

Аспарагиновая кислота присутствует в головном мозге человека; она усиливает неврологическую активность. При заболевании эпилепсией концентрация этой аминокислоты в мозге возрастает, а при депрессии, напротив, понижается. При расстройствах настроения аспарагиновая кислота не настолько важна, как две другие аминокислоты триптофан и таурин, но часто добавляется в многокомпонентные препараты, предназначенные для лечения этих заболеваний, а также укрепления нервной системы. Аспарагиновая кислота, которая присутствует во всех продуктах, содержащих белки, в комбинации с фенилаланином (другой аминокислотой) образует аспартам. Он часто используется как искусственный подсластитель.

§ Участвует в преобразовании углеводов в мышечную энергию.

§ Предшественник иммуноглобулинов и антител.

§ Участвует в обмене веществ в организме Аспарагин был первой аминокислотой, выделенной из природных продуктов. В 1806 году Вокелен и Робике получили его из сока спаржи. Представляет собой широко распостраненное соединение; он накапливается в значительных количествах у некоторых видов высших растений, а также встречается в свободном состоянии в тканях животных. Обнаруживается в белковых продуктах — мясе, рыбе, яйцах, соевых продуктах. 29]Глутаминовая кислота, глютаминовая, или аминоглутаровая, кислота, аминокислота, COOH=CH2=CH2=CH (NH2)=COOH. Кристаллы, растворимые в воде, температура плавления 202 °C. Входит в состав белков и ряда важных низкомолекулярных соединений (например, глутатиона, фолиевой кислоты). Природная форма представляет D (+) изомер. Г. к. — заменимая аминокислота для животных. Содержится в большом количестве в казеине, желатине, клейковине. В плазме крови вместе со своим g-моноамидом — глутамином — составляет около 1/3 всех свободных аминокислот. Реакция:

осуществляется ферментом глутаминсинтетазой, относящейся к группе лигаз; при этом происходит связывание избытка аммиака в тканях животных и растений. Таким образом, глутамин транспортирует аммиак к месту его детоксикации (в большинстве случаев в почках и печени), он служит также резервом аминогрупп и входит в состав белков. Особенно важную роль система глутамин — Глютаминовая кислота играет в обмене веществ. Глютаминовая кислота участвует и в других важных процессах обмена веществ: в переаминировании (где она наряду с аспарагиновой кислотой является одним из непременных участников); в окислительном дезаминировании с образованием a-кетоглутаровой кислоты, вовлекаемой в трикарбоновых кислот цикл; в декарбоксилировании, приводящем к образованию важного нейротропного агента гамма-аминомасляной кислоты; во многих синтезах, в том числе глутатиона, глюкозы, орнитина (см. Орнитиновый цикл).

HOOC — CH2 — CH2 — CH — COOH

NH2

Глутаминовая кислота.

Глутаминовая кислота в больших количествах присутствует в животных и растительных белковых продуктах. На этикетках она может указываться под различными названиями. Иногда ее называют глутаматэто всего лишь формы глутаминовой кислоты, выполняющие одну и ту же функцию.

§ Главный предшественник глутамина, пролина, агринина и глутатиона. Потенциальный источник энергии.

§ Важная кислота для обменных процессов в мозгу и для обменных процессов других аминокислот. Глутамин также помогает уменьшить тягу к сладкому и алкоголю, улучшая метаболизм клеток головного мозга.

Глутаминовая кислота была выделена Ритгаузеном в 1866 году из гидролизатов клейковины пшеницы. В 1890 году Вольф осуществил первый химический синтез глутаминовой кислоты. Эта кислота относится к числу наиболее широко распостраненных аминокислот и имеет большое значение в обмене веществ.

1.2Способы получения Аспарагиновая кислота Ферментативный синтез Аспарагиновая кислота не принадлежит к числу незаменимых, но производится в мире многими тысячами тонн. Аспарагиновую кислоту можно получать с помощью фермента аспартазы. В качестве исходных веществ для ферментативного синтеза используются фумаровая кислота и аммиак — крупнотоннажные продукты органического и неорганического синтеза.

Протекающая реакция одностадийна — в присутствии фермента молекула аммиака присоединяется к фумаровой кислоте по месту двойной связи с образованием оптически активной L-аспарагиновой кислоты. В этом процессе впервые в технологической практике были применены иммобилизованные клетки микроорганизма, содержащие фермент в его естественной микробной оболочке. Этот процесс был разработан японской фирмой «Танабе Сейяку» в 1973 г.

Плотный гель с иммобилизованными в нем микробными клетками, содержащими аспартазу, формуют в кубики размерами 2—3 мм, набивают ими колонну объемом 1 м³ и пропускают через нее раствор фумарата аммония. На выходе из колонны L-аспарагиновую кислоту кристаллизуют, центрифугируют и промывают холодной водой. Процесс практически полностью автоматизирован и осуществляется в непрерывном режиме. Масштабы производства на фирме «Танабе Сейяку"—1700 кг чистой L-аспарагиновой кислоты в сутки на реактор объемом 1 м³ .

— ООС-СН=СН-СОО- + NH4 + => -ООС-СН (NH3+)-СН2-СОО;

Фумарат Аммоний L-аспарагинат Микробиологический синтез Еще в 80-х годах прошлого века в Институте генетики и селекции микроорганизмов под руководством члена-корреспондента РАН Владимира Георгиевича Дебабова был создан штамм микробов, которые при определенном питании выделяли аспарагиновую кислоту. В конце 90-х Дебабов передал штамм Сергею Воронину.

Саратовские биотехнологии встроили микробы в полиакриламидный гель. Это нужно, чтобы живые микрозаводы не смывались вместе со своей продукцией. Этим гелем заполнили метровые стеклянные трубки-колонки. Если через колонку под давлением прокачивать исходные вещества, то на выходе из колонки течет раствор L-аспарагиновой кислоты Все происходит при комнатной температуре, практически без отходов.

Глутаминовая кислота Известно несколько способов получения глутаминовой кислоты: гидролиз различных белков, синтез химический, ферментативный из ?-кетоглутаровой кислоты и микробиологический.

Получение глутаминовой кислоты гидролизом белков Гидролиз протеинов является классическим методом получения аминокислот из природных источников. Для выработки глутаминовой кислоты и ее натриевой соли используются животные и растительные белки: казеин молока, клейковина пшеницы, кукурузный глютен, отходы мясокомбинатов, свеклосахарных (сепарационный щелок) и спиртовых заводов (барда).

Метод гидролиза малопроизводителен и довольно дорог из-за значительного образования побочных продуктов и необходимости тщательной очистки глутаминовой кислоты.

Комплексная переработка мелассы позволяет получить наряду с высококачественными сахарными сиропами глутаминовую кислоту, бетаин, холин и другие ценные продукты.

Химический синтез глутаминовой кислоты Среди методов химического синтеза наиболее перспективным является использование в качестве исходного сырья акрилонитрила. Согласно этому методу акрилонитрил в результате реакции гидроформилирования превращается в ?-формилпропионнитрил и последний через стадию образования ?-аминоглутардинитрила переводится в DL-глутаминовую кислоту.

Основным недостатком химического синтеза является получение рацематов аминокислот. Разделение Dи L-изомеров является довольно сложной операцией и требует больших затрат.

Ферментативный синтез глутаминовой кислоты Его возможно осуществить из ?-кетоглутаровой кислоты с помощью ферментов трансамидазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих превращений.

НООС — СН2 — СН2 — СО — СООН + НАД (Ф)Н2 + NН3 >

НООС — СН2 — СН2 — NН2СН — СООН + НАД (Ф).

В каждом из этих процессов ?-кетоглутаровая кислота играет роль предшественника. Для осуществления любого из этих превращений необходимы источники ?-кетоглутаровой кислоты и соответствующей ферментной системе. Первую из этих задач решают с помощью подбора микроорганизмов, способных продуцировать значительное количество ?-кетоглутаровой кислоты из дступных источников сырья. Продуцентами ?-кетоглутаровой кислоты могут быть Psedomonas и Esherichia, а при культивировании продуцента Kluyverd citrophila ?-кетоглутаровая кислота была получена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candida при выращивании на н-парафинах продуцируют ?-кетоглутаровую кислоту совместно с пировиноградной в соотношении 6:1. Экономический коэффициент процесса биосинтеза достигает 90% от количества потребленных углеводородов.

В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать различные микроорганизмы, например Е. coll. Донором аминогрупп может быть аспарагиновая кислота или аланин.

Восстановительное аминирование возможно осуществить с помощью Pseudomonas (при использовании Ps. ovalis выход L-глутаминовой кислоты составляет 60%) или Aeromonas, причем некоторые штаммы этих микроорганизмов в качестве субстрата могут использовать D, L,-?-оксиглутаровую кислоту, производимую химическим синтезом.

Микробиологический синтез глутаминовой кислоты Наиболее перспективным и широко используемым способом производства глутаминовой кислоты является микробиологический синтез. Впервые о возможности получения L-глутаминовой кислоты непосредственно из углеводов с помощью микроорганизмов методом глубинного культивирования сообщили в 1957 г. Японские ученые Киносита, Асаи и др.

К настоящему времени выяснено, что способностью продуцировать глутаминовую кислоту обладают некоторые расы дрожжей, микроскопические грибы, бактерии. Однако практически только бактерии могут синтезировать глутаминовую кислоту с выходом не менее 40% относительно исходного сахара или другого сырья. Поэтому промышленное значение имеют пока только бактерии, относящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, Corynebacterium.

Это, главным образом, палочковидные, грамположительные, неподвижные бактерии, не образующие спор. Специфической для них является обязательная потребность в биотине либо в биотине и тиамине. Сырьем для получения глутаминовой кислоты кроме углеводов могут быть также различные углеводороды, начиная от природного газа (метан, этан) и кончая н-парафинами или ароматическими соединениями (бензиловый спирт пирокатехин и пр.). Могут быть также использованы газойль, уксусная, аминомасляная, фумаровая кислоты и ряд других продуктов.

2 НОРМАТИВНАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ

· СанПиН 42−123−4540 Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов.

· МРТУ 18/210−68

· ГОСТ 30 561–98 Меласса свекловичная

· ГОСТ 2081;92

· ТУ 6−09−5324−87

· ГОСТ 4523–77

· ГОСТ 2874–82 Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством

· ТУ 2431−001−48 426 412−99

· ГОСТ 6221–90

· ГОСТ 12.1.007−76

· ГОСТ 7.9−95 Реферат и аннотация. Общие требования;

· СТВУЗ-ХПИ-3.01−2007 ССОНП. Нормоконтроль документов в сфере учебного процесса. Порядок организации проведения;

· СТВУЗ-ХПИ 3.03−2006 ССОНП. Конструкторские документы в сфере учебного процесса. Общие требования к выполнению.

· СТВУЗ-ХПИ-3.04−2006 ССОНП. Форматы. Основные надписи. Требования к выполнению.

· СТВУЗ-ХПИ-3.05−2002 ССОНП. Конструкторские документы. Чертежи. Требования к выполнению.

· СТВУЗ-ХПИ-3.06−2002 ССОНП. Конструкторские документы. Спецификации. Требования к выполнению.

· СТВУЗ-ХПИ-3.07−2007 ССОНП. Конструкторские документы в сфере ученого процесса. Схемы. Общие требования к выполнению.

· СНиП II-92−76 Вспомогательные здания и помещения промышленных предприятий. Введен 23.07.1976 г.

· ГОСТ 12.0.003.74 Опасные и вредные производственные факторы. Классификация. Введен 01.01.1976 г.

· СанПин 2.2.4.548−96. Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений. Введен 01.01.1996 г.

· ГОСТ 12.1.005−88 ССБТ Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны. Введен 29.09.1988 г.

· СНиП II-33−75 Отопление, вентиляция и кондиционирование воздуха.- М.: Стройиздат, 1976. 3. О. Я. Кокорин

· ГН 2.2.5.552−96. Сводный перечень. Предельно допустимым концентрациям (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Введен 21.10.1996 г.

· СНиП II-4−79. Естественное и искусственное освещение. Нормы проектирования.- М.: Стройиздат, 1980. — 110c.

· ПУЭ-85. Правила устройства электроустановок, утвержденные Минэнерго СССР 06.07.84.

· ГОСТ 12.1.003−83 ССБТ Шум. Общие требования безопасности. Введен 01.07.1984 г.

· СанПиН 2.1.4.12−3-2005 Санитарные правила для хозяйственно-питьевых водопроводов. Введен 16.03.2005 г.

· СанПиН 2.1.5.12−43−2005 Санитарные правила систем водоотведения населенных пунктов. Введен 01.03.2005 г.

· НПБ 105−03 Определение категорий помещений, зданий и наружных установок по взрывопожарной и пожарной опасности. Введен 18.06.2003 г.

· ГОСТ 17.2.3.02−80 Охрана природы. Атмосфера. Правила установления допустимых выбросов вредных веществ промышленными предприятиями. Введен 01.01.1980 г.

·. ГОСТ 17.2.3.01−86 Охрана природы. Атмосфера. Правила контроля качества воздуха населенных пунктов. Введен 01.07.1987 г.

· 15. СанПин 4630−88 Охрана поверхностных вод от загрязнения. Введен 01.01.1989 г.

3.ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

3.1характеристика конечного продукта Аспарагиновая кислота Бесцветный или белый кристаллический без запаха, вкус кислый, без оптического вращения, трудно растворим в воде, нерастворимы в этаноле и эфире. Показатели качества указаны в таблице 3.1

Таблица3.1 Показатели качества аспарагиновой кислоты

По показателям, определяемым органолептически, техническая L-глутаминовая кислота должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.2.

Таблица3.2 Органолептические показатели

По химическим показателям техническая L-глутаминовая кислота должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.3

Таблица 3.3 Химические показатели

В соответствии с требованиями МРТУ 18/210−68 глутамат натрия пищевой должен иметь следующий состав (в%):

· Основное вещество, не менее — 94;

· Хлорид натрия, не более — 5;

· Влага, не более — 1;

· Общий азот, не менее — 7,02.

3.2 характеристика сырья и полуфабрикатов Меласса Настоящий стандарт распространяется на свекловичную мелассу — побочную продукцию свеклосахарного производства, используемую в качестве сырья для производства этилового спирта, пищевых кислот, хлебопекарных и кормовых дрожжей и как добавку в корм сельскохозяйственных животных.

Свекловичная меласса должна вырабатываться в соответствии с требованиями настоящего стандарта согласно Инструкции по ведению технологического процесса свеклосахарного производствас соблюдением санитарных норм и правил, утвержденных в установленном порядке.

Свеклосахарная меласса представляет собой темно-коричневую вязкую жидкость со специфическим запахом продуктов карамелизации сахарозы и три-метиламина, содержащегося в ней в малых количествах. Плотность мелассы 1,30—1,42.

Цветность мелассы (по ФЭКу) по отношению к светопропусканию воды составляет 20—60% при разбавлении мелассы 1: 10. С повышением содержания инвертного сахара цветность мелассы увеличивается. Так, при хранении мелассы в первом полугодии цветность колеблется в пределах 12—44% (в среднем 31%), во втором — 30—64% (в среднем 48%) к светопропусканию воды. Вязкость нормальной мелассы колеблется в пределах 3600—5600 сп. С повышением плотности (% СВ) увеличивается ее вязкость. Химический состав мелассы.

Химический состав мелассы зависит главным образом от сорта и качества сахарной свеклы, почвенно-климатических условий ее произрастания. На физико-химические и технологические показатели мелассы влияют методы ведения производства на сахарных заводах, а также продолжительность сезона сахароварения (таблица Химический состав и технологические показатели качества свеклосахарной мелассы).

Меласса содержит 75−85% сухих веществ, из которых около 54−63% (по весу сухих веществ) сахарозы, 14,8% азотистых веществ, 16,7% безазотистых веществ (кроме сахара) органических веществ и 8,5% золы.

При содержании около 20% воды меласса в среднем содержит 50% сахара и 30% несахаристых веществ, которые в свою очередь можно разделить на неорганические, главным образом соли калия 10%, и органические 20%.(табл 3.4)

Кроме сахарозы, нормальная меласса содержит в небольшом количестве (до 0,25%) инвертный сахар, а также раффинозу (до 2%). Цветность мелассы в ед. Штаммера от 327 до 1300.

Таблица3.4 Химический состав и технологические показатели качества свеклосахарной мелассы

В состав углеводов мелассы, кроме сахарозы и инвертного сахара, входят также трисахариды — раффиноза (0,01 — 2%) и кестоза (в незначительном количестве). Раффиноза состоит из одной молекулы сахарозы и одной молекулы галактозы. При действии инвертазы дрожжей или при слабом кислотном гидролизе раффиноза частично разлагается с образованием мелибиозы и фруктозы. Последняя сбраживается спиртовыми дрожжами. Кестоза состоит из двух молекул фруктозы и одной молекулы глюкозы, на спирт она не сбраживается.

Несахара мелассы (все соединения, кроме сахарозы) делятся на неорганические (10%) и органические (20%). Органические несахара подразделяются на безазотистые и азотсодержащие. Безазотистые несахара составляют углеводы (инвертный сахар, раффиноза и кестоза) и органические кислоты, среди которых уксусная, муравьиная, масляная, молочная, щавелевая, пропионовая, валериановая.

Общий азот нормальной мелассы состоит из следующих видов, %:

· Белковый … 3,0

· Пептонный … 1,9

· Аминокислотный … 8,2

· Нитратный … 2,0

· Бетаинный… 73,9

С увеличением срока хранения сахарной свеклы уменьшается содержание общего и формольно-титруемого азота мелассы (табл.3.5).

Таблица3.5 Изменение содержания общего и формольного азота мелассы в зависимости от продолжительности сезона сахарного производства

Количество сахара к сухим веществам (доброкачественность) меласс в значительной степени зависит от условий произрастания свеклы и изменений ее состава при хранении.

Так при переработке свеклы, выросшей в сухие годы, получают мелассы более низкой доброкачественности, с большим органическим коэффициентом и с большим содержанием азотистого несахара при относительно меньшем содержании золы и большом содержании извести. Реакция меласс при длительном их хранении большей частью кислая.

При переработке свеклы, выросшей при избытке влаги и недостатке тепла, получают мелассы более высокой доброкачественности, с меньшим органическим коэффициентом и с меньшим содержанием азотистого несахара при относительно большом содержании золы и малом содержании извести. Реакция таких меласс большей частью щелочная.

По мере повышения доброкачественности меласс содержание азота в них падает. Содержание азота в меласах зависит исключительно от содержания вредного азота в свекле. При хранении свеклы с пониженным содержанием сахара и накоплением новых несахаров вследствие разложения части сахара в свекле, которое при хранении свеклы может возрастать в 2−3 раза. Содержание инвертированного сахара в мелассах зависит, таком образом, в основном от качества перерабатываемой свеклы.

По данным Центрального Института Свеклы, вязкость мелассы высокой доброкачественности лежит в пределах 4000−5000 спз. При переработке свеклы пониженного качества меласса получается низкой доброкачественности и отличается большим содержанием кальциевых солей и меньшим содержанием щелочных окислов и азота; вязкость ее вдвое и втрое выше нормальной.

Из азотистых органических веществ в мелассе содержится главным образом бетаин, аспарагиновая и глютаминовая кислота. Из общего количества азота в мелассе (около 1,5% по ее весу) примерно 2/3 приходится на бетаин.

По химическому составу и по качеству (степени инфицирования) различаю мелассы нормальные и дефектные.

Нормальные мелассы характеризуются невысокой щелочностью (2−6 мл кислоты на 100 мл мелассы), отсутствием нитритов и незначительным содержанием сернистого ангидрида (не более 0,03%), количеством сахара 45−50% (в том числе инвертного не более 0,25%). Общее количество микроорганизмов невелико — 2000 клеток в 1 г без заметного преобладания отдельных видов.

Инфицированные мелассы. Меласса часто инфицирована различной микрофлорой. В ней обнаружены следующие основные бактерии — наиболее опасные вредители спиртового брожения:

· спороносные — Вас. subtillis, Вас. mesentericus, Вас. megatherium, Вас. globigil, Bac. mesentericus flavus;

· неспороносные — Leuconostoc mesenteroies, Leuconostoc agglutiaaum

Первые три спороносных представителя микрофлоры мелассы являют нитрообразующими бактериями. Они редуцируют нитраты в нитриты меласс ничтожные количества которых задерживают размножение дрожжей.

Технологическая оценка качества мелассы, в зависимости от характер и степени ее инфицированности, приведена в таблице 3.6.

Таблица3.6 Оценка качества мелассы[40]

Дефектные мелассы.

Дефектная меласса, в отличие от нормальной, плохо сбраживается, оставляет большой процент несброженного сахара, дает пониженный выход спирта и дрожжей.

Дефектные мелассы по своему химическому составу они характеризуются кислой реакцией (рН = 5,84−6,6), меньшей плотностью (67—78% СВ), повышенной цветностью (12— 44% по отношению к светопропусканию воды), большим содержанием коллоидов (2,8—6,2%), наличием солей кальция (0,83—2,2%) и сернистой кислоты (0,05—0,15%), повышенным содержанием инвертного сахара (до 2% и больше), раффинозы (>1%) и органических летучих кислот (>1%). В то же время дефектные мелассы содержат меньшее количество общего азота (1,3% и ниже), формольного (0,25% и ниже), а также фосфора (<0,03%) по сравнению с мелассами, нормальными по качеству.

К дефектным мелассам относятся мелассы со следующими качественными показателями:

· Плотность по рефрактометру, % СВ … <75

· Цветность по (ФЭК), % к светопропусканию воды. .. <40

· РН < 6,8

· Азот общий, % … 1,3

· Инвертный сахар, %… 0.5

· Инфицированность по нарастанию кислотности в пробе на самоброжение через 24 ч, °Д …> 0,3

По органолептическим показателям свекловичная меласса должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.7.

Таблица 3.7 Органолептические показатели

По физико-химическим показателям свекловичная меласса должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.8.

Таблица 3.8 Физико-химические показатели

По микробиологическим показателям свекловичная меласса должна соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.9.

Таблица 3.9 Микробиологические показатели.

Содержание токсичных элементов и пестицидов в свекловичной мелассе не должно превышать допустимые уровни, установленные «Медико-биологическими требованиями и санитарными нормами качества продовольственного сырья и пищевых продуктов», СанПиН 42−123−4540 и приведенные в таблице 3.10.

Таблица 3.10 — Допустимые уровни содержания токсичных элементов и пестицидов

Карбамид (мочевина) марки «Б» (N = 46,2%)

Карбамид — универсальное концентрированное водо-растворимое азотное удобрение предназначено для применения под все выращиваемые культуры на всех типах почв.(табл 3.11)

Карбамид при нормальных условиях пожарои взрывобезопасен, не токсичен.

Упаковка: карбамид упакован в полипропиленовые мешки с полиэтиленовым вкладышем. Вес мешка — нетто 50+/-1 кг, МКР — нетто 800 (500) кг

Транспортирование: в упакованном виде и насыпью. В упакованном виде, карбамид транспортируется железнодорожным транспортом в крытых вагонах и автомобильным транспортом.

Насыпью транспортируется железнодорожным транспортом в минераловозах, водным транспортом в специализированных водных судах и автомобильным транспортом в соответствии с правилами перевозки грузов, действующим на транспорте данного вида.

Таблица3.11 Технические характеристики карбамида ГОСТ 2081;92

Магний сернокислый 7-водный (сульфат магния) Химическая формула: MgSO4 * 7H2O

Квалификация: Россия, ГОСТ 4523–77, «ч»

Внешний вид: кристаллический порошок белого цвета

Фасовка: полипропиленовые мешки с полиэтиленовым вкладышем, 35 кг Условия хранения: в сухом, хорошо проветриваемом помещении Магний сернокислый 7-водный (магния сульфат) — представляет собой сыпучий порошок, состоящий из бесцветных кристаллов, а в зависимости от марки имеющий цвет белый или светло-серый. Сульфат магния — это соль, MgSO4 растворим в воде, пожарои взрывобезопасен. Показатели нормируются по ГОСТ 4523–77(табл3.13)

Таблица 3.13 Показатели качества по ГОСТ 4523–77[41]

Вода питьевая По микробиологическим показателям питьевая вода должна соответствовать требованиям, указанным в ГОСТ 2874–82[42]

Токсикологические показатели качества воды характеризуют безвредность ее химического состава и включают нормативы для веществ:

· встречающихся в природных водах;

· добавляемых к воде в процессе обработки в виде реагентов;

· появляющихся в результате промышленного, сельскохозяйственного, бытового и иного загрязнения источников водоснабжения.

Концентрация химических веществ, встречающихся в природных водах или добавляемых к воде в процессе ее обработки, не должны превышать нормативов, указанных в таблице 3.14.

Таблица 3.14 Показатели качества воды

Показатели, обеспечивающие благоприятные органолептические свойства воды, включают нормативы для веществ:

· встречающихся в природных водах;

· добавляемых к воде в процессе обработки в виде реагентов;

· появляющихся в результате промышленного, сельскохозяйственного и бытового загрязнений источников водоснабжения.

Концентрации химических веществ, влияющих на органолептические свойства воды, встречающихся в природных водах или добавляемых к воде в процессе ее обработки, не должны превышать нормативов, указанных в таблице 3.15.

Таблица 3.15 Нормативы на воду

Органолептические свойства воды должны соответствовать требованиям, указанным в таблице 3.16.

Таблица 3.16 Органолептические свойства воды

Примечание. По согласованию с органами санитарно-эпидемиологической службы допускается увеличение цветности воды до 35°; мутности (в паводковый период) до 2 мг/дм3.

Фумаровая кислота Показатели качества определяются по ТУ 2431−001−48 426 412−99 (табл3.17)

Таблица 3.17 Показатели качества фумаровой кислоты

Физико-химические данные: плотность: 1625 кг/м3, температура плавления: 295−300°C, растворимость в воде: 0,63 г/100 мл (при 25°C), температура вспышки: 230 °C

Упаковка и хранение: Упаковывают в мешки по 25 кг Фумаровую кислоту хранят в закрытых складских помещениях. Беречь от влаги и прямого солнечного света.

Срок хранения продукта в надлежащих условиях производителем не ограничивается.

Аммиак жидкий технический Аммиак жидкий технический — сырье для производства минеральных удобрений и многочисленных азотсодержащих промышленных веществ.

Качество аммиака соответствует требованиям высшего сорта ГОСТа 6221−90 (табл3.18)

В зависимости от области применения аммиак выпускается трех марок:

А — для производства азотной кислоты, для азотирования, в качестве хладагента, для создания защитных атмосфер;

Ак — для поставок на экспорт и для транспортирования по магистральному аммиакопроводу;

Б — для переработки на удобрения и использования в качестве азотного удобрения.

Таблица 3.18Технические требования

Жидкий аммиак — трудногорючее вещество. При попадании на кожу вызывает ожоги. При нормальной температуре и атмосферном давлении аммиак находится в газообразном состоянии. Аммиак — горючий газ, относится к токсичным веществам. Смесь аммиака с воздухом взрывоопасна.

Жидкий аммиак заливают в железнодорожные и автомобильные цистерны, а также в стальные баллоны от 20 до 50 л. Транспортируют в специальных цистернах и по трубопроводу.

Дезинфицирующее средство Состав дезинфицирующего средства «Трилокс»: в состав средства входят 3 действующих вещества полигексаметиленгуанидин, гидрохлорид, алкилдиметилбензиламмоний хлорид, N, N-бис (3-аминопропил) додециламин, функциональные добавки и краситель.

Срок хранения: 3 года в плотно закрытой упаковке изготовителя, рабочих растворов — 14 суток.

Консистенция, свойства дезинфицирующего средства Трилокс: средство представляет собой прозрачную жидкость голубого цвета со слабым специфическим запахом.

Микробиология: средство обладает антимикробным действием в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий (включая микобактерии туберкулеза, возбудителей особо опасных инфекций — чумы, холеры, туляремии), вирусов (включая аденовирусы, вирусы гриппа, парагриппа, птичьего гриппа и др. возбудители острых респираторных инфекций, энтеровирусы, ротавирусы, вирус полиомиелита, вирусы энтеральных, парентеральных гепатитов, герпеса, атипичной пневмонии, ВИЧ-инфекции и др.), грибов рода Кандида, Трихофитон, Аспергиллюс, а также моющими свойствами. Средство сохраняет свои свойства после замерзания и последующего оттаивания.

Токсичность: по степени воздействия на организм по ГОСТ 12.1.007−76 при введении в желудок относится к 3 классу умеренно опасных веществ, при нанесении на кожу — к 4 классу малоопасных соединений, при парентеральном введении — к 4 классу мало токсичных веществ; в виде паров при ингаляции малоопасно; оказывает местно-раздражающее действие на кожу и выраженное — на слизистые оболочки глаз, обладает слабым сенсибилизирующим действием.

Рабочие растворы не оказывают сенсибилизирующего эффекта, при однократных воздействиях не вызывают местно-раздражающего действия. В аэрозольной форме (при использовании способа орошения) рабочие растворы вызывают раздражение органов дыхания и слизистых оболочек глаз. ПДК в воздухе рабочей зоны: N, N-бис- (3-аминопропил) додециламина — 1 мг/м3 (аэрозоль); алкилдиметилбензиламмоний хлорида — 1 мг/м3 (аэрозоль); полигексаметиленгуанидин гидрохлорида — 2 мг/м3 (аэрозоль Фасовка: средство выпускается в полиэтиленовых флаконах объемом 0,5−1,0 дм³, полиэтиленовых канистрах 2−20 дм3, полиэтиленовых бочках 100−200

3.3Характеристика биологического объекта и биологическая схема

3.3.1 Продуценты К роду Corynebacterium относятся бактерии с булавовидной формой клеток (от греч. coryne — булава). В развивающейся культуре одновременно могут находиться клетки палочковидной, конусообразной и булавовидной формы.

Неподвижны. Помимо плеоморфизма, для представителей этого рода характерно «защелкивание» клеток при их делении. Оно происходит из-за того, что соединяющая дочерние клетки перегородка расслаивается на разных сторонах с разной скоростью, так что клетки оказываются под углом друг к другу (V-сочетания клеток).

Коринебактерии — аэробы и факультативные анаэробы, хемооргано-трофы. Метаболизм смешанный — бродильный и дыхательный. Основным продуктом при сбраживании углеводов является пропионовая кислота.

Большинство представителей коринебактерий имеют сложные пищевые потребности и нуждаются в витаминах группы В и биотине. На 377 питательных средах формируют в основном пигментированные колонии (желтые, розовые, коричневые и др.).

Среди коринебактерий имеются паразиты человека и животных и патогенные для них, а также сапрофитные виды. Типовым видом сапрофитных коринебактерий является C. glutamicum — продуцент глутаминовой кислоты.

Бактерии рода Brevibacterium в молодых культурах представлены палочками неправильной формы (0,6−1,2×1,5−6 мкм), одиночными или в парах и часто расположенными V-образно.

В старых культурах палочки распадаются на мелкие кокки. Бревибактерии — грамположительные, но легко обесцвечиваются, неподвижные, неспорообразующие, некислотоустойчивые.

Метаболизм дыхательного типа. На агаризованных питательных средах формируют желто-оранжевые, серые или пурпурные колонии. Оптимальная температура для роста 20−35 °С.

Micrococcus род сферических бактерий в семье Micrococcaceae, который широко распространен в природе. Микрококки микробиологически характеризуются как грам-положительные кокки, от 0,5 до 3,5? м (мкм, 1 м? = 10 -6 метра) в диаметре. [42]

Микрококки, как правило, не патогенны. Это нормальные жители человеческого тела и даже может играть существенную роль в сохранении баланса между различной микробной флорой кожи. Некоторые виды встречаются в пыли в воздухе (М. roseus), в почве (M. denitrificans),), в морских водах (М. colpogenes), и на коже или в кожных желез и кожи, желез секреции позвоночных животных (М. flavus). Некоторые виды, содержатся в молоке, такие как M. luteus, М. желтого, M. varians,, и M. freudenreichii, are sometimes referred to as milk micrococci and can result in spoilage of milk products. М. freudenreichii, иногда называют молочными микрококками, и могут привести к порче молочных продуктов.

Микробактерии — это небольшие по величине, грамположительные, морфологически похожие на коринебактерии и населяющие кишечник крупного рогатого скота грамположительные палочковидные бактерии. Они постоянно встречаются на доильном оборудовании и в сыром молоке. Термоустойчивы и частично выдерживают высокотемпературную пастеризацию. Вследствие незначительной активности при обмене веществ не имеют существенного значения для технологии переработки молока.

В производстве глутаминовой кислоты используются штаммы бактерий, относящиеся к роду Coryn. Glutamicum. Принадлежит к группе аэробных бактерий с высоким содержанием гуанина и цитозина. Форма может быть разнообразной, но чаще встречаются вытянутые стержни с булавовидными концами. Быстрорастущая бактерия, не патогенная и не образует спор.

Царство: Bacteria

Тип:Actimobacteria

Класс:Actimobacteria

Семейство:Corynebacteriaceae

Род:Corynebacterium

Вид:C. glutamicum

Рис. 1. C. glutamicum под микроскопом Рис. 2. Основные показатели культуры Corynebacterim glutamaticum при синтезе глутаминовой кислоты. 1-глюкоза, 2-кетоглутаровая кислота, 3-биомасса, 4-глутаминовая кислота.

Pseudomonas aeruginosa — классический представитель рода Pseudomonas. Различные штаммы этих бактерий можно обнаружить всюду: в почве, воде, воздухе, гнойных ранах и сточных водах. По сравнению с другими видами псевдомонад эти формы наиболее интенсивно исследуются бактериологами, изучающими патогенную группу, и фитопатологами. Бактерии Ps. aeruginosa обладают особым разнообразием свойств, но в то же время у них отмечаются характерные общевидовые морфологические и физиологические признаки. Культуры образуют синий флуоресцирующий пигмент, в состав которого входят пиоцианин. Бактерии желатин разжижают, молоко не свертывают, не пептонизируют, нитраты восстанавливают до нитритов, используют углеводы с образованием кислоты; аэробы. Окисляют глюконат, образуя слизь. Являются сильными окислителями углеводов (сахаров, органических кислот, углеводородов). [42]

Среди этих бактерий встречаются подвижные и неподвижные формы. Многие культуры синтезируют окрашенные соединения различных типов, хорошо проникающие в субстрат. В состав пигментов входят соединения феназинового и птсридинового ряда, а также флуоресцирующие сине-зеленые и желто-зеленые вещества. Клетки псевдомонад представляют собой мелкие одиночные грамотрицательные палочки. Спор и выростов не образуют, подвижны, имеют полярно расположенные жгутики. Число жгутиков у разных видов колеблется. Клетки в культурах часто объединяются в небольшие комочки или зерна, окруженные толстой слизистой оболочкой, иногда резко очерченной, — зооглеи.

Колонии бактерий очень разнообразны: слизистые и пастообразные, выпуклые и плоские, крупные и мелкие. У многих видов отмечается внутренняя структура колоний. Если их рассматривать в микроскопе при малом увеличении, то в одних случаях можно обнаружить мелкозернистую колонию; в других — ячеистую, напоминающую соты; в третьих — колонии в виде мелких комочков или зерен.

Большинство видов имеет колонии без внутренней структуры — под микроскопом они выглядят как однородная гомогенная масса. Псевдомонады хорошо растут на обычных питательных средах — сложных органических.

3.3.2 Приготовление питательной среды для выращивания продуцента Состав питательной среды для главной ферментации и для получения посевного материала в значительной степени зависит от используемого продуцента, от его физиологических особенностей. Основным источником углерода в среде чаще всего используются глюкоза, сахароза, гидролизаты крахмала, свекловичная меласса, гидрол. Количество усваиваемого сахара в пересчете на сахарозу должно быть в пределах от 8,5 до 25%. Но следует помнить, что пределы использования мелассы определяются уровнем в ней биотина. Концентрация биотина, по данным большинства исследователей, не должна превышать 2−5 мкг на 1 л питательной среды, иначе вместо глутаминовой кислоты будут интенсивно накапливаться аланин, молочная, янтарная, аспарагиновая кислоты, резко возрастет прирост биомассы продуцента, но снизится выход глутаминовой кислоты. Иными словами, максимум биосинтеза глутаминовой кислоты не совпадает с максимумом образования биомассы, так как потребность в биотине для этих двух процессов различна. Помимо мелассы биотин в среду может быть внесен и с кукурузным экстрактом.

Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Вероятно, это связано с изменением липидного состава клеточных мембран, что способствует увеличению проницаемости клеточных мембран для глутаминовой кислоты. Присутствие такого рода стимуляторов позволяет вести ферментацию с большим выходом глутаминовой кислоты при повышенных концентрациях биотина. Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01−0,2% или калиевой соли бензилпенициллина повышают биосинтетическую способность продуцента на 15−45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50г/л. [22]

В качестве источника азота в питательных средах чаще всего используют мочевину в количестве до 1,5−2,0% в зависимости от особенностей используемого штамма, но вводится она дробно, по мере потребления ее из среды, и так, чтобы содержание ее в культуралыюй жидкости не превышало 0,8% и рН среды было в пределах от 6,8 до 7,8.

Недостаток азота в среде приводит к снижению синтеза глутаминовой кислоты и к накоплению в среде повышенных количеств ?-кетоглутаровой кислоты.

Для нормального роста культуры и образования ею глутаминовой кислоты необходимо вводить в среду соли калия в виде КН2РО4 до 0,1−0,02 г, NH4Cl 1.0г, MgSO4*7H2O 0.2г, FeSO4*7H2O 0.01г, CaCl2*2H2O 0.01 г для поддержания рН среды на оптимальном уровне — около 7−7,2. Длительность культивирования зависит от содержания сухих веществ в среде, способа введения компонентов среды (единовременно или дробно), степени аэрации среды и, конечно, от физиологических особенностей продуцента.

Основным источником углерода в среде чаще всего используется свекловичная меласса. Количество усваиваемого сахара в пересчете на сахарозу должно быть в пределах от 8,5 до 25%. Но следует помнить, что пределы использования мелассы определяются уровнем в ней биотина. Концентрация биотина, по данным большинства исследователей, не должна превышать 1−5 мкг на 1 л питательной среды для синтеза аспарагиновой кислоты.

В качестве источника азота в питательных средах чаще всего используют мочевину в количестве до 1,5−2,0% для Pseudomonas aeruginosa, но вводится она дробно, по мере потребления ее из среды, и так, чтобы содержание ее в культуралыюй жидкости не превышало 0,8% и рН среды было в пределах от 6,8 до 7,8.

Для нормального роста культуры и образования ею аспарагиновой кислоты необходимо вводить в среду соли в виде K2HPO4 0.5г, NH4Cl 1.0г, MgSO4*7H2O 0.2г, FeSO4*7H2O 0.01г, CaCl2*2H2O 0.01 г для поддержания рН среды на оптимальном уровне — около 7−7,2. Длительность культивирования зависит от содержания сухих веществ в среде, способа введения компонентов среды (единовременно или дробно), степени аэрации среды и, конечно, от физиологических особенностей продуцента.

3.3.3Химизм процесса Процесс начинается с гидролиза сахарозы:

(1)

Первой ферментативной реакцией гликолиза является фосфорилирование, т. е. перенос остатка ортофостфата на глюкозу за счет АТФ. Образование глюкозо-6-фосфата в гексокиназной реакции сопровождается освобождением значительного количества свободной энергии системы. Каталитическая активность фермента, гексокиназы, повышается в присутствии Mg2+. Переносчиком группы РО3Н2 является аденозинтрифосфат, который превращается в АДФ.

(2)

Второй рекцией является превращение глюкозо-6-фосфата под действием изомеразы во фруктозо-6-фосфат. Равновесная система состоит на 70−75% из фосфата глюкозы и на 30−25% из фосфата фруктозы.

(3)

Третья реакция катализируется ферментом фосфофруктокиназой; образовавшийся фруктозо-6-фосфат вновь фосфорилируется за счет второй молекулы АТФ:

(4)

Четвертую реакцию гликолиза катализирует фермент альдолаза. Под влиянием этого фермента происходит расщепление на две фосфотриозы:

(5)

Эта реакция обратима. В зависимости от температуры равновесие устанавливается на различном уровне. При повышении температуры реакция сдвигается в сторону большего образования триозофосфатов.

Пятая реакция — это реакция изомеризации триозофосфатов. Катализируется ферментом триозофосфатизомеразой: