Структура ионофорных антибиотиков энниатинового и валиномицинового рядов

Циклические пептиды и депеипептиды представляют собой обширный класс как природных, так и синтетических биоорганических соединений, многие из которых обладают высокой биологической активностью. К этому классу соединений относятся также антибиотики энниатинового и валиномицинового рядов, которые по своей химической природе являются циклическими гексаи додекадепсипептидами. Физиологическая функция этих антибиотиков, называемых ионофорными, состоит в индуцировании транспорта ионов щелочных и щелочноземельных металлов через биологические мембраны, приводящем к изменению равновесной внутриклеточной концентрации этих ионов и к гибели бактериальной клетки,.

Энниатиновые и валиномициновые антибиотики находят широкое применение в качестве инструментов для исследования биологических и искусственных мембран, их строения и свойств, механизма трансмембранного переноса ионов металлов. С изучением же структуры и функции биологических мембран связаны в настоящее время многие важнейшие направления биологии, химии, физики. И это естественно, потому что мембранные системы ответственны за такие важнейшие биологические процессы, как, например, дыхание и биосинтез. Не будет преувеличением сказать, что прогресс, достигнутый за последние годы в изучении мембранных явлений, в значительной степени обусловлен широким использованием антибиотиков-ионофоров.

Одной из основных целей исследования строения и свойств макроциклических комплексонов, в число которых входят валиномициновые и энниатиновые антибиотики, является создание основ для синтеза широкого спектра веществ, необходимых медикам и биологам для направленного и избирательного увеличения ионной проницаемости биологических мембран. В то же время изучение конформационно-зависимого связывания ионов макроциклическими комплексонами создает предпосылки для выяснения строения ка-тион-связывающих центров в таких биологических системах, как, например, /<, АДхзависимая АТФ-фаза.

Если до последнего времени макроциклические комплексоны использовались преимущественно в биологических исследованиях, то теперь все более и более ясными становятся перспективы их применения в других областях: в аналитической и неорганической химии — для разделения ионов металлов и солюбилизации труднорастворимых солей, в органической химии — для воздействия на направление, скорость и стереоспецифичность нуклеофильных реакций, в технике — для создания высокоселективных катион-чувствительных датчиков и различных ионообменных материалов.

В течение ряда лет в Институте биоорганической химии АН СССР большой группой ученых во главе с М. М. Шемякиным, Ю. А. Овчинниковым, В. Т. Ивановым, В. Ф. Быстровым проводились исследования строения антибиотиков валиномицинового и энниатинового рядов в растворах с помощью различных физико-химических и расчетных методов. В ходе этих исследований было установлено, что мембранная активность указанных антибиотиков связана с их ком-плексообразующей способностью. При этом ионная селективность комплексообразования зависит не только от числа и природы ли-гандных групп, но в значительной степени определяется конформ-ационными характеристиками молекулы в целом. Для большого числа соединений — нативных антибиотиков и различных их аналогов, было установлено строение в растворах как свободных молекул, так и комплексов с металлами. Полученные результаты легли в основу развитых учеными представлений о транспорте ионов через мембрану с помощью молекул-переносчиков.

В настоящей работе тот же класс соединений изучен в кристаллах с помощью метода рентгеноструктурного анализа, который характеризуется высокой степенью информативности, однозначностью и точностью результатов. Следует отметить, что этот метод имеет дело с кристаллическим веществом, а все биологические процессы протекают в растворах. Однако наши исследования, как и исследования других авторов показывают, что конформация, найденная в кристалле, близка к одной из энергетически возможных конформаций или конформаций, существующих в растворах. Если же молекула достаточно жесткая, то эти конформации просто совпадают.

Структурные исследования проводились, главным образом, с целью выяснения механизма действия ионофорных антибиотиков, в особенности антибиотиков энниатинового ряда, на атомно-моле-кулярном уровне. Для всестороннего изучения конформационных особенностей молекул антибиотиков, ответственных за биоактивность, исследовались как сами антибиотики, так и различные их аналоги — стереоизомерные, с измененным в большей или меньшей степени набором конфигурация (I или Ъ) атомов С^- полимерго-мологи, т. е. аналоги с измененным на целое число остатков размером циклааналоги с заменой одних боковых радикалов на другие или отдельных (окси)аминокислотных остатков на другие. ок-си)аминокислотные остатки. Изучение аналогов позволяет выявить конформационные возможности остатков аминои оксикислот, пептидной и сложноэфирной групп.

Ставилась также задача определения точных значений конформационных параметров молекул и отдельных остатковэти значения могут быть использованы в качестве опорных при исследовании пептидных и депсипептидных систем в растворах и при теоретических расчетах таких систем.

Важным представлялось сравнение конформаций молекул в кристаллах и растворах для получения новых доказательств возможности использования криеталло-структурных данных для описания строения биомолекул в растворах, где эти молекулы живут и работают.

Наряду с исследованием молекул в свободном состоянии, проводилось определение строения комплексов этих молекул с ионами металлов. Это давало возможность проследить конформа-ционные изменения молекул при связывании катионов, зафиксировать активные в смысле связывания катионов позиции, определить стереохимические характеристики металл-лигандного комплекса.

Все перечисленные выше задачи решались на примере большого ряда соединений с различным размером цикла — от 6 до 36-членного. В их число входят, прежде всего, ионофорный антибиотик энниатин В, цикло и его ШИШ, — сте-реоизомерный аналог с измененной последовательностью конфигураций трех последних остатковNct. Niкомплекс энниатина В и Мкомплекс их иианалогаионофорный антибиотик вали-номицин, с заменой только одного остатка молочной кислоты ('¿-ас) на остаток метил-аланина (М?Й{&) или, иными словами, одного атома кислорода в основной цепи молекулы на метилированный атом азотааналоги октавалиномицина, цикло с заменой остатков на остатки Ь-Нш. (мезо-Н (Л-ана.д О ¿-¿-Л лога), либо тех же остатков Ь-1(ХС на остаткианалог). Исследовались также тетраэнниатин, цикло и РОД его стереоизомерных аналоговдипептид цикло [-L-MatS СНГ-] и дидепсипептиды цикло [-[ - MalL-U^-J и uyimol-Jj-iieVuif-JJ-f-i^i-], причем два последних соединения явились первыми структурноизученными циклодидепсипепти-дами. Диссертация состоит из семи глав. В первой главе обобщен материал по строению как линейных, так и циклических пептидов и депсипептидов в кристаллахрассмотрены принципы классификации пептидов и номенклатура, принятая при их описании. Для линейных пептидов проанализированы конформационные состояния основной цепи, а также строение концевых групп.

При анализе структур. циклических пептидов и депсипептидов особое внимание уделялось принципам свертывания пептидной (депсипептидной) цепи при замыкании цикла, а также рассмотрению соотношения структура — свойство (биологическая активность). Отдельно рассмотрены строение пептидной группы (и получены точные ее геометрические параметры), боковых радикалов, охарактеризованы и классифицированы внутримолекулярные водородные связи, реализующиеся как в линейных, так и в циклических пептидах.

Глава 2 содержит результаты структурного исследования валил-содержащих циклических дипептидов и дидепеипептидов. Наряде с анализом конформаций всех изученных молекул в отдельности, проводится также сравнительный анализ конформаций структурно-изученных валил-содержащих циклов и рассматривается строение цис-амидной и цис-сложноэфирной групп в этих циклах.

В главе 3 приводятся данные по строению в кристаллах тетраэнниатина, цикло, и его стереоизомерных аналоговпроводится сопоставление экспериментальных конформационных параметров молекул с рассчитаными теоретическиизучается связь между симметрией цикла и симметрией в характере и расположении боковых радикалов, между напряженностью цикла и легкостью его образования из соответствующей линейной молекулыи, наконец, приводятся средние характеристики N-метиламидной и сложноэфирной групп в твтрациклах.

Наиболее объемная четвертая глава посвящена строению в кристаллах гексациклов — энниатина В и его ЬЛЬЬЛЬ-аналога в свободном состоянии и в виде комплексов с металлами. В результате структурных расшифровок получены уникальные данные о конформационных изменениях в молекулах при вхождении их в комплексы, о типах связывания ионов металлов антибиотиками энниатинового ряда и местах локализации этих ионов. Все эти данные легли в основу развитых в главе 6 представлений о механизме ионного транспорта антибиотиками данного ряда. В главе 4 проводится сопоставление конформаций гексадепсипептид-ных молекул, реализующихся в кристалле, растворе и полученных путем теоретических расчетов. Эта глава содержит также сравнительную характеристику конформационных состояний остатков N-метиламидной и сложноэфирной групп в этих циклах.

В главе 5 анализируется строение структурно-изученных больших циклов: окта-мезо-/^-валиномицина, [Мейбг2'6]—октавалиномицина (24-членные циклы) и [МеШ2-} валиномици-на (36-членный цикл). Конформационные характеристики молекул ставятся в параллель с их биологической активностью. Для выявления генетической связи между на первый взгляд очень разными конформациями молекул в рядах октадепсипептидных и доде-кадепсипептидных циклах проведен сравнительный анализ конформационных состояний молекулярных циклов в каждом из этих рядов.

В этой же главе рассматриваются различные стадии взаимодействия иона с ионофорным антибиотиком валиномицином на атомно-молекулярном уровне. В одном из разделов этой главы анализируется строение /V-метиламидной и сложноэфирной шрупп в больших циклах и получению характеристик «стандартных» групп.

Глава 6 посвящена рассмотрению связи между строением и активностью антибиотиков энниатинового ряда, рассмотрению, которое базируется на структурных данных, собственных и литературных. Прежде всего, как это упоминалось ранее, фиксируются активные в смысле связывания ионов металлов «места» молекул. Затем анализируются существующие представления о механизмах транспорта ионов через биологические и искусственные мембраны и формулируются структурные аспекты этого транспорта на атомно-молекулярном уровне.

И, наконец, в главе 7 представлены методики получения и обработки экспериментальных данных, методы решения и уточнения структур, в большинстве своем значительно превышающих средний уровень сложности.

Материалы диссертации отражены в 61 публикации, в том числе в четырех больших работах обобщающего и обзорного характера, опубликованных в СССР и за рубежом (США, ШР), и многократно докладывавшихся на Международных и Всесоюзных съездах, симпозиумах и совещаниях.

Мне посчастливилось многие годы проработать под руководством академика Б. К. Вайнштейна. Постоянное внимание, консультации и советы Бориса Константиновича оказали неоценимую помощь при выполнении исследования.

Успех исследований, результаты которых представлены в настоящей работе, во многом определялся многолетним научным контактом с учеными из Института биоорганической химии — академиком К).А. Овчинниковым, чл.-корр. АН СССР В. Т. Ивановым и их сотрудниками, чьи выдающиеся достижения в области изучения мембрано-активных комплек-сонов в растворах послужили толчком и основой для изучения данного класса соединений и в кристаллах. Этим ученым я обязана своим становлением как специалиста в области стереохимии мембрано-активных соединений, им я благодарна за чрезвычайно полезные обсуждения результатов и ценные замечания, за тот великолепный набор кристаллов, без которого работа просто бы не состоялась.

В исследовании отдельных групп соединений принимали участие Н. Е. Жухлистова, В. И. Смирнова, Н. В. Назимова, З. Каримов, К. М. Поляков, А. М. Михайлов, В. В. Борисов, А. Д, Васильев, которым я благодарна не только за их вклад в работу, но и за радость человеческого общения.

Структурные расчеты в большинстве своем проводились по программам, написанным В. И. Андриановым, В. В. Борисовым, Л. А. Мурадян, А. Б. Товбисомк этим ученым приходилось неоднократно обращаться за помощью и консультациями.

При съемках на дифрактометрах неоценимую помощь оказали Ю. В. Некрасов, Н. И. Сосфенов, Д. М. Хейкер с сотрудниками, В. И. Пономарев.

В оформление работы внесли свой вклад Н. Е. Жухлистова, Н. В. Назимова, В. И. Смирнова, К. М. Поляков, О. В. Мороз. Всем им приношу свою глубокую благодарность.

Выполнению работы способствовала обстановка творческого напряжения, царящая в лаборатории структуры белка Института кристаллографии, которой руководит Борис Константинович Вайнштейн.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Полученные в работе данные показывают, что циклопептиды обладают исключительно богатыми конформационными возможностями, принимая, в зависимости от первичной структуры, конформации, напоминающие складчатый лист, диск, савдвич, пропеллер, браслет и т. д. В кристалле, как правило, реализуется наиболее низкоэнергетическая расчетная конформация, близкая к одной из конформаций, существующих в растворе. Свойства такой конформации удивительно точно соответствуют выполняемой биологической функции.

Незамещенные амидные группы /УН циклопептидов проявляют ярко выраженную тенденцию к образованию ВМВС с атомами кислорода карбонильных групп. К числу наиболее устойчивых ВМВС относятся связи типа 4-^1, менее устойчивы связи типа 5.

Конформационные^, Vточки отдельных остатков чаще всего, располагаются вблизи соответствующих разрешенных областей, но для напряженных циклических систем могут смещаться из этих областей, либо перемещаться в несвойственные для данного типа остатков «чужие» области.

Получены геометрические характеристики циси транс-амидной и транс-сложноэфирной групп в циклах разного размера, а также прослежены изменения этих характеристик при образовании комплексов с металлами .