Разработка методик высокоразрешающей зондовой микроскопии бионаноуглеродных материалов

Разработка методов повышения эффективности формирования человеческих тканей, при регенерации повреждённых или создании новых органов, на данный момент, является актуальной задачей тканевой инженерии.

Известно, что традиционные методы хирургического протезирования сталкиваются с определенными трудностями, возникающими также в ряде других областей практической медицины. В связи с этим, в качестве заполняющего материала хирургических имплантатов были предложены объемные нанокомпозиты, изготовленные из водных дисперсий альбумина с углеродными нанотрубками под действием теплового и лазерного излучения. Выбор доступного, водорастворимого и фотостойкого глобулярного белка — альбумина, осуществляющего в организме человека и животных транспортную функцию, был обусловлен успешным опытом его применения в составе лазерных «биоприпоев».

Для установления структуры нанотрубчатых композитов возможно результативное применение методов микроскопии высокого разрешения на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ), а также метод сканирующего зонда Кельвина.

Влияние электрических и электромагнитных полей на биологические объекты является перспективным направлением исследований в регенеративной медицине, тканевой и генной инженерии, клеточной технологии и в лечении различных заболеваний. Так, воздействие электрических полей на клетки остеобластов приводит к значительному увеличению пролиферации клеток одновременно с возрастанием в них активности щелочной фосфатазы. В поврежденных тканях, всегда присутствуют токи и потенциалы, которые участвуют в восстановлении повреждений, в частности, повреждений нервных и покровных тканей. Приложение внешних электрических полей позволяет ускорять заживление ран за счёт миграции клеток в область повреждения. Однако, основные механизмы влияния электромагнитных и электрических полей на клеточном и молекулярном уровне остаются пока неизученными досконально.

В связи с этим часть исследований в диссертации посвящена влиянию электрической стимуляции на ускоренное заживление тканей и рост клеток. Основная проблема традиционных методов подведения внешнего электрического поля заключается в том, что отсутствует возможность локализовать поле в области заживления. В общем случае электрической стимуляции подвергается значительная площадь организма. Решение данной проблемы может быть найдено при использовании имплантируемых электродов, локализующих электрическое поле в необходимом участке организма. Таким образом, используя имплантируемые электроды малого размера можно добиться стимулирования регенерации поражённых участков при меньших амплитудах напряжённости электрического поля и меньших частотах генерации сигнала. Подобные инвазивные методы требуют использования биодеградируемых материалов, оказывающих минимальное механическое воздействие на окружающие органы и ткани. Одной из перспективных методик в данной области является использование композитных материалов на основе углеродных нанотрубок (УНТ).

На данный момент не существует технологии секвенирования нуклеиновых кислот с необходимой точность и получением и информации о вторичных изменениях, таких как метилирование и многих других известных изменениях отдельных оснований на уровне индивидуальных молекул ДНК и/или РНК. Наконец, ни одна существующая технология не позволяет проводить секвенирование без синтеза, амплификации молекул нуклеиновых кислот и других вспомогательных методов. В связи с этим весьма актуальны исследования, направленные на разработку технологии секвенирования нативной конфигурации ДНК/РНК без добавления дополнительных нуклеотидов, меток, амплификации, или другого любого метода, который вводит количественные ошибки или артефакты. Разработка технологии прямого секвенирования до уровня жизнеспособной научной методики позволит значительно увеличить объем и качество наших знаний о нативном геноме, транскриптоме и эпигеноме, что значительно превысит возможности существующих технологий. В большом числе недавних исследованиий явно показана связь общего генезиса болезней с характеристиками ДНК и РНК, выходящими далеко за пределы простой последовательности и которые или очень сложно, или вообще нельзя анализировать существующими технологиями: редактирование РНК, модификации отдельных нуклеотидов, окисление ДНК и РНК, регуляторные комплексы ДНК-РНК, комплексы РНК-РНК, комплексы РНК с гистонами, все они участвуют в 5 патогенезе заболеваний и находятся вне досягаемости современных технологий секвенирования.

Методы высокоразрешающей атомно-силовой, туннельной микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния света, усиленной зондом, позволят продвинуться в сторону секвенирования ДНК молекул.

Цель работы и основные задачи.

Целью диссертационной работы является исследование зондовыми методами структуры бионаноуглеродных материалов, возможности использования этих материалов для культивирования клеточных структур, возможностей секвенирования ДНК молекул. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать методику исследования объемного нанотрубчатого композита на основе альбумина и углеродных нанотрубок методами атомно-силовой микроскопии высокого разрешения.

• Разработать методику контроля клеток фибробласта, выращенных на пленках из углеродных нанотрубок, в том числе с применением атомно-силовой микроскопии.

• Разработать методики атомно-силовой, туннельной микроскопии, спектроскопии комбинационного исследования, усиленной зондом ДНК молекул с высоким разрешением.

Научная новизна работы.

• Явление «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя бионаноуглеродного композита (или «утопливания» полимерных участков поверхности композита), с помощью которого устанавливается распределение углеродных нанотрубок при атомно-силовой микроскопии.

• Закономерности электростимулированного роста клеточной культуры фибробласта.

• Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий влияние конечного радиуса острия зонда и атмосферы воздуха, позволяющий проводить оценку их геометрических параметров.

Достоверность научных положений, результатов и выводов.

Полученные экспериментальные результаты и разработанные методики подтверждаются известными теоретическими моделями. Опубликованные результаты согласуются с известными экспериментальными данными зарубежных авторов и дополняют их.

Теоретическая значимость исследования состоит в развитии моделей атомно-силовой и туннельной микроскопии высокого разрешения для бионаноуглеродных композитов, в том числе для ДНК молекул.

Практическая значимость исследования состоит в том, что разработанные методики могут быть использованы для контроля качества бионаноуглеродных композитов, используемых при регенерации повреждённых или создании новых органов, и в тканевой инженерии для электрической стимуляции роста клеточных структур. Полученные результаты исследований могут быть использованы в курсах «Методы зондовой микроскопии» и «Методы зондовой нанотехнологии».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Атомно-силовая микроскопия бионаноуглеродных композитов в атмосфере воздуха, учитывающая явление «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита.

2. Методика контроля взаимодействия локальных электрических полей с клеточными структурами, культивированными на бионаноуглеродных подложках, необходимая и достаточная для проведения оценки корреляций структурных элементов нанокомпозита и геометрической конфигурации формируемых клеточных монослоев.

3. Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий конечный радиус острия зонда и влияние атмосферы воздуха, необходимый и достаточный для проведения оценки их геометрических параметров.

4. Методика сканирования ДНК молекул в атмосфере воздуха с высоким разрешением для обеспечения нуклеотидной характеризации биополимеров на основе различия их электро-оптических свойств.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: Международный форум по нанотехнологиям «Rusnanotech 10». Москва.

2010.

International Conference «Advanced carbon nanostructures». St. Petersburg- 2011.

12 th international Conference on the Science and Application of nanotubes 2011. Cambrige, UK.

XIX Всероссийская межвузовская научно-техническая конференция студентов и аспирантов «Микроэлектроника и информатика — 2012» (Москва, Россия, апрель 2012).

Meeting on the Chemistry of Nanotubes and Graphene «ChemOnTubes 2012». Arcachon, France. — 2012.

VIII Russian-Bavarian conference on biomedical engineering. 2012. Saint-Petersburg.

Публикации.

Основные результаты исследования, проведенного соискателем, изложены в 15 научных трудах, опубликованных в отечественной и зарубежной литературе, из которых 6 опубликованы в журналах из перечня ВАК. Также соискатель является соавтором двух патентов на изобретение Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка сокращений, списка литературы и приложения.

Выводы по главе 4.

Для достижения целей секвенирования ДНК молекул были усовершенствованы методики сканирующей атомно-силовой и туннельной микроскопии. Освоена новая методика спектроскопии комбинационного рассеяния света, усиленная зондом, на экспериментальном отечественном приборе. В результате:

1. Методика атомно-силовой микроскопии ДНК молекул в атмосфере воздуха позволяет анализировать их латеральное изображение и оценить их диаметры.

2. Методика сканирующей туннельной микроскопии ДНК — молекул в атмосфере воздуха на подложках из пиролитического графита, позволяющая получать информацию о структуре цепочек ДНК.

3. С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света удалось идентифицировать ряд нуклеотидов в бактериальных ДНК молекулах и получить усиление сигнала с помощью подведенного зонда.

Заключение

.

1. На примере бионаноуглеродного нанокомпозита на основе альбумина и углеродных нанотрубок разработана методика атомно-силовой микроскопии в полуконтактной моде, в которой проявляются специфические артефакты, связанные с эффектом «выдавливания» углеродных нанотрубок из поверхностного слоя композита (или «утопливания» полимерных участков поверхности композита).

На всех топографиях поверхности биополимерных композитов углеродные нанотрубки всегда выделяются над полимерной матрицей, как при малых концентрациях, так и при больших концентрациях углеродных нанотрубок. Эти результаты находятся в соответствии с теоретическими предпосылками.

2. Разработана методика контроля роста клеток в электрических полях на пленках из углеродных нанотрубок и бычьего сывороточного альбумина на основе электрических измерений, АСМ, химических методик и оптической микроскопии.

Продемонстрировано, что при токах до 10 нА происходит увеличение коэффициента пролиферации на 20%. При увеличении тока пролиферативная активность снижается, при этом происходит гальванотаксис клеток фибробластов вдоль линии поля и организация их в крупные конгломераты, что связано с ориентирующим действием локальных потенциалов в области контактов перколированных в сетки нанотрубок.

В ходе проведенных исследований были разработаны, изготовлены и запатентованы подложки с электропроводящим покрытием на основе одностенных углеродных нанотрубок и бычьего сывороточного альбумина, и устройство для электрической стимуляции клеток, которые могут быть использованы при культивировании клеток.

Для достижения целей секвенирования ДНК молекул были усовершенствованы методики сканирующей атомно-силовой и туннельной микроскопии. Освоена новая методика спектроскопии комбинационного рассеяния света, усиленная зондом, на экспериментальном отечественном приборе. Получены следующие результаты.

3. Метод атомно-силовой микроскопии ДНК молекул, учитывающий конечный радиус острия зонда и влияние атмосферы воздуха, необходимый и достаточный для анализа их латеральных изображений и оценки их диаметров.

4. Методика сканирующей туннельной микроскопии ДНК молекул в атмосфере воздуха на подложках из пиролитического графита позволяет получать информацию о структуре цепочек ДНК.

5. С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света идентифицирован ряд нуклеотидов в бактериальных ДНК молекулах и получено усиление сигнала с помощью подведенного зонда.

Список использованных сокращений.

СЗМ — сканирующая зондовая микроскопия;

АСМ — атомно-силовая микроскопия;

СТМ — сканирующая туннельная микроскопия:

РЭМ — растровая электронная микроскопия;

ПЭМ — просвечивающая электронная микроскопия;

ВИМС — вторично-ионная масс-спектроскопия.

УНТ — углеродные нанотрубки;

ОУНТ, ОСНТ — одностенные углеродные нанотрубки;

МУНТ, МСНТ — многостенные углеродные нанотрубки;

КР — комбинационное рассеяние;

КП — коэффициент пролиферации;

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота;

РНК — рибонуклеиновая кислота.