Актуальность проблемы.
В естественной среде генетическая изменчивость и рост микроорганизмов подвержены влиянию различных химических факторов. Достаточно глубоко исследовано влияние некоторых простых ростовых субстратов и необходимых элементов на физиологические процессы модельных ' штаммов бактерий. В то же время, in vivo клетки микроорганизмов подвержены влиянию ряда веществ, не являющихся необходимыми составляющими питательной среды, но проявляющих различную биохимическую и генетическую активность [24, 89]. Некоторые из этих соединений имеют большое значение в стимуляции или ограничении роста бактерий, в формировании, стабилизации и изменении микробных сообществ. Однако экологическая роль подобных компонентов среды мало изучена [11, 18, 20,24].
Растительный мир — огромное по разнообразию, численности и общей биомассе царство автотрофных организмов, продуцирующих и поставляющих в среду подавляющую часть природных органических соединений [18,34]. Растения являются источником разнообразных биологически активных веществ, которые могут быть эффективными экологическими факторами в микроценозах [18, 89].
Флавоноиды — биогенные фенольные вещества, производные флавана или флавона, содержащиеся в тканях высших растений. В настоящее время известно более четырех тысяч индивидуальных флавоноидов и их производных. Разнообразие флавоноидов достигается за счет комбинации заместителей (-ОН, -ОСНз, -СНз и др. групп) в ароматических кольцах, гликозилирования и димеризации [142]. Как и другие фенольные вещества, флавоноиды связывают свободные радикалы, хелатируют катионы металлов. Эти соединения обладают широким спектром физиологического и биохимического действия на живые организмы различных таксономических групп: участвуют в процессах дыхания, онтогенеза, окислительновосстановительных и защитных системах растений [10, 32] влияют на проницаемость мембран [208], являются эффекторами или субстратами ряда ферментов различных организмов [161]. Известны антиоксидантные [74], антирадикальные [73], противоопухолевые [206], антимутагенные [235] и противовирусные [92] свойства флавоноидов, Р-витаминная активность [208].
Ежегодно растительный мир Земли продуцирует миллионы тонн флавоноидов, которые в существенных количествах поступают из растительных тканей в почву и водоемы, во все пищевые цепи, являются постоянными компонентами среды обитания значительной части живых организмов [10, 32, 128]. В отличие от многоклеточных организмов, бактерии имеют максимальный контакт клеточной поверхности с внешней средой, поэтому присутствие флавоноидов должно быть для них особенно значимо [20].
Флавоноиды являются постоянными компонентами продуктов питания человека [4, 21, 22]. Некоторые из них, например кверцетин и его гликозид рутин, используются в медицине. В то же время известно, что кверцетин мутагенен для эукариот [214]. Поэтому исследование генетических эффектов флавоноидов актуально для профилактической медицины [161].
Состояние вопроса.
Известны антиоксидантные [201] и антирадикальные свойства флавоноидов [6, 12], цитопротекторное действие на клетки эукариот в различных стрессовых условиях, основанное на связывании свободных радикалов [95, 119, 132].
Активно исследуются медицинские аспекты антирадикальных [167], ангиопротекторных [161,180,189], гепатопротекторных [55,119,165], антибактериальных [89], противовоспалительных и иммуномодулирующих [160, 161] свойств препаратов флавоноидов, их цитостатическое действие в отношении злокачественных клеток [99,170,238]. Сообщается об их мутагенном и антимутагенном действии на эукариоты, а также в микробных тест-системах в условиях метаболической активации ферментами микросомальной фракции печени животных [21,70,170]. Обнаружено антибактериальное действие кверцетина, хризина и катехина [89].
В то же время, влияние флавоноидов на изменчивость и рост бактерий мало изучено. Сведения об их прямом мутагенном действии, антимутагенной активности, антибактериальных свойствах фрагментарны и противоречивы. Опубликованные статьи не дают полного представления о значении флавоноидов как экологического фактора для бактерий. До настоящего времени не проводилось комплексного исследования влияния флавоноидов на рост, жизнеспособность и изменчивость симбиотической и патогенной для человека микрофлоры. Отсутствует оценка баланса мутагенных и антимутагенных свойств этих соединений, их совместного действия с химическими мутагенами и солями металлов [22,44,47].
Цель настоящего исследования — изучение влияния ряда флавоноидов на частоту мутаций и рост штаммов Escherichia coli и Salmonella typhimurium.
Основные задачи исследования:
1. Изучить влияние различных концентраций флавоноидов на рост энтеробактерий и грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и Bacillus mycoides.
2. Определить влияние флавоноидов на частоту замен оснований и фреймшифт — мутаций у штаммов S. typhimurium.
3. Оценить зависимость мутагенной активности флавоноидов от структуры их молекул.
4. Изучить совместное действие флавоноидов и стандартных мутагенов (9-аминоакридина, М-метил-К-нитро-К-нитрозогуанидина, бихромата, налидиксовой кислоты) на частоту мутаций у энтеробактерий.
5. Исследовать генетические эффекты флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.
Научная новизна.
Показано цитостатическое действие флавоноидов, относящихся к группам флавонов, флавон-3-олов, катехинов и флаванонов на клетки ^ грамотрицательных бактерий Е. coli и S. typhimurium, а также грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Впервые обнаружено мутагенное действие флавоноидов в культурах грамположительных бактерий Rhodococcus sp. и В. mycoides. Установлено, что флавоноиды без метаболической активации индуцируют у бактерий мутации различных типов, наиболее эффективно — мутации типа сдвига рамки считывания генетической информации. Впервые экспериментально показано антимутагенное действие флавоноидов на штаммах S. typhimurium против прямого мутагена акридинового ряда — 9-аминоакридина и оксиданта — бихромата калия. Выявлена модуляция генетического действия флавоноидов в присутствии солей двухвалентных металлов.
Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные данные, свидетельствующие о мутагенных и антимутагенных эффектах флавоноидов, расширяют представление о воздействии флавоноидов на рост и генетическую стабильность бактерий, и их значении, как экологического фактора в микроценозах. Результаты исследования имеют практическое значение для профилактической медицины. Обнаруженное явление усиления в присутствии флавоноидов эффективности мутагенеза, индуцированного нитрозогуанидином, может быть использовано в методах химического мутагенеза и селекции.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, т> нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ оказывают бактериостатическое действие.
2. Флавоноиды являются мутагенами прямого действия и индуцируют в клетках бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания.
3. Флавоноиды оказывают антимутагенное и цитопротекторное действие в условиях мутагенеза, индуцированного 9-аминоакридином и бихроматом калия.
4. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа.
Апробация работы и публикации.
Основные положения диссертационной работы доложены на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-98», МоскваОбластной научно-технической конференции молодых ученых «Химия и экология», Пермь, 1999; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды-2001», ВолгоградIX и XI Межвузовских конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология: проблемы и перспективы», Пермь, 2001, 2003.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Список принятых сокращений.
9-АА — 9-аминоакридин;
АФК активные формы кислородаднДНК — двунитевая ДНКон ДНК — однонитевая ДНК;
КОЕ колониеобразующие единицы;
МИК минимальная ингибирующая концентрация;
МННГ — NметилN — нитроNнитрозогуанидин;
МПА мясо-пептонный агарсод — супероксиддисмутаза;
LB среда Луриа-Бертани.
выводы.
1. Флавоны (6-гидроксифлавон, 7-гидроксифлавон, хризин), флавон-3-олы (кверцетин, морин, 3-гидроксифлавон, 3,6-дигидроксифлавон, 3,7-дигидроксифлавон), флаваноны (6-гидроксифлаванон, нарингенин, нарингин) и катехин в концентрации свыше 0,1 мМ подавляют рост бактерий. Ингибирование роста бактерий обусловлено в большей степени цитостатическим, чем бактерицидным действием флавоноидов.
2. Установлено, что флавоноиды проявляют свойства мутагенов прямого действия. Концентрационная зависимость их мутагенного эффекта имеет нелинейный характер.
3. Показано, что флавоноиды индуцируют у бактерий преимущественно мутации типа сдвига рамки считывания. Генетическая активность структурно различных флавоноидов проявляется в разной степени.
4. Установлено, что флавоноиды в концентрации до 0,5 мМ обладают антимутагенным и цитопротекторным действием при воздействии интеркалирующего мутагена 9-аминоакридина и окислителя бихромата.
5. Обнаружено, что флавоноиды за счет повышения выживаемости клеток увеличивают эффективность мутагенеза, индуцируемого нитрозогуанидином.
6. Генетические эффекты флавоноидов изменяются в присутствии ионов двухвалентных металлов и трехвалентного железа. Ионы двухвалентных металлов, за исключением магния, усиливают антимутагенное действие флавоноидов в отношении 9-аминоакридина. Металлы с переменной валентностью увеличивают частоту мутаций, индуцируемых флавоноидом.
