Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз EcoRII и SssI с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования

Диссертация: Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз EcoRII и SssI с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В тех случаях, когда информация о ферменте ограничена, однако имеются данные РСА для родственных ферментов, широкое применение находит метод моделирования по гомологии, позволяющий предсказать пространственную структуру фермента на основании известных структур родственных ферментов. Существует два основных метода распознавания укладки белка. Один из них основан на анализе аминокислотных… Читать ещё >

Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз EcoRII и SssI с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Список сокращений
  • Глава 1. С5-ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ! и Збб!
  • Обзор литературы)
    • 1. 1. Общие’сведения о прокариотических С5-ДНК-метилтрансферазах
    • 1. 2. Моделирование С5-МТаз по гомологии
    • 1. 3. ДНК-метилтрансфераза Бээ!
      • 1. 3. 1. Общие сведения о ферменте
      • 1. 3. 2. Изучение механизма взаимодействия М.8зз1 с ДНК
      • 1. 3. 3. Применение М^б! в молекулярной биологии
    • 1. 4. ДНК-метилтрансфераза ЕсоШ
      • 1. 4. 1. Общие сведения о ферменте
      • 1. 4. 2. Изучение механизма взаимодействия М. ЕсоШ1 с кофактором
      • 1. 4. 3. Изучение механизма взаимодействия М. ЕсоКП с ДНК
      • 1. 4. 4. М.ЕсоШ1 как регулятор гена М. Есо1Ш
      • 1. 4. 5. Применение М. ЕсоШ1 в молекулярной биологии
    • 1. 5. Дезаминирование метилируемого остатка цитозина
  • Глава 2. Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз ЕсоШ! и Збб! с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования (Обсуждение результатов)
    • 2. 1. Зондирование контактов ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ1 с ДНК методом фотоаффинпой модификации
      • 2. 1. 1. Дизайн аналогов субстрата
      • 2. 1. 2. Взаимодействие М. ЕсоМ1 с аналогами субстрата, содержащими остаток 5-[4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазиринЗ-ил)фенил]-2-урацила
      • 2. 1. 3. Взаимодействие М. ЕсоМ1 с аналогами субстрата, содержащими остаток 5-иодурацила
      • 2. 1. 4. Анализ продуктов ковалентного присоединения М. ЕсоШ к ДНК-дуплексам II, У-УН
    • 2. 2. Моделирование по гомологии ДНК-метилтрансферазы EcoR. II и ее комплекса с ДНК и АёоНсу
      • 2. 2. 1. Общая стратегия моделирования
      • 2. 2. 2. Оценка модели М. Есо1Ш
      • 2. 2. 3. Описание модели М. ЕсоЫ1 и ее комплекса с ДНК и А (1оНсу
      • 2. 2. 4. Предсказанные взаимодействия М. ЕсоКП с ДНК
      • 2. 2. 5. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными
    • 2. 3. Моделирование по гомологии ДНК-метилтрансферазы SssI и ее комплекса с ДНК и AdoHcy
      • 2. 3. 1. Общая стратегия моделирования
      • 2. 3. 2. Оценка модели M. SssI
      • 2. 3. 3. Описание модели M. SssI и ее комплекса с ДНК и AdoHcy
      • 2. 3. 4. s. Предсказанные взаимодействия M. SssI с ДНК
      • 2. 3. 5. Предсказанные взаимодействия M. SssI с аналогом кофактора (AdoHcy)
      • 2. 3. 6. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными

Метилирование ДНК, осуществляемое ДНК-метилтрансферазами (МТазами), играет важную роль в регуляции многих биологических процессов, таких, как репарация ДНК, защита клетки от проникновения чужеродной ДНК, регуляция транскрипции некоторых генов, конденсация хроматина и др. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метальную группу от кофактора'-аденозил-ь-метионина (АёоМе!) на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин. В процессе реакции Ас1оМе[ превращается в-аденозил-ь-гомоцистеин (АёоНсу). К настоящему времени большая часть информации о структуре С5-МТаз и их комплексов с ДНК, а также о механизме реакции метилирования, получена при изучении двух прокариотических С5-МТаз — М. НЬа1 и М.НаеШ. Информация о других прокариотических МТазах и эукариотических ферментах ограничена. В связи с этим, актуальной задачей является изучение механизма метилирования ДНК и структуры комплексов расширенного круга прокариотических МТаз с ДНК. Кроме того, учитывая гомологию аминокислотных последовательностей эукариотических и прокариотических МТаз, целесообразным представляется использовать последние в качестве моделей для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами.

Объектом исследований в настоящей работе явились МТазы ЗббГ и ЕсоШ1, которые т узнают в ДНК последовательности СО и СС /дСС, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина © по атому углерода в 5-ом положении. М^бГ является уникальной прокариотической МТазой, узнающей ту же нуклеотидную последовательность, что и эукариотичские МТазы. Имеются, данные, что эукариотические ферменты также могут т т метилировать С /д или СС /дбО участки. Для обеих МТаз данные рентгеноструктурного анализа (РСА) отсутствуют, и практически неизвестно, какие аминокислотные остатки ферментов обеспечивают узнавание ДНК и принимают участие в катализе.

Метод фотоаффинной модификации (ФМ) фермента модифицированными ДНК-дуплексами, содержащими фотоактивные группы, — один из наиболее перспективных методов, позволяющих определять аминокислотные остатки или участки фермента, ответственные за связывание ДНК или осуществление катализа.

В тех случаях, когда информация о ферменте ограничена, однако имеются данные РСА для родственных ферментов, широкое применение находит метод моделирования по гомологии, позволяющий предсказать пространственную структуру фермента на основании известных структур родственных ферментов. Существует два основных метода распознавания укладки белка. Один из них основан на анализе аминокислотных * последовательностей моделируемого белка и белков с известными структурами. В основе другого метода, получившего название «протягивание нити» (threading), лежит идея о том, что одинаковую упаковку могут иметь белки и с негомологичными аминокислотными последовательностями. Существует много программ для распознавания укладки белков и поиска шаблонов для моделирования, работа которых основана на одном из этих двух методов. Каждая из программ имеет свои’Сильные и слабые стороны. В последнее время в области моделирования белков по гомологии был достигнут значительный прогресс, связанный с созданием и развитием метасерверов, позволяющих получать более точные предсказания за счет комбинирования результатов, полученных несколькими независимыми программами. Модели белков, построенные с использованием метасерверов, обладают достаточно высоким качеством. На основании модели фермента и его комплекса с ДНК, можно сделать предположение о том, какие аминокислоты участвуют в связывании ДНК и катализе.

Целью настоящей работы явилось изучение ДНК-белковых контактов в комплексах M. EcoRII и M. SssI с ДНК и определение функционально значимых областей M. EcoRII с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования.

В задачи работы входило: 1) получение конъюгатов M. EcoRII с фотоактивными аналогами ДНК-субстрата- 2) определение участков M. EcoRII, к которым происходит ковалентное присоединение фотоактивных ДНК-дуплексов- 3) моделирование комплексов M. EcoRII-ДНК-AdoHcy и M. SssI-ДНК-AdoHcy и предсказание аминокислотных остатков М. ЕсоШ1 и М^ээ!, вовлеченных во взаимодействие с ДНК- 4) сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными для выявления наиболее вероятных контактов между ферментами и ДНК.

ВЫВОДЫ.

1. Получены конъюгаты M. EeoRII с ДНК-дуплексами, содержащими остатки 5иодурацила и 5-[4-(Э-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил]-2-урацила в различных т положениях участка узнавания EcoRII (СС /aGG). Выходы конъюгатов зависят от типа модификации и ее локализации в участке узнавания.

2. Проведено расщепление химическими реагентами продуктов, фотоприсоединения фотоактивных ДНК-дуплексов к M.EeoRII. Установлено, что метилируемый цитозин сближен с областью L84-M251 (мотивы I-VI), а центральное основание метилируемой цепи участка узнавания — с областью E339-W389 (TRD).

3. Построена модель комплекса M. EeoRII с ДНК и аналогом кофактора AdoHcy.

Согласно модели остатки F184 (мотив IV), Е233 (мотив VI) и R287 (мотив VIII) участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина, а Al92 (мотив IV) участвует в стабилизации неспаренного гуанина. Остаток L191 (мотив IV) взаимодействует с «внешним» гуанином неметилируемой цепи участка узнавания. Остатки R375, Y376 и Н377 (TRD) участвуют в т узнавании СС /aGG, при этом R375 и Н377 взаимодействуют с «внешним» и «внутренним» гуанинами метилируемой цепи, соответственно, Н377, кроме того, образует контакт с «внутренним» цитозином неметилируемой цепи, Y376 взаимодействует с «внутренним» гуанином неметилируемой цепи. Контакты R375 и Н377 с гуанинами подтверждены экспериментально.

4. Построена модель комплекса M. SssI с ДНК и аналогом кофактора AdoHcy. Согласно модели остатки F139 (мотив IV), Е186 (мотив VI), R232 (мотив VIII) и Т313 (TRD) участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина. Остатки Q147 (мотив IV) и S300 (TRD) занимают пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина и взаимодействуют с неметилируемой цепью участка узнавания. Остаток S317 (TRD) участвует в узнавании CG. Роль остатков Q147, Е186, R232 и Т313 подтверждена экспериментально.

2.4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В связи с тем, что сходство и различия в механизме действия С5-МТаз связывают, во многом, со сходством и различием их участков узнавания в ДНК, представлялось интересным проанализировать и сравнить механизмы взаимодействия с ДНК трех С5-МТаз: М. Ша1, М^в! и М.ЕсоЯН. Как уже упоминалось в гл. 1, для МТаз, узнающих похожие последовательности, можно выделить гомологичные фрагменты внутри ТИХ) [17, 18]. Участок узнавания М. Бяз! (СО) входит в состав участка узнавания М. НЬа! (вСОС). Сравнение пространственных структур ДНК-узнающих доменов М. НЬа! и M. SssI показывает, что они содержат похожие элементы. Также можно отметить сходство и в механизме взаимодействия этих МТаз с ДНК. На рис. 23 представлено сравнение контактов M. SssI и M. Hhal с последовательностью GCGC. Остановимся подробнее на контактах между каждой из цепей ДНК (метилируемой и неметилируемой) и аминокилотными остатками ферментов. В случае M. SssI наблюдаются контакты гетероциклических оснований неметилируемой цепи участка узнавания с Ser300 и Gin 147. В случае M. Hhal наблюдаются контакты гетероциклических оснований неметилируемой цепи участка узнавания с Gln237 и Gly257.

J 46.

R240"E «Q252 р79 S v2S4 гад Y.

ГП пы G у G Н 0 cl G га G.

3' ®V (r)y® (r) 5' t.

4®^(r)A® 5'.

Q237 0 257.

Рис. 23. Схемы, показывающие контакты между М. Бзб! (А, по данным моделирования) или М. НЬа! (Б. по данным РС А, [31 ]) и гетероциклическими основаниями в составе участков узнавания в ДНК. Обозначения как на рис. 17.

Как уже упоминалось в предыдущем разделе, замены 01п237 в М. НЬа! и ЭегЗОО в М. Ззб! на другие аминокислотные остатки не приводили к значительному ухудшению связывания ферментов с ДНК или блокировке метилирования. Данные остатки не важны для связывания и метилирования. Их роль заключается в стабилизации структуры ДНК после «выпетливания» метилируемого основания. С1у257 в М. НЬа!, взаимодействующий с 5'-концевым остатком цитозина, не входящим в состав участка узнавания М. ЭззЬ расположен в петле, отсутствующей в структуре М-Бээ! Интересной аминокислотой является С1п147 в М. ЗззГ Показано, что данный аминокислотный остаток необходим для каталитической активности М.5зз1 [102].

Контакты с метилируемой цепью аналогичны для обоих ферментов. Оба фермента взаимодействуют с СО-последовательностью (центральной последовательностью в случае.

M.Hhal). Интересно отметить, что в случае M. SssI на основе модели пресказан контакт.

Q146 с 5'-концевым остатком гуанина, не входящим в состав участка узнавания M.SssI.

Наличие данного контакта косвенно подтверждается экспериментальными данными [61].

Вероятно, данный контакт необходим для правильного расположения Gin 147. В случае.

M.Hhal, кроме того, наблюдается контакт Туг254 с З'-концевым остатком гуанина, не входящим в состав участка узнавания M.SssI. Данный аминокислотный остаток расположен в петле, отсутствующей в структуре M.SssI. т.

Узнаваемая последовательность M. EcoRII (СС /aGG) значительно отличается от узнаваемых последовательностей M. HhaI и M.SssI. В связи с этим практически невозможно сравнивать схему контактов данного фермента с ДНК со схемами контактов M. Hhal и M. SssI с ДНК. Отличия наблюдаются и в механизме стабилизации «неспаренного» гуанина после «выпетливания» метилируемого цитозина. В структуре M. EcoRII отсутствует аминокислотный остаток, аналогичный Gln237 в M. Hhal и Ser300 в M.SssI. Возможно, стабилизация «неспаренного» гуанина в данном случае обеспечивается А1а192 (аналог Ser87 в M. Hhal и Glnl47 в M. SssI) и Туг376.

Подводя итог, можно отметить, что предсказания, сделанные на основе построенных моделей М. ЕсоКП-ДНК-Ас1оНсу и M. SssI-^HK-AdoHcy, обладают достаточно высокой точностью. В случае модели М. Есо1Ш-ДНК-А<1оНсу предсказанные контакты M. EcoRII с ДНК хорошо согласуются с экспериментальными данными, полученными с помощью ФМ M. EcoRII фотоактивными ДНК-дуплексами, а также данными, имеющимися в литературе. В случае модели M. SssI^HK-AdoHcy предсказанные контакты консервативных аминокислотных остатков (Glul86, Arg232 и Thr313) с ДНК были подтверждены путем изучения свойств мутантных форм M. SssI по этим аминокислотным остаткам. Также, что особенно важно, была подтверждена необходимость Gin 147, не являющегося консервативной аминокислотой, для функционирования M.SssI.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и материалы Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остаток 5-[4-(3-(трифторметил)-3Н-диазиринЗ-ил)фенил]-2'-дезоксиурацила, были синтезированы Романовой Е. А. (Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ). Соответствующий амидофосфит для олигонуклеотидного синтеза был синтезирован Коршуновой Г. А. (Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ).

Олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие остаток 5-иод-2'-дезоксиурацила, были синтезированы Эритиа Р. (Испания, г. Барселона, Отдел молекулярной генетики, Национальный центр научных исследований).

Ферменты — МТаза EcoRII с активностью 1000 ед. акт./мкл и концентрацией 9 нМ выделена Кирсановой О. В. (химический факультет МГУ). HaN-конце фермента расположено дополнительно двадцать, аминокислотных остатков, из которых шесть являются остатками гистидина. За единицу активности M. EcoRII-принимали количество фермента, которое за 1 час при 37 °C защищает 1 мкг ДНК фага X от расщепления эндонуклеазой рестрикции EcoRII. Плазмида для выделения фермента любезно предоставлена Вартапетяном А. Б. (Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ). В работе также использовалась Т4-полинуклеотидкиназа (коммерческий препарат).

Реактивы: 2-меркаптоэтанол, персульфат аммония, этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (Merck, ФРГ), формамид (Fluka, Швейцария), трис-(гидроксиметил)-аминометан, акриламид, мочевина, глицин (Диаэм, Россия), ATP (Fharmacia, США), красители — маркеры бромфеноловый синий (ВРВ) и ксиленцианол (ХС), N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин, BNPS-скатол, 1,4-дитиотреитол,.глицерин, иодацетамид, S-аденозил-ь-гомоцистеин (Sigma, США), (у-32Р)-АТР с удельной радиоактивностью 1000 Юори/ммоль (ВО «Изотоп», Обнинск, Россия), додецилсульфат натрия, Ы, Ы'-метилен-бисакриламид (Life Technologies, Inc., США), ледяная уксусная кислота, муравьиная кислота (ООО «Авогадро», Россия), гуанидинхлорид, BrCN (ICN, США),-аденозил-ь-метионин (Serva, ФРГ).

Буферные растворы: А) 0.04 М Tris, рН 7.9, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 М ЭДТА, 5% глицеринБ) 0.04 М Tris-HCl, рН 7.9, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 М ЭДТАВ) 0.375 М Tris-IIC1, рН 8.8- Г) 0.125 М Tris-HCl, рН 6.8- Д) 0.025 М Tris-глицин, рН 8.6, 0.0035 М ДСНЕ) 0.05 М Tris-борат, рН 8.3, 0.001 М ЭДТАЖ) 0.025 М Tris-борат, рН 8.3, 0) 0.05 М КН2Р04, рН 7.0- 3) 0.05 М Tris-HCl, рН 9.0, 0.01 М MgCl2, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 спермидинИ) 0.04 М Tris-HCl, рН 7.9, 0.005 М дитиотреитол, 0.001 М ЭДТА. Используемые кислоты, щелочи, соли и органические растворители представляют собой коммерческие реактивы отечественного производства квалификации «осч» .

3.2. Приборы и методы Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов в УФ-области записывали на спектрофотометре «Hitachi», Model 150−20 (Япония) при комнатной температуре. Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера. Оптические измерения проводили в кварцевых кюветах (длина опт. пути 1 см) фирмы «Pye unicam» (Англия) и «Hellma» (ФРГ). Молярные коэффициенты экстинкции одноцепочечных олигонуклеотидов общей формулой DpEpFpC. KpL и длиной п расчитывали с точностью.

10% по формуле: ff^pfpc kpl =[2-(епрг. + ?epf + Sfpc +. + ?kpl) — ee — ef — ec —. — ек]/п. ?•^=15.4 о.е./мкмоль, s2pdC =7.4 о.е./мкмоль, ?^=11.5 о.е./мкмоль, e2pfr=8.7 о.е./мкмоль,.

3.7 о.е./мкмоль, ?M°piic=l0−6 о.е./мкмоль, ?^=12.5 о.е./мкмоль, s™pdl =11.4 о.е./мкмоль, о.е./мкмоль, ?™dC =7.3 о.е./мкмоль, e™pda =9−0 о.е./мкмоль, о.е./мкмоль, ?^=12.6 о.е./мкмоль, e™pdC =8.8 о.е./мкмоль, ^?L/G=10.8 о.е./мкмоль, sdGpdT=lO.O о.е./мкмоль, ?2J?°pdA =11.7 о.е./мкмоль, ?^,-=8.1 о.е./мкмоль, =9.5 о.е./мкмоль, ?™р[ГГ=%-4 о.е./мкмоль. рН растворов измеряли на потенциометре Model 701А фирмы Orion (США) с точностью до 0.005 рН. Препаративное микроцентрифугирование проводили на микроцентрифуге «Eppendorf-5414S» (Германия). Для упаривания микроколичеств водных растворов, а также для удаления следовых количеств этанола и ацетона использовали прибор «Speed Vac» (США). Микрообъемы растворов дозировали микрошприцами фирмы Hamilton (США) и автоматическими дозаторами фирмы Gilson (Франция) с точностью 5%.

Облучение комплексов M. EcoRII с ДНК-дуплексами 2 и 3 проводили с помощью УФ-лампы Mineralight (модель UVGL-58, мощность 6 Вт) со встроенным фильтром, излучающей УФ-свет с максимумом в районе А,~356 нм.

Облучение комплексов M. EcoRII с ДНК-дуплексами 4−9 проводили с помощью ртутной лампы сверхвысокого давления (мощность 10 Вт) с А>300 нм.

Электрофорез а) Электрофорез синтетических олигонуклеотидов проводили в плоском 20%-ном полиакриламидном геле (20% акриламида, 0,66% N, N'-метиленбисакриламида, 7 М мочевина в буфере Е) толщиной 0,75 мм при напряженности поля 50 В/см. Пробы наносили в 2−3 мкл 80%-ного водного раствора формамида, содержащего 1 М ЭДТА и красители-маркеры ХС (0,1%) и ВРВ (0,1%). б) Электрофорез комплексов ДНК-метилтрансферазы EcoRII с синтетическими субстратами в неденатурирующих условиях (метод «торможения в геле») проводили в плоском 18×16×0,075 см ПААГ (8% акриламида, 0.4% N, N'-метиленбисакриламида в буфере Ж) при напряженности поля 8,5 В/см. Пробы наносили в объеме 10 мкл (10 мкл реакционной смеси). в) Электрофорез белково-нуклеиновых комплексов и олигонуклеотидопептидов, полученных после расщепления белково-нуклеиновых комплексов химическими реагентами, проводили в плоском варианте (размер пластин 16×18 см, толщина геля — 0,75 мм или размер пластин 4×6 см, толщина геля — 0,75 мм). Концентрирующий гель — 4% акриламида, 0.104% М, М'-метиленбисакриламида, 0,1% ДСН в буфере Гразделяющий гель -12.5% акриламида, 0.33% N, N'-метиленбисакриламида, 0,1% ДСН в буфере В. В качестве электродного использовали буфер Д. Напряженность поля в концентрирующем геле 75 В/см, в разделяющем геле — 25 В/см. Пробы наносили в объеме 5−12 мкл (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, 3% ДСН, 5% меркаптоэтанол, 8 М мочевина, 5% глицерин, 0.1% ВРВ).

Для прокрашивания Кумасси R-250 гель вымачивали в фиксирующем растворе (100 мл СНзСООН, 200 мл С2Н5ОН, 200 мл Н20) в течение 10 мин, растворе Кумасси R-250 (50 мл СНзСООН, 150 мл С2Н5ОН, 300 мл Н20, 0.75 г Кумасси R-250) в течение 30 мин, после этого гель промывали 10%-ным раствором СНзСООН до обесцвечивания фона. Гели с концентрацией 8−15% сушили на приборе Gel Slab Dryer фирмы Hoefer Scientific Instruments (США).

Положение Р-меченных соединений определяли авторадиографией. Для авторадиографии использовали рентгенографическую пленку Retina Х-100 (ФРГ). Р-меченные олигонуклеотиды элюировали из геля 1 M водным раствором перхлората лития в течение 16 час. при комнатной температуре. Нуклеотидный материал осаждали ацетоном (2 раза). Осадок центрифугировали, промывали ацетоном и высушивали в вакууме.

Радиоактивность Р-меченных препаратов измеряли методом счета по Черенкову в импульсах в минуту на счетчике Delta 300 фирмы Тгасог (Нидерланды). Ошибка счета не превышала 2%.

3.3. Общие методики 3.3.1. Ферментативное 5'-фосфорилирование синтетических олнгонуклеотидов.

5'-32Р-фосфорилирование 0,01 o.e. при А.=260 нм олнгонуклеотидов Т4-полинуклеотидкиназой (10 ед.акт.) проводили 120 мин при 37 °C в буфере 3, содержащем (уР)-АТРобъем реакционной смеси 10 мкл. Продукты, содержащие «Р-метку, выделяли методом электрофореза в 20%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины.

3.3.2. Изучение метилирования модифицированных ДНК-дуплексов.

Эффективность метилирования оценивали по количеству введенной в ДНК-дуплексы радиоактивной метки (С[3Н]з). ДНК-дуплексы 1,2 и 4−8 (0.35 мкМ) инкубировали с М. ЕсоШ1 (0.35 мкМ) в 10 мкл буферного раствора И, содержащего 1 мкКи [С[ Н]з]-АёоМе1 (15 Ки/ммоль), при 37 °C в течение 30 мин. Реакционные смеси (по 8 мкл) наносили на фильтры БЕ 81. Далее фильтры промывали 50 мМ раствором КН2РО4 (5×150 мл). Фильтры высушивали, помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-106 и определяли радиоактивность 3Н-меченных препаратов. Относительный процент метилирования рассчитывали как отношение включения трития в ДНК-дуплексы 2 и 4−8 к включению трития в ДНК-дуплекс 1.

3.3.3. Изучение связывания модифицированных ДНК-дуплексов с М. ЕсоМ1.

Образование комплексов ДНК-дуплекс — МТаза проводили в буферном растворе А, то содержащем 1 мМ Ас1оМе1 (или 1 мМ Ас1оНсу). Конечная коцентрация Р-меченных ДНК-дуплексов (20 000 имп/мин) составляла 0.35 мкМ. Концентрация М-ЕсоШ1 составляла 1.75 мкМ. Реакционную смесь объемом 10 мкл инкубировали 5 мин при 20 °C, 15−20 мин при 0 °C. После электрофоретического разделения (условия см. выше) проводили авторадиографию геля. Выходы комплексов определяли как отношение радиоактивности комплекса фермент — ДНК к суммарному количеству радиоактивности комплекса и ДНК. В опытах по конкурентному ингибированию связывания диазиринсодержащих дуплексов с М. ЕсоШ1 в реакционную смесь, содержащую 32Р-меченный субстрат (0.35 мкМ) и фермент (1.75 мкМ), добавляли избыточное количество немеченногомодифицированного ДНК-дуплекса в соотношении молярных концентраций немодифицированного дуплекса (ингибитора)/ модифицированного аналога субстрата 1, 4, 16 и 32.

3.3.4. Ковалентное присоединение модифицированных ДНК-дуплексов к М. ЕсоШ1.

М.ЕсоШ1 (1.75 мкМ) инкубировали в 10 мкл буферного раствора Б, содержащего 0−2 мМ Ас1оМе1, с 32Р-меченными ДНК-дуплексами (0.35 мкМ) в течение 5 мин при комнатной температуре и в течение 15 мин при 0 °C. Далее облучали УФ-светом с длиной волны 366 нм (в случае диазиринсодержащего дуплекса) и >300 нм (в случае иодурацилсодержащего дуплекса) в течение 15−30 мин при 0 °C. Затем добавляли 1%-ный раствор ДСН (конечная концентрация в растворе 0,1%) и выдерживали их при 95 °C в течение 5 мин для разрушения нековалентных комплексов. Реакционные смеси упаривали на БрееёУас, добавляли к образцам по 5−12 мкл раствора краски для белкового электрофореза и анализировали их методом гель-электрофореза (см. выше). После этого проводили авторадиографию. Выходы продуктов ковалентного присоединения, рассчитывали как отношение радиоактивности ковалентного конъюгата к суммарной радиоактивности ковалентного конъюгата и ДНК.

3.3.5. Картирование конъюгатов М. ЕсоКП с модифицированными ДНК-дуплексами химическими реагентами Расщепление конъюгатов М. ЕсоЯН—ДНК с помощью ВМРБ-скатола: Для проведения частичного расщепления ВЫРБ-скатолом лиофилизованные конъюгаты М. ЕсоШ1 с модифицированными цепями дуплексов 2 и-5 растворяли в 15 мкл 1%-ного раствора ДСН. Добавляли 35 мкл 100 мг/мл раствора ВКРБ-скатола и инкубировали реакционную смесь в течение 2 час при 37 °C. Останавливали реакцию, добавляя 5 мкл 2-меркаптоэтанола. Расщепление конъюгатов М. ЕсоЯН — ДНК с помощью ВгСЫ: Для проведения исчерпывающего расщепления ВгСЫ лиофилизованные конъюгаты М. ЕсоЯН с ¦ модифицированными цепями-ДНК-дуплексов 2, 5,-6 и 7 растворяли в 70 мкл муравьиной кислоты и добавляли 30 мкл 1 М раствора ВгСЫ в воде. Реакционную смесь инкубировали в течение 48 час при 25 °C и в течение этого времени добавляли еще 5 мкл 12 М ВгСЫ. Затем реакционную смесь разбавляли двухкратным объемом воды и упаривали на БрееёУас, добавляли 2 раза по 100 мкл воды и упаривали раствор. Анализ продуктов расщепления ковалентных конъюгатов М. ЕсоИ1 с модифицированными цепями ДНК-дуплексов 2, 5, б и 7 химическими реагентами проводили с помощью гель-электрофореза в 12% ДСН-ПААГ, содержащем 4 М мочевину см. выше). Гель прокрашивали Кумасси R-250, затем проводили авторадиографию. Продукты расщепления идентифицировали, сравнивая с теоретическими массами олигонуклеотидопептидов, которые были вычислены как суммы масс олигонуклеотида и соответствующего пептида, и массами белковых маркеров молекулярного веса.

3.3.6. Моделирование M. EcoRII по гомологии.

Для построения модели M. EcoRII использовали метод «Frankenshtein's monster» [98]. Был проведен анализ аминокислотной последовательности M. EcoRII с помощью сервера GeneSilico Metaserver http://www.genesilico.pl/meta [103], используя программы для распознавания упаковки белка: PDB-BLAST, FFAS-03 [104], FUGUE 2.0 [105], SAM-T02 [106], MGENETHREADER [107] и 3DPSSM [108] и предсказания вторичной структуры: PSI-PRED [109], SAM-T02 [106], PROF [110], PSSP [1 И] и SSPRO [112]. Наилучшими шаблонами для моделирования M. EcoRII были признаны структуры M. Hhal и M.HaelII. Были выбраны структуры, соответствующие PDB кодам 3mht [27] и ldct [37]. При моделировании M. EcoRII не учитывали 82 аминокислоты с N-конца, ответственных за регуляторную функцию. На основании парных выравниваний аминокислотной последовательности M. EcoRII с аминокислотными последовательностями M. Hhal и М. НаеШ, полученных с помощью различных программ, были построены предварительные модели M.EcoRII. Было проведено выравнивание всех предварительных моделей по третичным структурам путем совмещения их по полипептидному остову, используя программу Swiss-PdbViewer 3.7. Из фрагментов предварительных моделей создана гибридная модель. Принимали во внимание идентичность выравнивания по аминокислотной последовательности (локальное сходство между моделями). В тех районах, где наблюдались сильные различия в выравнивании по аминокислотной последовательности, выбирали фрагменты с наименьшими весами, рассчитанными с помощью метода MetaMQAP (https://genesilico.pl/toolkit/mqap). Гибридная модель M. EcoRII была наложена на структуры шаблонов, M. Hhal и М.НаеШ. Результат выравнивания аминокислотных последовательностей M. EcoRII и двух структурных шаблонов был использован для построения новой модели в двух версиях — с помощью пакетов программ MODELLER [113] и SWISS-MODEL [114]. Качество двух версий структурной модели M. EcoRII оценивали с помощью метода MetaMQAP. Чтобы улучшить качество модели M. EcoRII, изменяли выравнивание аминокислотных последовательностей M. EcoRII, M. Hhal и М. НаеШ в тех районах, которые характеризовались неудовлетворительными MetaMQАР-весами. Результат полученного выравнивания использовали для построения новой модели в двух версиях (с помощью MODELLER и SWISS-MODEL). Чтобы избежать наложения эффектов от изменения положения разных частей белка, за один раз изменялось выравнивание только в одном районе белка. На этом этапе для оценки достоверности модели принимали во внимание дополнительную информацию о предполагаемой вторичной структуре моделируемого белка и положении аминокислотных «вставок» и «пропусков» в петлях. Улучшенную модель также оценивали с помощью MetaMQAP и всю процедуру (изменение выравнивания в проблемных районах, построение новых моделей с помощью MODELLER и SWISS-MODEL и их оценка с помощью MetaMQAP) повторяли до тех пор, пока почти все районы белка не стали характеризоваться удовлетворительными MetaMQ АР-весами. Таким образом, в процессе построения модели M. EcoRII выравнивание аминокислотных последовательностей M. EcoRII, M. Hhal и М. НаеШ изменяли несколько раз. Результат каждого из выравниваний использовали для построения промежуточных моделей M.EcoRII. На последнем этапе две версии модели M. EcoRII были совмещены в программе Swiss-PdbViewer 3.7, и из фрагментов с лучшими MetaMQ АР-весами построена гибридная модель M.EcoRII.

3.3.7. Моделирование M. SssI по гомологии.

Для построения модели M. SssI также использовали метод «Frankenshtein's monster». Основная процедура моделирования была такая же, как в случае моделирования M. EcoRII, за исключением того, что для оценки качества промежуточных моделей и конечной модели M. SssI был использован метод Verify3D [101]. Наилучшими шаблонами для моделирования M. SssI были признаны структуры M. Hhal [27] и М. НаеШ [37]. Были выбраны структуры, соответствующие PDB кодам 3mht и ldct. M. SssI длиннее M. Hhal и М. НаеШ, благодаря присутствию вставки Lys65-Lysll0, отсутствующей в шаблонных белках. При моделировании данный район не учитывался.

3.3.8. Оценка стереохимии моделей M. EcoRII и M.SssI.

Стереохимия моделей M. EcoRII и M. SssI была проверена с помощью программы PROCHECK [99]. Было проведено сравнение параметров основной и боковых цепей M. EcoRII и M. SssI в моделях с параметрами основной и боковых цепей, соответственно, известных структур из банка данных PDB, определенных с разрешением 1,5 А.

3.3.9. Моделирование комплекса M. EcoRII (M.SssI) с ДНК и AdoHcy.

ДНК и AdoHcy были вставлены в модель M. EcoRII (M.SssI) из комплекса M. Hhal с ДНК-дуплексом 5' -TGATAGCGCTATC/3' -ACTATCGCGATAG и AdoHcy после совмещения ферментов M. EcoRII (M.SssI) и M. Hhal по полипептидному остову в программе Swiss-PdbViewer 3.7. При моделировании ДНК-дуплекса, содержащего участок узнавания M. EcoRII (M.SssI), гетероциклические основания, принадлежащие ДНК-дуплексу, содержащему участок узнавания M. Hhal, постепенно меняли на желаемые, после чего следовала оптимизация стереохимии. На первом этапе оптимизировали геометрию ДНК методом молекулярной динамики в программе HyperChem 7.0 (силовое поле Amber99). При этом молекулы фермента, AdoHcy и воды оставались неподвижны. На втором этапе проводили оптимизацию геометрии всего комплекса M. EcoRII-ДНК-AdoHcy (M.SssI-ДНК-AdoHcy) минимизацией энергии в программе SCULPT 3.0 [115]. На этом этапе в процессе оптимизации все молекулы (ДНК, фермент, AdoHcy и молекулы воды) имели возможность перемещаться.

Показать весь текст

Список литературы

  1. А. 2002. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem. 3, 274−293.
  2. E.C., Хорошаев A.B. 2003. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. Молекуляр. биология. 37, 1−15.
  3. M.G., Bestor Т.Н. 2005. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu. Rev. Biochem. 74,481−514.
  4. G.G. 1991. Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res. 19, 2539−2566.
  5. J. 1993. On the origins, structures and functions of restriction-modification enzymes. Genet. Eng. (NY). 15, 57−108.
  6. Szyf M., Gruenbaum Y., Urieli-Shoval S., Razin A. 1982. Studies on the biological role of DNA methylation: V. The pattern of E. coli DNA methylation. Nucleic Acids Res. 10, 724 759.
  7. A.B., Киселева Н. П. 2001. Метилирование и канцерогенез. Биохимия. 66, 293−317.
  8. Newell-Price J., Clark A.J., King P. 2000. DNA methylation and silencing of gene expression. Trends Endokrinol. Metab. 11, 142−148.
  9. S.B., Herman J.G. 2000. DNA hypermethylation in tumorogenesis: epigenetics joins genetics. Trends Genet. 16, 168−174.
  10. J., Bhagwat A.S., Posfai G., Roberts R.J. 1989. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res. 17, 2421−2435.
  11. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. 1994. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res. 22, 1−10.
  12. R.M., Clarke S. 1994. Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse S-adenosylmethyonine-dependent methyltransferases suggests a common structure for these enzymes. Arch. Biochem. Biophys. 310, 417−427.
  13. H.O., Annau T.M., Chandrasegaran S. 1990. Finding sequence motifs in groups of functionally related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 826−830.
  14. X. 1995. DNA modification by methyltransferases. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 4−10.
  15. X., Roberts R.J. 2001. AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Res. 29, 3784−3795.
  16. S., Nelson J.L., Roberts R.J. 1991. The sequence specificity domain of cytosine-C5 methylases. Nucleic Acids Res. 19, 6183−6190.
  17. Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C., Nikolskaya I.I. 1995. The &oII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis. Gene. 157, 93−96.
  18. J., Yebra M.J., Bhagwat A.S. 1994. DsaV methyltransferase and its isoschizomers contain a conserved segment that is similar to the segment in Hhal methyltransferase that is in contact with DNA bases. Nucleic Acids Res. 22, 4482−4488.
  19. G., Dong A., Weinhold E., Cheng X., Klimasauskas S. 2000. Functional roles of -the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. J. Biol. Chem. 275, 38 722−38 730.
  20. Wu J.C., Santi D.V. 1987. Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase. J. Biol. Chem. 262,4778−4786.
  21. Chen, L. MacMillan A.M., Verdine G.L. 1993. Mutational separation of DNA binding from catalysis in a DNA cytosine methyltransferase J. Am. Chem. Soc. 115, 5318−5319.
  22. Lau E.Y., Bruice T.C. 1999. Active site dynamics of the Hhal methyltransferase: insights from computer simulation. J. Mol. Biol. 293, 9−18.
  23. Osterman D.G., DePillis G.D., Wu J.C. Matsuda A., Santi D.V. 1988. 5-Fluorocytosine in DNA is a mechanism-based inhibitor of Hhal methylase. Biochemistry. 27, 5204−5210.
  24. Cheng- X., Kumar, S., Posfai, J., Pflugrath, J.W., Roberts, RJ. 1993. Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. Cell. 74, 299 307.
  25. O’Gara, M., Zhang, X., Roberts, R.J., Cheng, X. 1999. Structure of a binary complex of Hhal methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine formed in the presence of a short non. specific DNA oligonucleotide. J. Mol. Biol. 287, 201−209.
  26. O’Gara, M., Klimasauskas, S., Roberts, R.J., Cheng, X. 1996. Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes. J. Mol. Biol. 261, 634−645.
  27. O’Gara, M., Roberts, R.J., Cheng, X. 1996. Astructural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. J. Mol. Biol. 263, 597−606.
  28. Shieh F-K., Youngblood B., Reich N.O. 2006. The role of Argl65 towards base flipping, base stabilization and catalysis in M.Hhal. J. Mol. Biol. 362, 516−527.
  29. O’Gara, M., Horton, J.R., Roberts, R.J., Cheng, X. 1998. Structures of Hhal methyltransferase complexed with substrates containing mismatches at the target base. Nat. Struct. Biol. 5, 872−877.
  30. S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X. 1994. Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell. 76, 357−369.
  31. Kumar, S., Horton, J.R., Jones, G.D., Walker, R.T., Roberts, R.J., Cheng, X. 1997. DNA containing 4'-thio-2'-deoxycytidine inhibits methylation by Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res. 25, 2773−2783.
  32. Sheikhnejad, G., Brank, A., Christman, J.K., Goddard, A., Alvarez, E., Ford Jr.,
  33. H., Marquez, V.E., Marasco, C.J., Sufrin, J.R., O’Gara, M., Cheng, X. 1999. Mechanism of inhibition of DNA (cytosine C5)-methyltransferases by oligodeoxyribonucleotides containing 5,6-dihydro-5-azacytosine. J. Mol. Biol. 285, 2021−2034.
  34. Neely, R.K., Daujotyte, D., Grazulis, S., Magennis, S.W., Dryden, D.T., Klimasauskas, S., Jones, A.C. 2005. Time-resolved fluorescence of 2-aminopurine as a probe of base flipping in M. Hhal-DNA complexes. Nucleic Acids Res. 33, 6953−6960.
  35. Zhou, L., Cheng, X., Connolly, B.A., Dickman, M.J., Hurd, P.J., Hornby, D.P. 2002. Zebularine: A novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. J. Mol. Biol. 321, 591−599.
  36. K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb W.N. 1995. The crystal structure of Haelll methyltransferase covalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell. 82, 143−153.
  37. Jia D., Jurkowska R.Z., Zhang X., Jeltsch A., Cheng X. 2007. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449, 248−251.
  38. A., Yoder J.A., Zhang X., Zhou L., Bestor T.H., Cheng X. 2001. Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA. Nucleic Acid Res. 29, 439−448.
  39. M.G., Kirpekar F., Maggert K.A., Yoder J.A., Hsieh C.L., Zhang X., Golic K.G., Jacobsen S.E., Bestor T.H. 2006. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science. 311, 395−398.
  40. Shieh F-K., Reich N.O. 2007. AdoMet-dependent methyl-transfer: Glul 19 is essential for DNA C5-cytosine methyltransferase M.Hhal. J. Mol. Biol. 373, 1157−1168.
  41. B., Shieh F.K., Buller F., Bullock T., Reich N.O. 2007. S-adenosyl-L-methionine-dependent methyl transfer: observable precatalytic intermediates during DNA cytosine methylation. Biochemistry. 46, 8766−8775.
  42. Mi S., Alonso D., Roberts RJ. 1995. Functional analysis of Gln-237 mutants of Hhal methyltransferase. Nucleic Acids Res. 23, 620−627.
  43. D., Serva S., Vilkaitis G., Merkiene E., Venclovas C., Klimasauskas S. 2004. Hhal DNA methyltransferase uses the protruding Gln237 for active flipping of its target cytosine. Structure. 12, 1047−1055.
  44. R.A., Lipson R., Hopkins В., Reich N. 2004. The coupling of tight DNA binding and base flipping. J. Biol. Chem. 279, 31 419−31 428.
  45. J.M. 2000. Homology modelling of the DNA 5mC methyltransferase M.BssHII. Is permutation of functional subdomains common to all subfamilies of DNA methyltransferases? Int. J. Biol. Macromol. 27, 195−204. '5
  46. Karyagina A.S., Alexeevski A.V., Golovin A.V., Spirin S.A., Vorob’eva O.V., Kubareva E.A. 2003. Computer modeling of complex of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs. Biophysics. 48, Suppl. l, 45−55.
  47. S.G., Samudzi C.T. 1997. Structural studies of? coRII methylase: exploring similarities among methylases. Protein Eng. 10, 1385−1393.
  48. O.M., Khoroshaev A.V., Gerasimov D.N., Baskunov V.B., Shchyolkina A.K., Gromova E.S. 2004. 2-Pyrimidinone as a probe for studying the EcoRII DNA methyltransferase-substrate interaction. Eur J Biochem. 271, 2391−2399.
  49. E.B., Бревнов М. Г., Субач O.M., Речкоблит O.A., Буйницкий Я. М., Громова Е. С. 2007. Зондирование контактов ДНК-метилтрансферазы EcoRII с ДНК с помощью аналогов субстрата и молекулярного моделирования. Молекуляр. биология. 41, 885 899.
  50. Nur I., Szyf M., Razin A., Glaser G., Rottem S., Razin S. 1985. Procaryotic and eukaryotic traits of DNA methylation in Spiroplasmas (Mycoplasmas). J. Bacteriol. 164, 19−24.
  51. S., Roberts R.J. 2000. Hybrid mouse-prokaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases retain the specificity of the parental C-terminal domain. EMBO J. 19, 2103−2114.
  52. M.B., Кирсанова O.B., Друца B.JT., Кочетков С. Н., Громова Е. С. 2006. Выделение и сайт-направленный мутагенез ДНК-метилтрансферазы Sssl. Молекуляр. биология. 40, 1−10.
  53. P., Razin А. 1992. Mode of action of the Spiroplasma CpG methylase M.SssI. FEBS Lett. 313, 243−247.
  54. K., Silke J., Gramatikoff K., Schaffner W. 1994. The CpG-specific methylase Sssl has topoisomerase activity in the presence of Mg2+. Nucleic Acid Res. 22, 5354−5359.
  55. P., Razin A. 1995. Interaction of M. SssI and M. Hhal with single-base mismatched oligodeoxynucleotide duplexes. Gene. 157, 177−179.
  56. P., Razin A. 1995. Footprint analysis of M. SssI and M. Hhal methyltransferases reveals extensive interactions with the substrate DNA backbone. J. Mol. Biol. 248, 19−26.
  57. G., Ottl J., Heidecker M., Gabriel D. 1998. Light-directed activation of protein activity from caged protein conjugates. Methods Enzymol. 291, 95−116.
  58. Rathert P., Rasko T., Roth M., Slaska-Kiss K., Pingoud A., Kiss A., Jeltsch A. 2007. Reversible inactivation of the CG specific Sssl DNA (cytosine-C5)-methyltransferase with a photocleavable protecting group. Chembiochem. 8, 202−207.
  59. S., Sheluho D., Bhagwat A.S. 1995. Cytosine methyltransferase from Escherichia coli in which active site cysteine is replaced with serine is partially active. Biochemistry. 34, 8914−8923.
  60. Reither S., Li F., Gowher H., Jeltsch A. 2003. Catalytic mechanism of DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases revisited: covalent intermediate formation is not essential for methyl group transfer by the murine Dnmt3a enzyme. J. Mol.Biol. 329, 675−84.
  61. Ya., Shevchuk T. 2005. The use of prokaryotic DNA methyltransferases as experimental and analytical tools in modern biology. Analyt. Biochem. 338, 1−11.
  62. S.J., Harrison J., Paul C.L., Frommer M. 1994. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acid Res. 22, 2990−2997.
  63. Kladde M.P., Xu M., Simpson R.T. 1996. Direct study of DNA-protein interactions in repressed and active chromatine in living cells. EMBO J. 15, 6290−6300.
  64. M.P., Simpson R.T. 1996. Chromatin structure mapping in vivo using methyltransferases. Methods Enzymol. 274, 214−233.
  65. O., Rountree M.R., Bachman K.E., Jair K.W., Baylin S.B., Herman J.G. 2007. Enzymatic regional methylation assay: a novel method to quantify regional CpG methylation density. Genome Res. 12, 153−157.
  66. Xu G.L., Bestor T.N. 1997. Cytosine methylation targetted to predetermined sequences. Nat. Genet. 17, 376−378.
  67. C.D., Parr R.D., Kladde M.P. 2003. Site-selective in vivo targeting of cytosine-5 DNA methylation by zinc-finger proteins. Nucleic Acid Res. 31, 6493−6501.
  68. V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1995. Studies on the function of conserved sequence motifs in the T4 Dam-N6-adenine] and EcoRII [C5-cytosine] DNA methyltransferases. Gene. 157, 125−126.
  69. Friedman S., Som S., Yang L.F. 1991. The core element of the? coRII methylase as defined by protease digestion and deletion analysis. Nucleic Acid Res. 19, 5403−5408.
  70. С.Ю., Косых В. Г., Холодков О. А., Бурьянов Я.И.* 1990. УФ- и КД-спектры рестрикционной эндонуклеазы? coRII и ДНК-метилазы ?coRII. Биоорг. химия. 16, 47−51.
  71. Venyaminov S.Y., GogiaZ.V. 1982. Optical characteristics of all individual proteins from the small subunit of Escherichia coli ribosomes. Eur. J. Biochem. 126, 299−309.
  72. Som S., Friedman S. 1990. Direct photolabeling of the EcoRII methyltransferase with S-adenosyl-L-methionine. J. Biol. Chem. 266, 2937−2945.
  73. D.V., Garrett C.E., Barr P.J. 1983. On the mechanism of inhibition of DNA-cytosine methyltransferases by cytosine analogs. Cell. 33, 9−10.
  74. S., Bhagwat A.S. 1995. The mechanism of inhibition of DNA (cytosine-5-)-methyltransferases by 5-azacytosine is likely to involve methyl transfer to the inhibitor. Biochem J. 307, 87−92.
  75. Zhou L., ChengX., Connolly B.A., Dickman M.J., Hurd P.J., Hornby D.P. 2002. Zebularine: a novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. J. Mol. Biol. 321, 591−599.
  76. S., Ansari N. 1992. Binding of the EcoRII methyltransferase to 5-fluorocytosine-containing DNA. Isolation of a bound peptide. Nucleic Acid Res. 20, 3241−3248.
  77. M.W., Gabbara S., Bhagwat A.S. 1992. Substitutions of a cysteine conserved among DNA cytosine methylases result in a variety of phenotypes. Nucleic Acid Res. 20,319−326.
  78. V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1995. Function of Pro-185 in the ProCys of conserved motif IV in the EcoRII cytosine-C5]-DNA methyltransferase. FEBS Lett. 370, 7577.
  79. A., Posfai G., Zsurka G., Rasko T., Venetianer P. 2001. Role of DNA minor groove interactions in substrate recognition by the M. SinI and M. EcoRII DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res. 29, 3188−3194.
  80. Som S., Friedman S. 1993. Autogenous regulation of the? coRII methylase gene at the transcriptional level: effect of 5-azacytidine. EMBO J. 12, 4297−303.
  81. Som S., Friedman S. 1994. Regulation of. EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. Nucleic Acid Res. 22, 5347−5353. 50].
  82. T.V., Buryanov Ya.I. 1999. DNA methyltransferase-based assayfor the cytosine methylation level in the DNA sequence CCWGG. Russian J. Bioorg. Chem. 25, 630−633.
  83. E.U. 1990. Premeiotic instability of repeated sequences inNeurospora crassa. Annu. Rev. Genet. 24, 579−613.
  84. J.M., Shen J.C., Yang A.S., Rapoport H., Jones P.A. 1996. Methylation inhibitors can increase the rate of cytosine deamination by (cytosine-5)-DNA methyltransferase. Nucleic Acid Res. 24, 3267−3275.
  85. A.N., Weinhold E., Bhagwat A.S. 2000. Reviving a dead enzyme: cytosine deaminations promoted by an inactive DNA methyltransferase and an S-adenosylmethionine analogue. Biochemistry. 39, 14 611−14 616.
  86. C.L., Meisenheimer P.L., Koch Т.Н. 1996. Mechanistic studies of the 5-iodouracil chromophore relevant to its use in nucleoprotein photo-cross-linking. J. Am. Chem. Soc. 118, 5796−5803.
  87. K.M., Koch Т.Н. 1997. Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 32, 101−140.
  88. Г. А., Сумбатян H.B., Топин A.H., Мчедлидзе М. Т. 2000. Фотоактивируемые реагенты на основе арил (трифторметил)дназиринов: синтез и использование для изучения нуклеиново-белковых взаимодействий. Молекулярн. биология. 34, 966−983.
  89. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. 1993. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst. 26, 283 291.
  90. Morris A.L., MacArthur M.W., Hutchinson E.G., Thornton J.M. 1992. Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins. 12, 345−364.
  91. R., Bowie J.U., Eisenberg D. 1992. Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature. 356, 83−85.
  92. M.A., Bujnicki J.M. 2003. GeneSilico protein structure prediction meta-server. Nucleic Acids Res. 31, 3305−3307.
  93. Rychlewski L., Jaroszewski L., Li W., Godzik A. 2000. Comparison of sequence profiles. Strategies for structural predictions using sequence information. Protein Sci. 9, 232−241.
  94. Shi J., Blundell T.L., Mizuguchi K. 2001. Fugue: sequence-structure homology recognition using environment-specific substitution tables and structure-dependent gap penalties. J. Mol. Biol. 310, 243−257.
  95. Karplus K., Karchin R., Barrett C., Tu S., Cline M., Diekhans M., Grate L., Casper J., Hughey R. 2001. What is the value added by human intervention in protein structure prediction? Proteins. 45, 86−91.
  96. D.T. 1999. GenTHREADER: an efficient and reliable protein fold recognition method for genomic sequences. J. Mol. Biol. 287, 797−815.
  97. Kelley L.A., McCallum C.M., Sternberg M. J. 2000. Enhanced genome annotation using structural profiles in the program 3D-PSSM. J. Mol. Biol. 299, 501−522.
  98. D.T. 1999. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. J. Mol. Biol. 292, 195−202.
  99. M., King R.D. 2000. Cascaded multiple classifiers for secondary structure prediction. Protein Sci. 9, 1162−1176.
  100. Raghava G.P.S. 2000. Protein secondary structure prediction using nearest neighbor and neural network approach. CASP4. 75−76.
  101. G., Przybylski D., Rost B., Baldi P. 2002. Improving the prediction of protein secondary structure in three and eight classes using recurrent neural networks and profiles. Proteins. 47, 228−235.
  102. A., Blundell T.L. 1993. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J. Mol. Biol. 234, 779−815.
  103. N., Peitsch M.C. 1997. SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling. Electrophoresis. 18, 2714−2723.
  104. Surles M.C., Richardson J.S., Richardson D.C., Brooks F.P. Jr. 1994. Sculpting proteins interactively: continual energy minimization embedded in a graphical modeling system. Protein Sci. 3, 198−210.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!