Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Идентификация и изучение генов Escherichia coli, участвующих в экскреции гомосерина и треонина

Диссертация: Идентификация и изучение генов Escherichia coli, участвующих в экскреции гомосерина и треонина
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

При получении аминокислот микробиологическим синтезом штаммы-продуценты необходимо культивировать в условиях, обеспечивающих максимальное накопление продукта. При этом у эффективных продуцентов концентрация целевого продукта в культуральной жидкости достигает очень больших величин. Например, при культивировании штамма Е. coli — продуцента треонина концентрация аминокислоты к концу ферментации… Читать ещё >

Идентификация и изучение генов Escherichia coli, участвующих в экскреции гомосерина и треонина (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. Цитоплазматическая мембрана бактерий и мембранные белки
      • 1. 1. Функции и строение цитоплазматической мембраны
      • 1. 2. Пространственная структура мембранных белков
        • 1. 2. 1. Гидрофобно-гидрофильный профиль белка
        • 1. 2. 2. Поиск трансмембранных сегментов в аминокислотной 10 последовательности белков
    • 2. Транспорт аминокислот в клетки бактерий 11 2.1. «Простая» диффузия 12 2.2 Вторичный транспорт аминокислот
      • 2. 3. Первичный транспорт
        • 2. 3. 1. Связывающие белки
        • 2. 3. 2. Пермеазы
        • 2. 3. 3. Белки, осуществляющие гидролиз АТФ
      • 2. 4. Использование бактериями различных систем, для транспорта одной и той 17 же аминокислоты
    • 3. Выведение ингибиторов и других веществ из клетки (экскреция)
      • 3. 1. Удаление ингибитора
        • 3. 1. 1. Множественная лекарственная устойчивость
        • 3. 1. 2. Tet оперон
        • 3. 1. 3. Mar-регул он
        • 3. 1. 4. Асг оперон
        • 3. 1. 5. Экскреция ионов тяжелых металлов
      • 3. 2. Удаление эффектора
        • 3. 2. 1. Механизмы экскреции аминокислот из клеток бактерий
        • 3. 2. 2. Экскреция изолейцина и треонина у С. glutamicum
        • 3. 2. 3. Экскреция лизина у С. glutamicum
        • 3. 2. 4. Экскреция аминокислот у E. col
        • 3. 2. 5. Другие примеры экскреции продуктов метаболизма
    • 4. Анализ аминокислотной и нуклеотидной последовательностей
      • 4. 1. Поиск гомологичных последовательностей
      • 4. 2. Выравнивание последовательностей белков
    • 5. Регуляция генной экспрессии
      • 5. 1. Регуляция экспрессии генов при вступлении в стационарную фазу роста
  • Часть II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды и среды
    • 2. Методы и ферменты, использованные при работе с ДНК
      • 2. 1. Трансформация, конъюгационные скрещивания, трансдукция, 48 гибридизация, секвенирование и ПЦР
    • 3. Экспрессия генов под контролем промотора фага Т7. Электрофорез белка в 49 полиакриламидном геле
    • 4. Определение минимальных ингибирующих рост штаммов концентраций 49 аминокислот, их аналогов
    • 5. Определение внутриклеточных пулов гомосерина и треонина
    • 6. Определение кинетики экскреции аминокислот из клеток
    • 7. Ферментации 50 7.1 Определение концентрации аминокислот в культуральной жидкости
    • 8. Определение активности р-галактозидазы
    • 9. Методы работы с РНК 51 9.1 Выделение, определение концентрации и оценка чистоты препаратов РНК
      • 9. 2. Гель-электорфорез РНК в гелях, содержащих формальдегид, перенос на 52 нитроцеллюлозный фильтр, РНК-ДНК гибридизация
    • 10. Использованные в работе компьютерные программы
  • Часть III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 1. Клонирование и идентификация новых генов, сообщающих клеткам Е. coli 54 устойчивость к ингибирующим концентрациям гомосерина и треонина
      • 1. 1. Клонирование in vivo фрагментов хромосомы Е. coli, сообщающих 55 устойчивость к ингибирующим концентрациям гомосерина
      • 1. 2. Определение локализации генов, сообщающих устойчивость к 56 ингибирующим концентрациям гомосерина и треонина, на хромосоме Е. col
      • 1. 3. Идентификация гена rhtB, сообщающего устойчивость к ингибирующим 57 концентрациям гомосерина
      • 1. 4. Идентификация гена rhtC, сообщающего устойчивость к ингибирующим концентрациям треонина
    • 2. Белки RhtB и RhtC
      • 2. 1. Анализ белков RhtB и RhtC по предсказанной аминокислотной 61 последовательности
      • 2. 2. Визуализация белка RhtC
    • 3. Выявление семейства белков- гомологов RhtB и RhtC
      • 3. 1. Поиск гомологов белков RhtC и RhtB по базам данных секвенированных 65 геномов
      • 3. 2. Исправление рамок считывания белков — гомологов RhtB
      • 3. 3. Трансмембранные сегменты в семействе
      • 3. 4. Построение филогенетических деревьев
    • 4. Изучение фенотипических свойств генов rhtB и rhtC
      • 4. 1. Инактивация генов rhtB и rhtC на хромосоме E. col
        • 4. 1. 1. Инактивация гена rhtB на хромосоме E. col
        • 4. 1. 2. Инактивация гена rhtC на хромосоме Е. col
      • 4. 2. Влияние аллельного состояния генов rhtB и rhtC на устойчивость клеток Е. 85 coli к высоким концентрациям аминокислот и их аналогов
      • 4. 3. Влияние амплификации гена rhtB на кинетику экскреции гомосерина
      • 4. 4. Влияние аллельного состояния генов rhtB и rhtC на продукцию и 90 внутриклеточные пулы аминокислот
        • 4. 4. 1. Влияние аллельного состояния гена rhtB на продукцию гомосерина
        • 4. 4. 2. Влияние аллельного состояния гена rhtB на внутриклеточную 91 концентрацию гомосерина
        • 4. 4. 3. Влияние амплификации гена rhtC на продукцию и внутриклеточную 92 концентрацию L-треонина
        • 4. 4. 4. Влияние аллельного состояния генов rhtB и rhtC на накопление 94 некоторых других аминокислот
    • 5. Теоретическое изучение регуляции генов rhtB и rhtC
      • 5. 1. Поиск сайтов связывания известных регуляторов транскрипции
        • 5. 1. 1. Характеристика найденного сайта связывания gs субъединицы РНК 97 полимеразы
        • 5. 1. 2. Характеристика найденного сайта связывания Lrp регулятора
      • 5. 2. Поиск сайтов связывания оригинального (гипотетического) регулятора 104 транскрипции выявленного семейства генов
        • 5. 2. 1. Выделение регуляторных сигналов
        • 5. 2. 2. Методика поиска сайтов связывания оригинального 108 транскрипционного регулятора
        • 5. 2. 3. Выявление сайта связывания оригинального транскрипционного 109 регулятора по выравниванию регуляторных областей групп генов — членов семейства
        • 5. 2. 4. Выделение возможного сайта связывания транскрипционного 113 регулятора для ортологов гена rhtB
        • 5. 2. 5. Выделение возможного сайта связывания транскрипционного 115 регулятора для ортологов гена rhtC
        • 5. 2. 6. Выделение возможного сайта связывания транскрипционного 116 регулятора для ортологов генов rhtB и rhtC
        • 5. 2. 7. Поиск сайта связывания транскрипционного регулятора в 118 регуляторной области генов паралогов rhtB в Е. col
        • 5. 2. 8. Поиск прямых и обратных тандемных повторов 120
  • Заключение по поиску сайтов связывания оригинальных регуляторов 121 транскрипции
    • 6. Предсказание механизмов регуляции некоторых генов семейства на основе 123 анализа их взаиморасположения на хромосоме
      • 6. 1. Расположение генов семейства на хромосомах различных бактерий
      • 6. 2. LysR регуляторы и возможная оперонная структура генов семейства
    • 7. Экспериментальное изучение регуляции генов rhtB и rhtC
      • 7. 1. Транскрипционная активация гена rhtB
      • 7. 2. Трансляционное слияние генов rhtB и rhtC с геном lacZ
      • 7. 3. Влияние фазы роста на экспрессию генов rhtB и rhtC
      • 7. 4. Влияние характера питательной среды на экспрессию генов rhtB и rhtC
      • 7. 5. Влияние аллельного состояния гена rpoS на экспрессию генов rhtB и rhtC
      • 7. 6. Влияние экзогенных аминокислот на экспрессию генов rhtB и rhtC
      • 7. 7. Экспрессия генов rhtB и rhtC в условиях стрессовых воздействий на клетку

Штаммы Escherichia coli широко используют для получения продуцентов различных биологически активных соединений и, в частности, аминокислот. Создание высокоактивных штаммов-продуцентов аминокислот требует детального изучения путей метаболизма и регуляторных механизмов, контролирующих клеточные процессы. В настоящее появляется все больше данных о том, что помимо регуляции ферментативных активностей на уровне белка, регуляции экспрессии генов и оперонов на уровне транскрипции и трансляции, клетка способна осуществлять экскрецию определённых соединений (например, аминокислот), и эта экскреция является дополнительным механизмом регуляции клеточных функций.

При получении аминокислот микробиологическим синтезом штаммы-продуценты необходимо культивировать в условиях, обеспечивающих максимальное накопление продукта. При этом у эффективных продуцентов концентрация целевого продукта в культуральной жидкости достигает очень больших величин. Например, при культивировании штамма Е. coli — продуцента треонина концентрация аминокислоты к концу ферментации составляет 90−100 г/л. В этих условиях может происходить подавление роста и жизнедеятельности клеток продуктами собственного метаболизма. Поэтому для достижения более высокого выхода продукта необходимо уменьшать внутриклеточную концентрацию производимых веществ. Клетка может уменьшить внутриклеточную концентрацию ингибирующего соединения несколькими способами:

1) Ускоренно метаболизировать ингибирующее соединение.

2) Активно выводить ингибирующее соединение из клетки.

Для продуцентов 1 — й способ не подходит, т.к. вещество изначально синтезируется внутри клетки. Кроме того, у продуцента максимально заблокированы возможные пути метаболизма конечного продукта искусственным путём. Остаётся путь активации выведения ингибитора из клетки. Поэтому поиск и изучение генов, ответственных за экскрецию веществ из клетки, является важной задачей, имеющей как научное, так и практическое значение. Гены, ответственные за экскрецию могут быть использованы для увеличения выхода конечного продукта или для повышения устойчивости к различным промежуточным продуктам метаболизма.

Как пример повышения продуктивности аминокислоты путем увеличения экскреции можно привести штамм С. glutamicum, у которого повышена активность гена, контролирующего экскрецию лизина, lysE [Vrljic М. et al., 1996]. Однако у бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, изучение генов, обеспечивающих экскрецию аминокислот, находится только на начальной стадии [Закатаева Н.П., 1997; Zakataeva N.P. et al., 1997; DaBler, Т. et al., 2000].

В настоящее время определены нуклеотидные последовательности всей хромосомы штамма Escherichia coli К12 [Blattner F.R. et al., 1997] и других штаммов кишечной палочки, и при этом обнаружено большое число белков, функция которых не установлена. Среди них могут быть и белки, участвующие в экскреции метаболитов.

Известно, что рост штаммов Е. coli на минимальных средах ингибируется треонином и его метаболическим предшественником гомосерином. Накапливаясь в клетках и в среде при культивировании соответствующих штаммов-продуцентов, эти соединения подавляют метаболизм и дальнейший синтез целевого продукта. Представляется вероятным, что клетки могут преодолеть это ингибирование за счет активации систем экскреции указанных аминокислот.

В связи с выше изложенным в представляемой диссертационной работе ставились следующие задачи:

Найти и идентифицировать гены, амплификация которых приводит к устойчивости к ингибирующим концентрациям треонина и гомосерина. Провести компьютерный анализ белков, кодируемых обнаруженными генами: рассчитать их молекулярную массу, гидрофобно-гидрофильный профиль, трансмембранные сегментывизуализировать их. Провести поиск белков-гомологов, построить их выравнивание, выделить консервативные области, построить филогенетическое дерево обнаруженных белков-гомологов.

Исследовать влияния амплификации и инактивации найденных генов на фенотип клетки.

Исследовать влияние амплификации и инактивации найденных генов на продукцию аминокислот штаммами-продуцентами.

С помощью компьютерных методов исследовать регуляторные области обнаруженных генов, предсказать наличие сайтов связывания как известных, так и неизвестных (оригинальных) регуляторов транскрипции. Исследовать регуляцию обнаруженных генов экспериментально.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. В районе 86 минуты генетической карты Е. coli К12 обнаружено два новых гена, rhtB и rhtC, амплификация которых сообщает клеткам устойчивость к ингибирующим концентрациям, соответственно, гомосерина и треонина.

2. Выявлено и охарактеризовано новое обширное семейство белков гомологов RhtB и RhtC из различных прокариот и архей.

3. Показано, что амплификация генов rhtB и rhtC повышает, а инактивация этих генов понижает резистентность клеток к ингибирующим концентрациям ряда аминокислот и аналогов аминокислот.

4. Показано, что белок RhtB участвует в выбросе гомосерина из клетки. При этом выброс гомосерина зависит от мембранного потенциала.

5. В регуляторных областях генов rhtB и rhtC обнаружены потенциальные сайты связывания ст sсубъединицы РНК-полимеразы и Ьгр-регулятора.

6. Исследование регуляции генов rhtB и rhtC показало, что их экспрессия:

— возрастает при переходе клеток в стационарную фазу роста;

— зависит от аллельного состояния гена rpoS, кодирующего a sсубъединицу РНК-полимеразы;

— выше на минимальной среде, чем на богатой среде;

— репрессируется в условиях осмотического и теплового шока;

— не индуцируется гомосерином и треонином.

7. Показано, что амплификация генов rhtB и rhtC повышает продукцию гомосерина, треонина и некоторых других аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами.

8.

Заключение

.

Рост штаммов Е. coli на минимальных средах ингибируется треонином и гомосерином. В настоящей работе был исследован эффект амплификации двух генов, сообщающих клеткам устойчивость к высоким концентрациям этих соединений. Амплификация фрагмента хромосомы из области 86 минуты Е. coli приводит к устойчивости к ингибирующим концентрациям гомосерина и треонина. Как выяснилось в ходе исследования, фрагмент содержит две открытые рамки считывания: /138 и о 128. В ходе молекулярно-генетических экспериментов было показано, что амплификация на многокопийном векторе открытой рамки считывания /138 с флангами сообщает клеткам устойчивость к повышенным концентрациям гомосерина, а амплификация о128 приводит к устойчивости к повышенным концентрациям треонина. Нами было проведено определение нуклеотидной последовательности открытой рамки о 128, обнаружившее ошибку в имеющихся базе данных результатах секвенирования этой области — выпадение двух нуклеотидов, которое привело к сдвигу рамки считывания. В результате исправления сбоя рамки считывания о128, был определён новый ген — rhtC, который протяжённее на 234 нуклеотида, и амплификация которого приводит к устойчивости к ингибирующим концентрациям треонина Исследование нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания /138, обнаружило отсутствие стоп-кодона со стороны 5' конца, кроме того, одному из ATG кодонов в этой последовательности предшествует предсказанный рибосом-связывающий сайт (62 171−62 166 нуклеотиды в М87 049). В результате был определён новый ген rhtB, который протяжённее /138 на 201 нуклеотид, и амплификация которого приводит к устойчивости к повышенным концентрациям гомосерина.

Гены rhtB и rhtC кодируют гомологичные, имеющие сходные гидрофобно-гидрофильные профили белки RhtB и RhtC, состоящие из 206 аминокислотных остатков и имеющие рассчитанную молекулярную массу -22.4 кДа. Большое количество гидрофобных аминокислотных остатков в их составе и наличие 6 трансмембранных сегментов свидетельствует об их мембранной локализации. В результате поиска по базам данных завершённых и незавершённых геномов было обнаружено более 100 белков-гомологов RhtB и RhtC из 42 различных прокариот и архей. В результате исследования гомологии между найденными белками было обнаружено, что все они имеют три высококонсервативных, находящихся на равном расстоянии между собой и от начала белков аминокислотных мотива. Кроме того, все белки имеют по 6 предсказанных по методу Клейна и соавт. трансмембранных сегмента и сходные гидрофобно-гидрофильные профили, лежащие в области положительных значений, что говорит о высокой гидрофобности и позволяет предполагать мембранную локализацию этих белков. Из обнаруженных белков-гомологов только один имеет известную функцию — это белок LysE, осуществляющий экскрецию лизина из клеток С. glutamicum. На основании изложенных выше данных, мы выделили найденные белки в новое семейство мембранных белков, предположительно осуществляющих экскрецию аминокислот, а также, возможно, их производных из клетки.

При изучении влияния амплификации генов rhtB и rhtC на устойчивость штаммов Е. coli к ингибирующим концентрациям аминокислот и аналогов аминокислот, было обнаружено, что амплификация гена rhtB повышает устойчивость клеток к гомосерину, гомосеринлактону, серину, треонину и аналогам аминокислот DL-P-гидроксинорвалину, 8-(2-аминоэтил)-Е-цистеину, 4-аза-ОЕ-лейцинуамплификация гена rhtC придаёт устойчивость к треонину, валину, гистидину, и к аналогу треонина DL-P-гидроксинорвалину .

С другой стороны, инактивация генов rhtB и rhtC на хромосоме Е. coli во многих случаях снижает устойчивость клеток к ингибирующим концентрациям названных соединений. А именно, инактивация гена rhtB приводит к увеличению чувствительности к L-гомосерину, L-гомосерин лактону, и аналогу треонина DL-p-гидроксинорвалину, а инактивация гена rhtC приводит к увеличению чувствительности к L-гистидину, аналогу лизина 8-(2-аминоэтил)-ь-цистеину, аналогу лейцина 4-a3a-DL-лейцину, аналогу треонина DL-гидроксинорвалину. Полученные результаты напоминают эффекты, связанные с амплификацией и инактивацией генов, контролирующих множественную лекарственную устойчивость у бактерий, которая связана с активным транспортом из клеток этих соединений.

При исследовании кинетики накопления гомосерина в среде продуцирующими клетками было установлено, что амплификация rhtB гена заметно повышает скорость накопления этого соединения. Добавление к продуцирующим клеткам протонного ионофора СССР в концентрации, не влияющей на рост культуры, приводит к полному прекращению выброса гомосерина в среду. Таким образом, выброс гомосерина, очевидно, осуществляется по механизму вторичного транспорта и зависит от энергии электрохимического градиента.

Определение клеточных пулов гомосерина и треонина показало, что амплификация генов rhtB и rhtC снижает, а их инсерционная инактивация несколько увеличивает внутриклеточное содержание названных аминокислот. Таким образом, повышенное накопление гомосерина в среде не связано с активацией его биосинтеза и накопления в клетках. Полученные данные подтверждают сделанное нами предположение о том, что гены rhtB и rhtC участвуют в транспорте гомосерина и треонина и, очевидно, кодируют белки осуществляющие экскрецию этих веществ.

Амплификация генов rhtB и rhtC в клетках штаммов продуцентов гомосерина и треонина приводит к значительному увеличению продукции этих аминокислот, в то время как инактивация этих генов на хромосоме Е. coli заметно снижает продукцию названных аминокислот. Таким образом, повышение уровня экспрессии генов rhtB и rhtC может иметь важное практическое значение.

Исследование с использованием компьютерных программ регуляторных участков генов rhtB и rhtC показало, что их экспрессия может контролироваться глобальным регулятором вступления клетки в стационарную фазу роста — о5-субъединицей РНК-полимеразы, и, возможно, глобальным регулятором Lrp. Исследование регуляторных областей различных групп генов-ортологов, генов-паралогов и совместно обеих приведённых групп не выявило у них наличия уникального сайта связывания транскрипционного регулятора. Можно утверждать с высокой степенью достоверности, что для данных групп генов, из рассмотренных микроорганизмов, не существует «собственного» регулятора транскрипции.

Экспериментальное исследование полностью подтвердило теоретический вывод об участии а5-субъединицы РНК-полимеразы в регуляции генов rhtB и rhtC. Показано, что экспрессия этих генов возрастает при переходе клеток в стационарную фазу и зависит о от аллельного состояния гена rpoS, кодирующего асубъединицу РНК-полимеразы, и выше на минимальной среде, чем на богатой. С другой стороны, она репрессируется в условиях осмотического и температурного шока, что также может быть связано с негативной в указанных условиях регуляцией ст8-субъединицсй РНК-полимеразы. Кроме того, обнаружено, что ни гомосерин, ни треонин, очевидно, не индуцируют экспрессию генов rhtB и rhtC.

Показать весь текст

Список литературы

  1. A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза. М., Ленингр. пищевая пр-ть, 1984. 394с.
  2. Н.П. Исследование плейотропной мутации устойчивости к гомосерину и треонину у Escherichia coli К-12. Дисс. канд. биол. наук. Москва. 1997.
  3. ЬСлыпина Н.С., Плакунов В. К. Роль метаболической энергии в регуляции транспорта хлортетрациклина у Escherichia coli- Микробиология. 1979. Т.48. С. 212−216
  4. Маниатис Т, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М. «Мир». 1984.
  5. , Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М. «Мир». 1976.
  6. А. А. Вычислительные методы молекулярной биологии и их применение к анализу геномов. Дисс. доктора биол. наук. Москва, 2000.
  7. С.И., Плакунов В. К. Значение структурных элементов молекул тетрациклина в устойчивости к нему бактерий. Микробиология, 1976. Т.45. С. 10 491 055
  8. В.К., Волкова Е. Н., и др., Регуляция внутриклеточной концентрации низкомолекулярных веществ у бактерий. Изв. АН СССР, Сер. Биол., 1985 а. С. 715 721.
  9. В.К., Лобырёва Л. Б. Особенности транспорта ароматических аминокислот у экстремально галофильных микроорганизмов. Микробиология, 1985 б. Т. 54. С. 386 391.
  10. В.К., Сумро А. К., Соотношение между активным и пассивным механизмами проникновения хлортетрациклина в клетки чувствительного и устойчивого штаммов микобактерий, — Антибиотики, 1977. Т.2. С. 146−149.
  11. Г. Общая микробиология. — М. Мир. 1987.
  12. Agnez-Lima L. F, Di Mascio Р, Demple В, Menck C.F. Singlet molecular oxygen triggers the soxRS regulon of Escherichia coli. Biol Chem. 2001. V. 382. P.1071−1075.
  13. Alekshun M. N, Levy S.B. Characterization of MarR superrepressor mutants. J Bacterid 1999. V. 181. P.3303−6
  14. Almiron, M., A. Link, D. Furlong, and R. Kolter. A novel DNA binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 1992. V.6. P. 26 462 654.
  15. Altschul S. F, Koonin E.V. Iterated profile searches with PSI-BLAST—a tool for discovery in protein databases. Trends Biochem Sci. 1998. V. 23 P. 444−7.
  16. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990.V.215. P. 403−410.
  17. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new g eneration of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 3389−3402.
  18. Ariza R.R., Li Z., Ringstad N., Demple B. Activation of multiple antibiotic resistance and binding of stress-inducible promoters by Escherichia coli Rob protein. J Bacteriol. 1995. V. 177. P.1655−1661.
  19. Bohringer, J., D. F ischer, G. M osier, and R. H angge-Aronis. U DP-glucose i s a p otential intracellular signal molecule in the control of expression of os and os -dependent genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 413−422.
  20. Bachmann B.J. Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12. Bacteriol. Rev. 1972. V. 36, P. 525−557.
  21. Baichwal, V., D. Liu, and G. E. Ames. The ATP-binding component of a procariotic traffic ATPase is exposed to the periplasmic (external) surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993, V. 90 P. 620−624.
  22. Bauer K, Schmid A, Boos W, Benz R, Tommassen J. Pore formation by pho-controlled outer-membrane proteins of various Enterobacteriaceae in lipid bilayers. Eur J Biochem. 1988. V. 174. P. 199−205.
  23. Bauerle R.H., Margolin P. Evidence for two sites for initiation of gene expression in the tryptophan operon of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 1967. V.26. P. 423−436.
  24. BeckC.F., MutzelR., Barbe J., Muller W. A multifunctional gene (tetR) controls TnlO-encoded tetracycline resistance. J.Bacteriol. 1982 V. 150, P. 633−642
  25. Bellmann A, Vrljic M, Patek M, Sahm H, Kramer R, Eggeling L., Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. Microbiology 2001 Jul- V. 147. P. 1765−74
  26. Broer, S., and R. Kramer. Lysine uptake and exchange in Corynebacterium glutamicum. J. Bacterid. 1990. V. 172. P. 7241−7248.
  27. Broer, S., and R. Kramer. Lysine secretion by Corynebacterium glutamicum. Identification of specific secretion carrier system. Eur. J. Biochem. 1991a. V. 202.1. P. 131−135.
  28. Broer, S ., and R. Kramer. Lysine se cretion b у Corynebacterium g lutamicum. E nergetics and mechanism of the transport system. Eur. J. Biochem. 1991b. V. 202, P. 137−143.
  29. Brink В., Otto R., Hansen U.P., Konings W. N. Energy recycling by lactate efflux in growing and nongrowing cells of Streptococcus cremoris. J. Bacteriol. 1985, V. 162. P. 383 390.
  30. Broer S, Kramer R. Lysine excretion by Corynebacterium glutamicum. 1. Identification of a specific secretion carrier system. Eur J Biochem. 1991. V. 202. P. 131−5.
  31. Burton Z.F., Gross C.A., Watanabe K.K., Burgess R.R. The operon that encodes the sigma subunit of RNA-polymerase also encodes ribosomal protein S21 and DNA polymerase in E. coli K12. Cell. 1983. V.32. P. 335−349.
  32. Celis, R. T. Mutant of Eschetichia coli K-12 with defective phosphorylation of two periplasmic transport proteins. J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 1787−1793.
  33. Chakrabarti, A. C., and D. W. Deamer. Permeability of lipid bilayers to amino acids and phosphate. Biochim. Biophis. Acta. 1992. V. 1111. P. 171−177.
  34. Chang A.C.Y., Cohen S.N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 1978. V.134. P. 1141−1156.
  35. J., Howe T .G., В. Bacteriol resistance to the tetracyclines. Microbiol, rev., 1978, V.42, P. 707−724
  36. Clement, Y., C. Escoffier, M. C. Trombe, and G. Lanelle. Is glutamate excreted by its uptake system in Corynebacterium glutamicum? A working hypothesis. J. Gen. Microbiol. 1984. V. 130. P. 2589−2594.
  37. Connamacher R. H., Mandel H. G., Hahn F.E. Adaptation of population of Bacillus cereus to tetracycline. Molecular Pharmacol., 1967, V. 3. P. 586−594.
  38. Cui Y- Wang Q- Stormo G.D.- Calvo J.M. A consensus Sequence for binding of Lrp to DNA. J Bacteriol, 1995. V. 177. P. 4872−4880.
  39. , E. С ellular 1 ocalization о f t he M alG p rotein f rom t he m altose t ransport sy stem i n Eschetichia coli K-12. Mol. Gen. Genet. V. 222. P. 33−36.
  40. DaBler, Т., Maier, Т., Winterhalter, С., and В бек A. I dentification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cysteine pathway. Mol. Microbiol. 2000. V. 36. P. 1101−1112.
  41. Demain, A. L., and J. Birnbaum. Alteration of permeability for the release of metabolites from microbial cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1968. V.46. P. 1−25.
  42. Driessen A.J. Secondary transport of amino acids by membrane vesicles derived from lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 1989. V. 56. P. 139−60.
  43. Driessen, A. J. M., K. J. Hellingwert, and W. N. Konings. Mechanism of energy coupling to entry and exit of neutral and branched chain amino acids in membrane visicles of Streptococcus cremonis. J. Biol. Chem. 1987, V. 262. P. 12 438−12 443.
  44. Dykhuizen D., Hartl D., Transport by the lactose permease of Escherichia coli as the basis of lactose killing. J. Bacteriol. 1978. V. 135. P. 876−882.
  45. Erdmann, A., B. Weil, and R. Kramer. Lysine secretion by Corynebacterium glutamicum wild type: regulation of secretion carrier activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 42. P. 604−610.
  46. Espinosa-Urgel M- Chamizo C- Tormo A. A consensus structure for sigma S-dependent promoters. Mol. Microbiol. 1996. V. 21. P. 657−659.
  47. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution. 1985. V. 39. P. 783−791.
  48. Felsenstein J. PHYLIP Phylogeny Inference Package, version 3.5. University of Washington, Seattle, 1993. (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)
  49. Fraenkel Y.M.- Mandel Y.- Friedberg D.- Margalit H. Identification of common motifs in unaligned DNA sequences: applications to Escherichia coli Lrp regulon. Comput. Appl Biosci. 1995. V. 11. P. 389−397.
  50. Gauthier M. J, Fatau G. N, Munro P. M, Clement R.L. Glutamate uptake and synthesis by Escherichia coli cells in seawater: effects on culturability loss and glycinebetaine transport. Microb Releases. 1993. V. 2. P. 53−59.
  51. George A.M. Multidrug resistance in enteric and other gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Lett. Review. 1996. V. 139. P. 1−10.
  52. Gibson T.G. Ph. D. thesis. Cambridge University. Cambridge. London. 1984.
  53. Gonzalez-Flecha В, Demple В. Genetic responses to free radicals. Homeostasis and gene control. Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 899. P. 69−87.
  54. Groisman, E. A., and M. J. Casadaban. Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. J. Bacteriol. 1986. V. 168. P. 357−364.
  55. Halpern, Y. S., H. Barash, and K. Druck. Glutamate transport in Eschetichia coli K-12: non-identity of carriers mediating entry and exit. J. Bacteriol. 1973. V. 113. P. 51−57.
  56. Haney S.A.- Platko J.V.- Oxender D.L.- Calvo J.M. Lrp, a leucine-responsive protein, regulates branched-chain amino acid transport genes in Escherichia coli. J Bacteriol. 1992. V. 174. P.108−115.
  57. Hassan M.T., van der Lelie D., Springael D., Romling U, Ahmed N, Mergeay M. Identification of a gene cluster, czr, involved in cadmium and zinc resistance in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 1999. V. 238. P. 417−25
  58. Hedstrom R.C., Grider B.R., Eagon R.C., Comparison of kinetics of active tetracycline uptake and active tetracycline efflux in sensitive and plasmid RP4-containing Pseudomonas Putida. J. Bacteriol. 1982. V. 152. P. 255−259.
  59. Hegge R. Boos W. Maltose and lactose transport in Escherichia coli. Examples of two different types of concentrative transport systems. Biochim. Biophys. Acta. 1983. V.737. P. 443−478.
  60. Hengge-Aronis, R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase regulation in E. coli. Cell. 1993. V. 72. P. 165−168.
  61. Henikoff S., Henikoff J.G. Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10 915−10 919.
  62. Hernandez-Asensio M., D el С ampo F. F. Enhancement о f a m ethylglucoside efflux b у respiration in respiratory mutant of Escherichia coli K-12. Arch. Biochem. Biophys. 1980. V. 200. P.309−318.
  63. Heuzenroeder, M. W., P. Reeves. The Tsx protein of Eschetichia coli can act as a pore for amino acids. J. Bacteriol. 1981. V. 147. P. 1113−1116.
  64. Heyne, R. I. R., W. Devrij, W. Clrielaard, and W. N. Konings. Sodium ion-dependent amino acid transport in membrane vesicles of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 791−800.
  65. Higgins, C. F. ABC Transporters: From microorganisms to man. Ann. Rev. Cell Biol. 1992. V. 8. P. 67−113.
  66. Higgins, C. F., and G. E. Ames. Two periplasmic transport proteins which interact with a common membrane receptor show extensive homology: complete nucleotide sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 6038−6042.
  67. Hoischen, С., and R. Kramer. Evidence for an efflux carrier system involved in the secretion of glutamate by Corynebacterium glutamicum. Arch. Microbiol. 1989. V. 151. P. 342−347.
  68. Huber R.E., Lytton J., Fung E.B. Efflux of b-galactosidase products from Escherichia coli. J. Bacteriol. 1980. V. 141. P. 528−533.
  69. Jishage M- Iwata A- Ueda S- Ishihama A. Regulation of RNA polymerase sigma subunit synthesis in Escherichia coli: Intracellular levels of four species of sigma subunit under various growth conditions. J Bacteriol 1996, V.178, P. 5447−5451
  70. Karasawa K, Kudo I, Kobayashi T, Sa-Eki T, Inoue K, Nojima S. Purification and characterization of lysophospholipase L2 of Escherichia coli K-12. J. Biochem. 1985. V. 98. P. 1117−25.
  71. Kerppola, R. E., and G. E. Ames. Topology of the hydrophobe membrane-bound components of the histidine periplasmic permease. Comparison with other members of the family. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 2329−2336.
  72. Kotre, A. M., S. J. Sullivan, and M. A. Savageau. Metabolic regulation by homoserine in Escherichia coli B/r. J. Bacteriol. 1973. V.116. P. 663−672.
  73. Kramer, R. Secretion of amino acids by bacteria physiology and mechanism. FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 13. P. 75−93.
  74. Kramer, R. Systems and mechanisms of amino acids uptake and excretion in prokariotes. Arch. Microbiol. 1994. V. 162. P. 1−13.
  75. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J.Mol.Biol. 1982. V.157. P.105−132.
  76. Lange R., H engge-Aronis R. Identification о f, а с entral r egulatir о f s tationary-phase gene expression in Escherichia coli. Mol.Microbiol. 1991. V. 5. P. 49−59.
  77. Li, X.-Z., Nikaido, H., and Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomanas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 1995. V. 39. P. 1948−1953.
  78. Lugtenberg, В., and L. van Alphen. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Eschetichia coli and other gram-negative bacteria. В iochim. Biophis. Acta. 1983. V.737. P. 51−115.
  79. Maloney, P. C. Bacterial transporters. Curr. Opin. Cell Biol. 1994. V. 6. P. 571−582.
  80. Marasco R- Varcamonti M- La Cara F- Ricca E- De Felice M- Sacco M. In vivo footprinting analysis of Lrp binding to the ilvIH promoter region of Escherichia coli. J Bacterid. 1994. V. 176. P.5197−5201
  81. Marger, M. D., and M. H. Saier, Jr. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport. Trends Biochem. Sci. 1994. V. 18. P. 13−20.
  82. Miller P. F, Sulavik M.C. Overlaps and parallels in the regulation of intrinsic multiple-antibiotic resistance in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 1996. V. 21. P. 441−448.
  83. Miller P.F., Gambino L.F., Sulavik M.C., Gracheck S.J. Genetic relationship between soxRS and mar loci in promoting multiple antibiotic resistance in Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 1994. V. 38. P. 1773−1779.
  84. Moir J. W, Wood N.J. Nitrate and nitrite transport in bacteria. Cell Mol. Life Sci. 2001. V. 58. P. 215−224.
  85. Nakae, T. Isolation of protein complex that produced transmemrane channels. J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 2176−2178.
  86. Nikaido H., Zgurskaya HI. AcrAB and related multidrug efflux pumps of Escherichia coli. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 3. P. 215−218.
  87. Nikaido, H., and M. Vaara. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol. Rev. 1985. V. 49. P. 1−32.
  88. Nishino K, Yamaguchi A. Analysis of a complete library of putative drug transporter genes in Escherichia coli. J Bacterid. 2001. V. 183. P. 5803−5812.
  89. Ogiwara, I. et al., SMART. Protein Sci. 1996. V. 5.
  90. Ohnuki Т., Katoh Т., Imanara Т., Aiba S. Molecular cloning of tetracycline resistance genes from Streptomyces rimosus in Streptomyces griseus and characterization of the cloned genes. J. Bacteriol. 1985. V.161. P. 1100−1116.
  91. Okusu H, Ma D, Nikaido H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J Bacteriol. 1996. V. 178. P. 306−308.
  92. Parker, В., and Marinus, M.G. A simple and rapid method to obtain substitution mutations in Escherichia coli: isolation of a dam deletion/insertion mutation. Gene. 1988. V. 73. P. 531−535.
  93. Paulsen I.T., Sliwinski M.K., Saier M.H. Microbal genome analyses: global comparison of transport capabilities based on phylogenies, bioenergetics and substrate spesificities. J. Mol. Biol. 1998. V. 277. P.573−592.
  94. Payne J.V., Smith M.V. Peptide transport by microorgansms. Adv. Microbiol. Physiol. 1994. V. 36. P. 2−80.
  95. PCR protocols. Current methods and applications. White, B.A., ed. Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993.
  96. Perri R.D., Silver S. Cadmium and manganese transport in Staphylococcus aureus membrane vesicles. J. Bacteriol. 1982. V. 150. P. 973−976.
  97. Persson В., Argos P. Prediction of transmembrane segments in proteins utilising multiple sequence alignments. J. Mol.Biol. 1994. V. 237. P. 182−192.
  98. Poolman, В., and W. N. Konings. Secondary solute transport in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1993. V.1183. P. 5−39.
  99. Price, G. P, St John, A.C. Purification and analysis of expression of the stationary phase-inducible sip lipoprotein in Escherichia coli: role of the mar system. FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 193. P. 51−56.
  100. Rancourt, D. E., I. T. Stephenson, G. A. V ickell, and J. M. Wood. P roline excretion b у Escherichia coli K-12. Biotechnol. Bioengineering. 1984. V. 24. P. 74−80.
  101. Rand J. D, Danby S. G, Greenway D. L, England R.R. Increased expression of the multidrug efflux genes acrAB occurs during slow growth of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 2002. V. 207. P. 91−95.
  102. Randall L. P, Woodward M.J. The multiple antibiotic resistance {mar) locus and its significance. Res. Vet. Sci. 2002. V. 72. P. 87−93.
  103. Raunio, R. P., and M. Leppavirta. The effect of culture age, chloramphenicol and B6 inhibitors on intra- and extracellular keto and amino acids of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 1975. V. 87. P. 141−147.
  104. Robison, K., McGuire. A comprehensive library of DNA-binding site matrices for 55 proteins applied to the complete Escherichia coli K12 genome. J. Mol. Biol. 1998. V. 284. P. 241−254.
  105. Rodionov D. A, Gelfand M. S, Mironov A. A, Rakhmaninova A.B. Comparative approach to analysis of regulation in complete genomes: multidrug resistance systems in gamma-proteobacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 3. P. 319−324.
  106. Rodriguez M. Jr, Klasson К. T, Davison В. H. Enhancement of the conversion of toluene by Pseudomonasputida F-l using organic cosolvents. Appl. Biochem. Biotechnol. 2001. SpringV. 91−93, P. 195−204.
  107. Rosenberg E.Y., Ma D., Nikaido H. AcrD of Escherichia coli is an aminoglycoside efflux pump. J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1754−1756.
  108. Rost В., Sander C. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy. J. Mol. Biol. 1993. V. 232. P. 584−599.
  109. Saier M.H. Philogenetic characterisation of novel transport protein families revealed by genome analysis. Biochem. Biophis. Acta. 1999. V. 1422. P. 1−56.
  110. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977. V. 74. P. 5463−5467.
  111. Sarsero, J. P., P. J. Wookey, P. Gollnick, C. Yanofsky, and A. J. Pittard. A new family of integral membrane proteins involved in transport of aromatic amino acids in Eschetichia coli. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 3231−3234.
  112. Saurin, W., W. Koster, and E. Dassa. Bacterial binding protein- dependent permeases: characterization of distinctive signatures for functionally related integral cytoplasmic membrane proteins. Mol. Microbiol. 1994. V. 10. P. 181−191.
  113. Schrumpf, В., L. Eggeling, and H. Sahm. Isolation and prominent characteristics of an L-lisine hyperproducing strain of Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37. P. 566−571.
  114. Shiio, I., S. Otsuka, and M. Takahashi. Effect of biotin on the bacterial formation of glutamic acid. I. Glutamate formation and cellular permeability of amino acids. J. Biochem. 1962. V. 51. P. 56−62.
  115. Silver S., Keach D. Energy depended arsenate efflux: the mechanism ofplasmid-mediated resistance. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 6114−6118 .
  116. Solovyov V.V., Zharkikh A.A., Kolchanov N.A., Ratner V.A. FEBS Lett. 1984. V.165. P. 72−78.
  117. Strimmer K, von Haeseler A. Quartet puzzling: a quartet maximum likelihood method for reconstructing tree topologies. Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. P. 964−969.
  118. Studier F.W., Moffatt B.A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 1986. V.189. P.113−130.
  119. Sturrock, S. S., and J. F. Collins. MPsch version 1.3. Biocomputing research unit. University of Edinburgh, UK. 1993.
  120. Svedberg G., Skold O., Characterization of different plasmid-borne dihydropteroate synthases mediating bacterial resistance to sulfonamides. J. Bacteriol. 1980. V. 142. P. 1−7.
  121. Tabor S. and Richardson C.C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for cotrolled exclusive expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 1074−1078.
  122. Talukder A. A- Yanai S- Nitta T- Kato A- Yamada M. RpoS-dependent regulation of genes expressed at late stationary phase in Escherichia coli. FEBS Lett. 1996. V. 386. P. 177−180.
  123. Tanaka T, Horii T, Shibayama K, Sato K, Ohsuka S, Arakawa Y, Yamaki K, Takagi K, Ohta M. RobA-induced multiple antibiotic resistance largely depends on the activation of the AcrAB efflux. Microbiol Immunol. 1997. V. 41. P. 697−702.
  124. Templeton, B. A., and M. A. Savageau. Transport of biosynthetic intermediates: homoserine and threonine uptake in Eschetichia coli. J. Bacteriol. 1974. V.117. P.1002−1009.
  125. Tershiba S., Furuya A., Mechanism of 5″ inosinic acid accumulation by permeability mutants of B. ammoniagenes. IV. Excretion mechanism of 5'-IMP. Agric. Biol. Chem. 1984. V. 48. P. 1311−1317.
  126. Tibazarwa C, Wuertz S, Mergeay M, Wyns L, van Der Lelie D. Regulation of the cnr cobalt and nickel resistance determinant of Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) CH34. J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1399−1409.
  127. Tusnady G.E., Simon I. Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: applications to topology prediction. J. Mol. Biol. 1998. V. 283. P. 489−506.
  128. Tynencra Z., GosZ., Zajaac J., Reduced cadmium transport determined by a resistance plasmid in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 1981. V. 147. P. 305−312.
  129. Urban, C., and R. T. Gelis. 1990. Purification and properties of a kinase from Eschetichia coli K-12 that phosphory lates two periplasmic transport proteins. J. Biol. Chem. V. 265. P. 1783−1786.
  130. V.Y. Bazin, P. S. Kosarev, V.N. Babenko. Institute of Cytology and Genetics. Novosibirsk, Russia. http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mRs/prograrns/oligorep/InpForm.htm
  131. Vieira, J., and J. Messing. New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene. 1991. V. 100. P. 189−194.
  132. Vrljic M, Kronemeyer W, Sahm H, Eggeling L. Unbalance of L-lysine flux in Corynebacterium glutamicum and its use for the isolation of excretion-defective mutants. J Bacteriol. 1995. V. 177. P. 4021−4027.
  133. Vrljic M., Sahm H., Eggeling L. A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum. Mol. Microbiol. 1996. V. 22. P. 815−826.
  134. Willsky G.R., Malamy M. H. Effect of arsenate on inorganic phosphate transport in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1980. V.144. P. 366−374.
  135. Wise A- Brems R- Ramakrishnan V- Villarejo M. Sequences of the -35 region of Escherichia coli r/?o5-dependent genes promote transcription by sigma S. J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 2785−2793
  136. Wood, J. M. Proline porters effect the utilization of proline as nutrient or osmoprotectant for bacteria. J. Membrane Biol. 1989. V. 106. P. 183−202.
  137. Yamada K., Kawasaki T. Properties of the thiamine transport system in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1980. V.141. P. 254−261.
  138. Yawaza K., Nakamura H., Shibamura S., Tamura Z. Properties of the biotin transport system in Bifidobacterium breve № 4. Microbiol. Immunol. 1981. V.25. P. 627−637.
  139. Yerushalmi H., Lebendiker M., Schuldiner S. Protein EmrE, an Escherichia coli 12-kDa multidrug transporter, exchanges toxic cations and H+ and is soluble in organic solvents. J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 6856−6863.
  140. Zittrich, S., and R. Kramer. Quantitative discrimination of carrier-mediated excretion of isoleucine from uptake and diffusion in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 6892−6899.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!