Данная работа является актуальной в связи с необходимостью совершенствования способов массового получения оздоровленных микроклубней картофеля с привлечением замкнутых систем биореакторов для предотвращения вторичного заражение. Для изучения этапов клубнеобразования был выбран нетрадиционный — объект исследования — культура столонов. Такой подход позволил исключить из привычной схемы получения оздоровленных микроклубней картофеля стадию «фото-трофного пробирочного растения» и индуцировать микроклубнеобразованиенепосредственно на столонах. Показанная в ходе исследования зависимость развития столонов от числа эксапантов и объема жидкой среды в культуральном сосуде выявила необходимость применения в уникальной конструкции биореактора особой системы орошения. Культура столонов омывается питательной средой, поступающей из отдельной от сосуда с эксплантами емкости, благодаря работе пневмоимпульсного насоса. Это предоставило возможность не лимитировать ее объем и получать микроклубни в 1.5−1.8 раза большего диаметра, чем при других типах культивирования. Несомненно, при получении микроклубней картофеля в пневмоимпульсном биореакторе возникают новые возможности для изучения и регулирования этапов столонои клубнеобразования. В частности, необходимы комплексные исследования с привлечением более точных методов определения качественного и количественного состава углеводов в питательных средах в период культивирования. В наших исследованиях предложено индуцировать клубнеобразование после формирования столонами двух метамеров (на 7 сутки культивирования). Анализ иерархии микроклубней и их выравненность подтверждает возможность такого подхода. Глава 5 Метод криоконсервации, перспективы применения.
В настоящее время генофонд картофеля в мире чрезвычайно разнообразен. Только в Республике Казахстан он насчитывает 1450 образцов мировой коллекции из 32 стран мира и включает образцы диких и культурных видов картофеля, межвидовых гибридов, а также отечественных и зарубежных сортов [ Айтбаев Т. Е. 2012.
с.115−123 ]. Основным держателем республиканского генофонда является Казахский научно-исследовательский институт картофелеводства и овощеводства Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан (Каз.
НИИКО) [ Красавин В. Ф., Мошняков А. Н., Шарипова Д. С., Удовицкий А. С., Федосеев В. А., Красавина В. К., Лигай Г. Л., Кулибаба В. С., Кулибаба В. А. 211 с. 54]. Прироста коллекционных образцов удалось достигнуть в основном за последние 5−7 лет, преимущественно за счет поступления из зарубежных генбанков по линии международного обмена. К сожалению, многие стародавние сорта были безвозвратно утеряны по различным причинам, в основном из-за нехватки финансовых средств на ежегодный пересев большого количества образцов и их охрану в полевых условиях. Следует учесть, что поддержание живых коллекций, которые обычно размещают в поле, не только трудоемкий процесс, но и не очень надежный, так как не исключает потери образцов вследствие неблагоприятных условий среды, болезней, вредителей, нарушения агротехники и других факторов. Такие потери не только обедняют коллекцию исходного материала, но и сводят на нет многолетний труд селекционеров, вложенный в каждый входящий в нее сорт или перспективный гибрид [Айтбаев Т.Е. 2012.
с.115−123 ]. В большинстве развитых странах мира криоконсервация широко используется для сохранения генетических ресурсов растений [Айтбаев Т.Е. 2012.
с.115−123 ]. Особенно это касается культур, размножаемых исключительно вегетативным путем, для которых невозможно сохранить генетическую идентичность материала при размножении семенами. Во многих мировых генбанках значительный объем депонируемых генетических ресурсов составляют образцы гермоплазмы картофеля. Так, в генбанке Международного центра картофеля (International Potato Center), расположенного в Перу, содержится крупнейшая в мире коллекция картофеля, представляющая 80% мировых сортов и диких видов картофеля. Этот ценный материал поддерживается несколькими способами, в том числе и в криобанке, где апексы побегов депонируют в условиях глубокого замораживания при -196°С в растворах криопротекторов на неограниченно долгий срок [DOI:
http://dx.doi.org/10.11 134/btp.
1.2013.
6 ]. Среди стран Евросоюза наиболее представительная коллекция образцов гермоплазмы картофеля находится в Германии в Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research. Более 1000 образцов картофеля хранятся в условиях глубокого замораживания при -196°С ] KryszczukA., KellerJ., GrübeM., Zimnoch-GuzowskaE. 2006/ 196−200 ]. В странах СНГ разработка методов криоконсервации растений, в том числе картофеля, активно проводится в России и Украине. В Казахстане исследования в области криоконсервации гермоплазмы растений впервые были начаты в 2002 году в Институте биологии и биотехнологии растений [DOI:
http://dx.doi.org/10.11 134/btp.
1.2013.
6] .Проводят криоконсервацию меристематических тканей в жидком азоте при температуре -196°С. Это позволит не только надежно сохранить на длительное время генофонд картофеля, но, что не менее важно, получить при последующей регенерации освобожденные от фитопатогенов растения. Как было показано в публикациях последних лет, криотерапия является новым методом оздоровления растительного материала от вирусных, микоплазменных и бактериальных инфекций [KellerE.R.J., SenulaA., LeunufnaS., GrübeM., 2006.
411−417] .Очевидно, разработка биотехнологии криоконсервации и создание криобанка гермоплазмы картофеля в Казахстане будут способствовать надежному сохранению сортового и видового разнообразия, повышению на этой основе эффективности селекционных работ, получению освобожденного от фитопатогенов суперэлитного посадочного материала, развитию семеноводства на безвирусной основе и международного обмена генетическими ресурсами.
Заключение
.
Как видно из представленных различными авторами данных, в результате многочисленных исследований, была проведена оптимизация режимов стерилизации растительного материала для получения асептических растений картофеля in vitro. Наиболее эффективна поверхностная дезинфекция клубневых ростков в течение 10 мин одним из следующих реагентов: 0,1% раствором сулемы, хлорсодержащим реагентом «Белизна», разбавленным в соотношении 1:1, а также раствором «Доместос» (1:4). При этом, соответственно, 60,3, 55,0 и 50,4% апексов жизнеспособны и начинают развитие в культуре in vitro. Для введения апексов клубневых ростков картофеля в культуру in vitro оптимальна среда МС без добавления фитогормонов. Необходимым этапом получения асептических растений in vitro является выявление эндофитной микрофлоры и отбраковка контаминированного материала. Проверка введенного в культуру in vitro растительного материала картофеля на специализированной среде Viss показала, что в среднем во всех вариантах стерилизации 55,0% полученных побегов являются асептическими и могут быть использованы для последующего микроклонального размножения и криоконсервации. Оптимизированы условия микроклонального размножения растений картофеля in vitro. Наиболее высокий коэффициент размножения (7,31) в среднем для исследуемых сортов и гибридов картофеля был получен на жидкой безгормональной среде МС с добавлением 2 мг/л пантотената кальция при вертикальной посадке двуузловых сегментов. Создана коллекция асептических растений картофеля in vitro, состоящая из 30 образцов, в том числе 20 казахстанских сортов, 6 гибридов и 4 зарубежных сорта, которая будет использована для создания криобанка в жидком азоте при температуре -196°С.Данная работа является актуальной в связи с необходимостью совершенствования способов массового получения оздоровленных микроклубней картофеля с привлечением замкнутых систем биореакторов для предотвращения вторичного заражение. Для изучения этапов клубнеобразования был выбран нетрадиционный — объект исследования — культура столонов. Такой подход позволил исключить из привычной схемы получения оздоровленных микроклубней картофеля стадию «фото-трофного пробирочного растения» и индуцировать микроклубнеобразованиенепосредственно на столонах. Показанная в ходе исследования [. Дерябин А. Н., 1997.
C. 58 ] зависимость развития столонов от числа эксапантов и объема жидкой среды в культуральном сосуде выявила необходимость применения в уникальной конструкции биореактора особой системы орошения. Культура столонов омывается питательной средой, поступающей из отдельной от сосуда с эксплантами емкости, благодаря работе пневмоимпульсного насоса. Это предоставило возможность не лимитировать ее объем и получать микроклубни в 1.5−1.8 раза большего диаметра, чем при других типах культивирования. Несомненно, при получении микроклубней картофеля в пневмоимпульсном биореакторе возникают новые возможности для изучения и регулирования этапов столонои клубнеобразования. В частности, необходимы комплексные исследования с привлечением более точных методов определения качественного и количественного состава углеводов в питательных средах в период культивирования.
В наших исследованиях предложено индуцировать клубнеобразование после формирования столонами двух метамеров (на 7 сутки культивирования). Анализ иерархии микроклубней и их выравненность подтверждает возможность такого подхода. Работе присущ поисковый характер. Попытка увеличения показателя эффективности клубнеобразования путем получения большого числа клубнеобразую-щих столонов за счет снятия апикального доминирования и индуцирования развития латеральных столонов не выявила высокой положительной корреляции (г=0.7 и выше) между числом столонов и микроклубней, что требует дополнительный поиск факторов. Выявленные при постановке экспериментов особенности культивирования культуры столонов следует учитывать при разработке технологии массового получения микроклубней картофеля в биореакторах.
Список литературы
1."Биотехнология проблемы и перспективы" -
Егоров Н. С., Москва, «Высшая школа» 1987 г.
2."Сельскохозяйственная биотехнология" - Шевелуха В. С, Калашникова Е. А., В.С., Кочиева Е. К и др., «Высшая школа» 2008 г. 710 с.
3.Шевелуха В. С. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. Москва. Колос. 1992. С.
599.
4. Юрьева Н. О., Орешников А. В., Дерябин А. Н. Изучение биологии микроклубней картофеля при быстром микроклональном размножении в биореакторах разного типа. Тез. докл. V Всеросс. планово-отчет. конф. по напр. «Гэнная и клеточная инженерия» (февраль, 1995). Москва. 1996. С.
54.6. Орешников А. В., Дерябин А. Н., Юрьева Н. О., Бутенко Р. Г. Заявка на изобре тение «Устройство для биотехнологического выращивания растительных тканей» N 96−111 641.
Приоритетот 10 июня 1996 г.
6. A.N.Deryabin, A.V.Oreshnikov, N.O.Yuorieva, R.G.Butenko. S caling up the process of virus-free potato (Solanum tuberosum L.) micropropagation through bioreactors. I.
n: «Hot Topics. A ddendum Booklet». World Congress on In Vitro Biology, 1996 Meeting of the Society for In Vitro Biology. B iotechnology: from fundamental concepts to reality.
S an Francisco. CA. USA. June 22−27.
1996. P.
18.7. Дерябин A.H., Орешников A.B., Юрьева H.O., Бутенко Р. Г. Рост столонов и индукция микроклубней картофеля in vitro при разных типах культивирования. Доклады РАН. 1997. (принята к печати).
8. Дерябин А. Н. автореф. Характеристика физиологических этапов при клональном размножении микроклубней картофеля в биореакторах. Москва. 1997. С.
589.Создание коллекции in vitro сортов и гибридов картофеля как исходного материала для криоконсервации DOI:
http://dx.doi.org/10.11 134/btp.
1.2013.
6 10. Keller E.R.J., Senula A., Leunufna S., Grübe M. S low growth storage and cryopreservation — tools to facilitate germplasm maintenance of vegetatively propagated crops in living plant collections // Int. J. R efrig. — 2006. — V.
ol. 29. — P. 411−417.
11. Kryszczuk A., Keller J., Grübe M., Zimnoch-Guzowska E. C ryopreservation of potato (Solanumtuberosum L.) shoot tips using vitrification and droplet method // J. F ood Agricult. E.
nvironm. — 2006. — V ol. 4. — P. 196−200.
12. Mix-Wagner G., Schumacher H.M., Cross R.J. Recovery of potato apices after several years of storage in liquid nitrogen // CryoLetters. — 2003. — Vol. 24, № 1. — P. 33−41.
13. Plant Cryopreservation. A Practical Guide / ReedB.M. (Ed.). — Springer Science+ Business Media, LLC, 2008. — 513 p.
14. VissP.R., Brooks E.M., Driver J.A. A simplified method for the control of bacterial contamination in woody plant tissue culture // In Vitro Cell. D ev. B iol.
— 1991. — V ol. 27. — P. 42.
15. Wang Q., Valkonen J.P.T. Cryotherapy of the shoot tips: novel pathogen eradication method // Trends in Plant Science. — 2008. — V ol. 14, № 3. — P. 119−122. 16. Айтбаев Т. Е. Достижения и перспективы селекции картофеля, овощных и бахчевых культур в Казахстане // Состояние и перспективы развития семеноводства сельскохозяйственных культур в Казахстане: матер. междунар. совещания. -.
Алмалыбақ, 2012. — С. 115−123.
17. Красавин В. Ф., Мошняков А. Н., Шарипова Д. С., Удовицкий А. С., Федосеев В. А., Красавина В. К., Лигай Г. Л., Кулибаба В. С., Кулибаба В. А. Каталог генофонда картофеля Республики Казахстан (сорта картофеля казахстанской селекции). — Кайнар, 2011. — 54 с.
18. Лакин Г. Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. вузов / 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во Высш. школа, 1990. — 352 с.
19.Назарова Н. Н .Культура столонов и регуляция роста растений и клубнеобразование у картофеля in vitro автореф. Душанбе.
2006.
198 с. 21. Вышегуров С. Х. Совершенствование агротехнических приемов выращивания разных сортов оздоровительного семенного картофеля в лесостепи Приобья автореферата 2006. 32 с.
22. Юрьева Н. О., Дерябин А. Н. Возможность регуляции процесса клубнеобра-зования у картофеля (S. tuberosum L.) в условиях биореактора с использованием фитогормонов и ретардантов. Регуляторы роста и развития растений. Тез. докл. I ll Междунар. конф. (.
27−29 июня 1995 г.) М. РАСХН. С.
208.
23. Ромаданова Н. В., Кушнаренко С. В. Влияние холодовой обработки побегов in vitro на криосохранение апикальных меристем яблони // Биотехнология. Теория и практика. — 2007. — № 3. — С. 39−44.
24.Сайт.
http://www.biotechnolog.ru25.Сайт.
http://www.sgi.od.ua/st/52-biotexnologiya-v-selskom-xozyajstve-rasteniya.html26. Сайт.
http://DOI:
http://dx.doi.org/10.11 134/btp.
1.2013.
627. Стрибуль Т. Ф., Шевченко Н. А., Розанов Л. Ф. Изучение влияния холодового закаливания картофеля на сохранность меристем, криоконсервированных медленным замораживанием // Проблемы криобиологии. — 2006. — Т. 16, № 1. — С. 60−65.
28. Токбергенова Ж. А. Индуцирование клубнеобразвания сортов картофеля в культуре in vitro // Вестник Павлодарского Государственного Университета. Серия химико-биологическая. — 2010. — № 1. — С. 101−106.
29.Ханиева И. М, Альмова М. С. Швачко Н.А., Гавриленко Т. А. Криоконсервация образцов культурных видов картофеля из коллекции ВИР // Идеи Н. И. Вавилова в современном мире: тез. докл. III-ей Вавиловской межд. конф. — СПб, 2012. — С. 228.
30.Диссертации о Земле
http://earthpapers.net/harakteristika-fiziologicheskih-etapov-pri-klonalnom-razmnozhenii-mikroklubney-kartofelya-v-bioreaktorah#ixzz3Z26ZibDR 31. Кушнаренко С. В., Ромаданова Н. В., Аралбаева М. М., Матакова Г. Н., Бекебаева М. О., Баби секова Д. И. Создание коллекции invitro сортов и гибридов картофеля как исходного материала для криоконсервации. Казахстан. 2013. С. 8.
