Возбудитель стахиботриотоксикоза

Содержание Введение

1. Возбудитель стахиботриотоксикоза

2. Морфологические свойства Stachibotrys alternans

3. Культуральные свойства Stachibotrys alternans

4. Токсические свойства Stachibotrys alternans

5. Эпизоотология стахиботриотаксикоза

6. Патогенные свойства Stachibotrys alternans

7. Устойчивость Stachibotrys alternans к действию факторов внешней среды

8. Диагностика стахиботриотоксикоза

9. Меры борьбы и профилактики стахиботриотоксикоза

10. Терапия стахиботриотоксикоза Заключение Список литературы

Проблема микотоксинов и микотоксикозов животных в настоящее время стала не только экономически, но и социально значимой. Были произведены исследования по выявлению грибов, образующих микотоксины, субстратов, на которых они растут, условий роста грибов и образования токсинов, восприимчивых к токсинам животных и патологических изменений, вызываемых микротоксинами, по разработке методов обнаружения микотоксинов в кормах и продуктов питания, а также мер профилактики микотоксикозов. Было выделено (по данным разных исследователей) 80−2000 микотоксинов и установлено, что несколько видов грибов даже разных родов могут образовывать один и тот же токсин, а грибы одного вида могут продуцировать несколько токсинов. Механизм действия микотоксинов, кроме афлатоксина В₁, изучен недостаточно.

Полевые случаи острых микотоксикозов регистрируются во многих странах, но наибольший экономический ущерб наносят подострое и хроническое течение.

Болезни, связанные с токсическими грибами, известны более двух столетий. Раньше других были известны токсические алкалоиды спорыньи. В 30-х годах нашего века в СССР впервые установили, что грибной токсин является причиной стахиботриотоксикоза лошадей. С помощью чувствительных методов было показано, что токсины присутствуют во многих кормах и продуктах питания. Были установлены причины ряда распространенных болезней.

Проблема микотоксикозов в последние два десятилетия стала международной. Возникла новая отрасль науки — микробиология кормов. Многие ученые считают, что факторами, благоприятствующими развитию грибов в кормовых средствах и увеличивают число случаев микотоксикозов, являются современные приемы земледелия, выращивание высокоурожайных, но с пониженной общей резистентностью культур, новые способы уборки урожая, транспортировки, хранения и приготовления кормов, густой посев, повторное выращивание культур на одном участке, нерациональное орошение, сев в ранние сроки, неправильное применение ядохимикатов.

В организм человека микотоксины могут попасть с продуктами питания растительного происхождения, а также с продуктами животноводства. Во избежание попадания микотоксинов в организм животного и человека в концентрациях, могущих нанести вред их здоровью, в ряде стран установлены предельно допустимые количества (ПДК) некоторых токсинов в кормах для животных и отдельных продуктах питания.

1. Возбудитель стахиботриотоксикоза

Сапрофитный гриб стахиботрис альтернанс (Stachibotrys alternans) широко распространен в природе, выделен в различных странах. Относится к несовершенным грибам Fungi imperfecti, класс Deuteriomycetes, порядок Moniliales, семейство Dematiaceae, к роду Stachibotrys, вид Stachibotrys alternans.

Существуют как токсические (Stachibotrys alternans var. Jateli), так и нетоксические формы (Stachibotrys alternans var. Atoxica).

Вызывает широко распространенное заболевание лошадей, крупного рогатого скота и других животных. Впервые этиологическое значение гриба в болезни лошадей было установлено в 1938 году коллективом ученых Института микробиологии Академии наук УССР под руководством В. Г. Дроботько К.И. Вертинского. Заболевание получило название стахиботриотоксикоза. Виновник заболевания гриб S. Alternans был впервые открыт П. Д. Ятель (1937;1938 гг.).

Еще до выяснения этиологического значения Stachibotrys alternans Пономаренко изучены клинические и патологоанатомические признаки заболевания и установлена принадлежность его к отдельной нозологической единице, не известной до того времени в науке. Экспериментальный токсикоз на различных животных воспроизвели: П. Д. Ятель, С. П. Аскалонов, Н. Е. Корнеев и др. Культурально-морфологические свойства гриба изучили Н. А. Наумов, С. М. Бакай, В. Т. Панасенко и др. Особое внимание заслуживает работа А. М. Курапова, детально разработавшего лабораторно-клиническую диагностику болезни. Эти работы позволили ближе подойти к вопросам патогенеза.

Заболевание отмечалось на Украине в 1931 г. В 1937;1940 гг. наблюдалось в районах Поволжья Восточной Сибири, центральной полосы СССР, Молдавии, Румынии, Польше, Словакии, Венгрии.

Стахиботриотоксикоз (Stachybotryotoxiecosis) — остро-, реже подостропротекающий микотоксикоз сельскохозяйственных животных, возникающий при поедании недоброкачественных кормов или использования для подстилки соломы, пораженных токсической формой гриба Stachybotrys alternans. Виды рода Stachibotrys, как и многие целлюлозоразрушающие грибы играют роль в обогащении почвы легкоусваиваемыми органическими веществами, способствуя развитию других микроорганизмов.

В развивающихся странах микроорганизмы уничтожают до 25% продуктов питания. Свыше 1% урожая в мире уничтожается грибами. В США, например, плесневыми грибами поражается около 20% зерна, включая готовые комбикорма. При этом около 80% вскармливается сельскохозяйственным животным. Типичные случаи этого токсикоза характеризуются язвенно-некротическим процессом, лейкопенией, тромбопенией и геморрагическим синдромом.

По мере накопления информации о микотоксикозах начали изучать их токсические, канцерогенные и мутагенные свойства и возможное действие на человека.

2. Морфологические свойства Stachibotrys alternans

Мицелий гриба септирован (поперечными перегородками), многоклеточный. От мицелия вверх развиваются спороносные гифы, конидиеносцы со стеригмами и сидящими на них конидиями.

Толщина гифа зависит от возраста и достигает 2−3 мкм. Воздушные гифы образуют коремии. Конидиеносцы бесцветные, гладкие, в верхней части бородавчатые, 45−52 мкм длиной и 4 мкм в диаметре. Конидиеносцы разветвлённые на конце с розеткой булавовидных (яйцевидных) стеригм, сросшихся у основания в количестве 5−8, реже 9 (рис. 1).

На стеригмах образуются конидии. На вершине стеригмы вначале вырастает небольшое вздутие, которое увеличивается в длину и ширину, постепенно пигментируются. Созревшие конидии отделяются от стеригм, на их месте образуются новые.

Конидии — одноклеточные, эллипсоидальные или яйцевидные, молодые — гладкие, зрелые — шиповатые. Легко опадающие. Споры вначале бесцветные или бледно-оливковые, с возрастом темнеющие, оливково-бурого, черного цвета, длиной до 8−12 и шириной до 6−8 мкм.

В зависимости от условий культивирования морфологические признаки варьируются.

Рисунок 1. Кондининосец Stahybotrys alternans, заканчивающийся розеткой булавовидных стигм

3. Культуральные свойства Stachibotrys alternans

В естественных условиях гриб растет на влажных растительных кормах, богатой целлюлозой (солома, сено, мякина, семена бобовых и кукурузы), реже — сочные корма (силос, сенаж). Пораженные корма чернеют, образуется сажистый, легко снимающийся налет. Для искусственного культивирования используют жидкие и плотные питательные среды (агар Чапека, среду Сабуро, сусло-агар Ваксманаи среду Ван-Итерсона).

В жидких средах гриб дает поверхностный рост, вначале в виде пристеночного кольца из субстратного мицелия гриба, а с 5−6 суток в виде студневидной пленки. При культивировании на жидких средах без механической опоры, рост гриба погруженный, хлопковидный, с образованием хламидоспор, среда остается прозрачной.

На плотных средах (среда Сабуро, агар Чапека) вырастают двухзонные колонии, в центре складчатые, черного цвета; на периферии колонии образуется белая или серо-белая каемка. Колонии непросвечивающиеся, овальной формы. Среда вокруг колонии окрашена в бурый цвет, часто с темно вишневым оттенком (рис. 2).

Рисунок 2. Месячная колония гриба на агаре Чапека На сусло-агаре колония черная с радиальными бороздками и с лучистой периферией.

На среде Сабуро — центральная зона колонии с возрастом приобретает черный цвет с радиальными, глубокими бороздками, с выраженной каемкой на периферии белого стелющегося мицелия.

На фильтровальной бумаге со средой Ван-Итерсона на 7−12 сутки образуется черный, иногда с зеленоватым оттенком, сажистый налет.

На средах с аммиачными солями появляются грушевидные хламидоспоры, одиночные или четкими рядами (В. Н. Оршанская).

По данным В. Н. Оршанской и П. А. Аполосовой, гриб S. Alternans на неавтоклавированных стельных тканях животного образовал вместо черного сажистого налета беловато-серый восковидный налет, состоящего из хламидоспорного мицелия. На ломтиках картофеля урожая прошлых лет тот же штамм гриба образовывал колонии с пушистым розовато — белым мицелием, который постепенно подвергался аутолизу. На среде Чапека с хлористым и сернокислым аммонием гриб рос в виде плотных сухих, слегка выпуклых грязно — восковидных дрожжеподобных колоний. Мицелий таких колоний состоял из хламидоспор различной формы.

Гриб S. Alternans хорошо развивается на мертвой ткани: печени, селезенки, скелетных мышцах, неглубоко прорастая в ткань. При добавлении в среду Чапека 6% глюкозы, витамина В₁ 0,5 гаммы/мл, витамина С 0,3 гаммы/мл и особенно никотиновой 0,25 гаммы /мл. При этом ускоряется рост и развитие гриба, усиливаются сахаролитичесикие, протеолитические и гемолитические свойства.

Отсутствие роста отмечается (или незначительный рост) наблюдается на средах с ксиланом, лигнином, сорбозой, спиртами алифатического ряда, органическими кислотами. Спорообразование не обнаружено на средах с лактозой и глицерином. Хороший рост гриба отмечен при использовании аминокислот глицина, альфа-аланина, триптофана, лейцина, аспаргина. При росте с остальными аминокислотами, а так же аммонийными солями неорганических и органических кислот наблюдался слабый рост в виде отдельных дерновинок и мицелия наподобие клеток хламидоспорового типа.

Оптимальная температура для развития гриба 20−27^оС, конидии прорастают уже через 4−5 часов, а конидиальное спороношение возникает уже на 3−4 сутки. При низкой температуре (2−5^о) конидии не образуются, при 8^о — рост на 4 день, а спороношение только на 21−42 сутки.

Вегетативные формы гриба хорошо развиваются при относительной влажности воздуха 93−95% (В.Г. Панасенко). При уменьшении ее рост и развитие гриба замедляются. Н. М. Пидопличко считает наилучшей влажностью 45−50%.

При культивировании наблюдается различная токсичность штаммов. Из 40 штаммов Stachibotrys alternans культурная жидкость 26 штаммов вызывал кожную реакцию у кроликов, 15 штаммов были слаботоксичны. По данным Юськива (1968 г), изучавшего токсические свойства 21 штамма Stachibotrys alternans, выделенного из почвы и зараженного корма, положительная проба на коже выявлена у пяти штаммов, положительная реакция с резорцином — у 13, и все оказались токсичными в алиментарных опытах. На 5−8-й день мыши гибли от корма, зараженного 16 штаммами, на 10−14й день — от корма, зараженного остальными шестью штаммами.

4. Токсические свойства Stachibotrys alternans.

Изучение токсических свойств и географического происхождения рас Stachibotrys alternans представляется весьма важным для понимания процессов токсинобразования и их значения в возникновении заболеваний сельскохозяйственных животных и человека.

Гриб S. Alternans образует токсические вещества как на естественных субстратах: соломе ячменной, пшеничной, ржаной, овсяной, на сене — лучше злаковом, на зерне — ячмене, овсе — так и на искусственных средах: сусло — агаре, агаре Чапека и др. Не отмечено токсикообразования при росте на средах с маннитом, сорбитом и дульцитом.

Образование токсинов происходит в стеригмах, конидиях и меньше в конидиносцах. Накопление токсических веществ в субстрате совпадает с процессом спорообразования и идет параллельное процессу накопления биомассы и пигмента и заканчивается одновременно с окончанием роста гриба. Этот период равен 10−25 дням.

Из культур гриба Stachibotrys alternans выделено:

1. стахиботриотоксин, А имеет стеридное ядро, 4 гидроксильные группы и ненасыщенные лактоновые кольца, растворимый в эфире и обладающий остротоксическим действием, в состав входят токсичные эпокситрихотецены;

2. стахиботриотоксин Б, нерастворимый в воде и эфире, слаборастворимый в хлороформе;

3. токсин В-3, блокирующий сердечную мышцу;

4. роридин Е и веррукарин I.

Фармакологические свойства спиртовых растворов токсинов Stachibotrys alternans из эфирных экстрактов пораженного корма или культуры гриба на сусловом агаре изучили Серебряная, Прокопович (1949). Действие токсина на изолированное сердце лягушки вызывало сравнительно быстрый систолический подъем амплитуды сокращений с уменьшением диастолического расслабления. При более высоких концентрациях токсина остановка деятельности сердца наступала также в систоле; примерно в 4 раза меньшая концентрация токсина по сравнению с концентрацией, действующей на изолированное сердце лягушки, вызывало после кратковременного расширения стойкое сужение сосудов изолированного уха кролика (по Кравкову — Писемскому). По данным Прокоповича высокие концентрации вызывают быстрое укорочение диастолы, аритмию и остановку изолированного сердца лягушки в систоле, более низкие — увеличение систолы и диастолы, а также замедление ритма сокращения. При патологоанамическом исследовании погибших мышей, которым вводился токсин, обнаружена систолическая остановка желудочков сердца.

В чистом виде токсины нерастворимые в воде, устойчивы к действию высоких температур, свету, рентгеновскому и ультрафиолетовому облучению, минеральным и органическим кислотам. Дрожжевание и молочнокислое брожение не детоксифицируют пораженный корм. Извлекаются бензином, хлороформом и спиртом.

Двухчасовая обработка пораженного корма в автоклаве при 112^оС ведет к полному разрушению токсических веществ. Нейтрализация их достигается 0,5%-м раствором NaOH, 1%-м раствором аммиака и 5%-й суспензией извести.

С.М. Бакай в 1958 г установил, что токсические и анатоксические варианты гриба при оптимальных условиях развиваются неодинаково. Токсические колонии, выращенные на среде Сабуро при температуре 23^о, в течении 9 дней, имели периферическое мицелиальное кольцо нежно — паутинистое, более широкое, а среда вокруг колонии более интенсивно окрашена, чем у атоксичных вариантов.

Н.М. Пидопличко для обнаружения токсического вещества в культуре гриба применял микрохимическую реакцию, разработанную Кульбергом. Сущность реакции в том, что токсические вещества гриба Stachibotrys alternans в присутствии крепкой соляной кислоты с резорцином окрашиваются в розовый цвет. При помощи микрохимической реакции токсические вещества Пидопличко обнаруживал во всех фазах гриба: в стеригмах, конидиях и меньше в конидиеносцах.

Токсические вещества гриба могут сохранятся долгое время в фураже при обычных условиях хранения.

5. Эпизоотология стахиботриотаксикоза

К характерным особенностям стахиботриотаксикоза относятся быстрота распространения и массовость. Болезнь чаще возникает в период стойлового содержания животных, после скармливания пораженных грибов, обычно соломы.

В зависимости от ряда условий число больных животных в отдельных хозяйствах колеблется: в одних оно достигает до 100%, а смертность 85−90%; в других — количество значительно меньше и погибших животных единицы или совершенно не бывает.

В хозяйствах, где диагноз установлен с запозданием, не исключен из рациона пораженный корм, животные истощены, не оказывается лечебная помощь, часто регистрируются более тяжелые формы стахиботриотаксикоза, и наблюдается наибольший процент смертности.

Источником гриба является почва. При контакте влажной соломы с зараженной почвой и начинается развитие гриба на соломе.

В неблагополучных зонах заболевания могут возникать ежегодно.

6. Патогенные свойства Stachibotrys alternans

Патогенез стахиботриотаксикоза изучен недостаточно.

Наиболее чувствительными к заражению являются лошади, несколько меньше болеют жвачные и свиньи. Экспериментально стахиботриотоксикоз воспроизведен у лошадей, КРС, овец, свиней, собак и лабораторных животных. Более высокая чувствительность выявилась у собак и кошек: однократный прием культур гриба с пищей вызывал гибель у первых на 3−5 день, у вторых — через 1−2 дня. Чувствительны к токсину морские свинки, белые крысы. В естественных условиях животные заражаются при поедании пораженных грибами кормов (грубых и концентрированных), при использовании пораженной подстилки. Поросята сосуны заражаются при сосании больных свиноматок.

Описаны случаи стахиботриотоксикоза у лосей, бизонов и других диких животных. Отмечено, что молодняк молочного периода не болеет.

В основе патогенеза лежит действие токсинов, которые из пищеварительного тракта поступают в кровеносную и лимфатическую системы и разносятся по всему организму. Через несколько часов токсины поражают центральную нервную систему, вызывает глубокие изменения в кроветворных органах и сосудистой системе. Нарушается минеральный обмен, возникают очаги распада тканей в кишечнике и другие изменения.

Микотоксины стахиботрикса обладают местным и общим действием. В кровеносных сосудах возникают воспалительные и некротические процессы — стенки сосудов становятся дряблыми и порозными. При этом отмечают гиперемию, отечность, иногда обнаруживаются дегенеративные изменения в нервной ткани, а так же в кроветворных органах: костном мозге, селезенке, лимфатических узлах, печени. Отмечаются множественные кровоизлияния на слизистых и серозных покровах. При длительном поступлении микотоксинов в организм снижается общая резистентность, подавляется иммунологическая резистентность, может развиваться неспецифическая микрофлора, результатом чего может быть возникновение вторичных заболеваний (сепсис и т. д.). Для болезни характерна быстрота распространения и массовость поражения.

Течение заболевания и проявления его форм в значительной степени зависят от дозы или токсичности корма. Последняя определяется как степенью его поражения, так и, особенно, токсичностью гриба. При высокой степени поражения корма расой St. alternans энзоотия начинается быстро и проявляется в тяжелой форме; при незначительном поражении корма или низкой токсичности Stachibotrys alternans количество больных животных увеличивается постепенно, и заболевание протекает в слабой форме. Это было показано впервые при изучении этиологии стахиботриотоксикоза. Опыты проводились на 6 лошадях, получавших культуру гриба соответственно из 30,20, 10, 5, 3 и 1 чашек Петри. Первая лошадь погибла на5-е, вторая-9-е, третья-32-е сутки, остальные две заболели на третий месяц.

Очевидно, хронические формы стахиботриотоксикоза, обусловленные слаботоксическими штаммами St. alternans, проходят незамеченными или неправильно диагностируемыми.

7. Устойчивость Stachibotrys alternans к действию факторов внешней среды

Споры St. alternans до 6 месяцев сохраняют жизнеспособность в почве, скирдах соломы и стеблях растений при температуре -35^оС, а при достаточной влажности и плюсовой температуре прорастают.

Прямые солнечные лучи, воздействующие в течение 10−15мин, замедляют прорастание конидий гриба; рассеянный свет, рентгеновское и ультрафиолетовое излучение почти не оказывают на них влияние.

При воздействии текучим паром гриб на влажной соломе гибнет в течение 2−3 минут. Сухие конидии утрачивают жизнеспособность через 5 минут. Сухой жар (120^оС) убивает конидии в течение 1 часа, горячая вода (88^оС) — за 30 минут.

На гриб губительно действуют газообразный хлор, формалин, растворы формалина, фенола, аммиака, щелочей, спирта и др. Например, 2% раствор NaOH на протяжении 1 часа разрушает споры; 2% раствор карболовой кислоты- 30 минут, 1% раствор карболовый кислоты -1 сутки, 0,5% раствор карболовой кислоты -2 суток; 5% раствор аммиака-30 минут; 1% формалин — за час.

Месячная, четырехмесячная и полугодовая культуры гриба не погибают под действием 2−4% растворов едкого натрия в течении более 24 часов.

8. Диагностика стахиботриотаксикоза

Лабораторная диагностика стахиботриотоксикоза основана на учете эпизоотологических данных (поражение корма, массовое появление болезни, сезонность, отсутствие заболеваний у молодняка, высокая летальность и др.), результатов клинического и гематологического исследований, патологоанатомического вскрытия и микологического исследования кормов.

Кроме того, на исследование посылают кал, а у погибших — пораженные участки кишечника, преджелудков, костный мозг, печень, кровь. Исследование включает в себя микроскопию, выделение гриба Stachibotrys alternans из кормов и определение его токсичности.

Отбор проб корма В лабораторию посылают пробы соломы, особенно в узлах соломинки, сена и зернофуража, покрытые черным сажистым налетом, реже силос. Для микотоксилогического исследования пробы кормов берут из среднего образца. Вес пробы должен быть не менее 1 кг для зерна, комбикорма, отрубей и 100 г для грубых кормов (ГОСТ 10 839−64). Для выемок зерна используют различные щупы: конусные, цилиндрические, мешочные. Общий вес выемок, отобранных из вагонов емкостью 20 т должен быть не менее 2 кг, 50 т-4,5 кг, из автомашин — не менее 1 кг, из зерна, хранящегося в складах, насыпью 22 кг на каждую секцию площадью 100 м², струи перемещаемого зерна — по 0,1 кг на каждую тонну, из мешков до 10 штук — из каждого второго мешка, из мешков от 10 до 100 мешков — из 5 мешков в партии, свыше 100 мешков — из 10 мешков в партии.

Отбор среднего образца комбикорма (ГОСТ 13 496.0−70). При производстве рассыпного комбикорма отбор выемок производится из — под смесителя путем пересечения струи комбикорма железным ковшом через равные промежутки времени, но не реже, чем через 2 часа, а в складах — амбарным или вагонным щупом, общий вес выемок должен быть не менее 3 кг. микотоксикоз возбудитель стахиботриотоксикоз животное Отбор среднего образца отрубей (ГОСТ 9404−60). Отбор выемок производится так же, как и рассыпного комбикорма.

Отбор среднего образца сена (ГОСТ 4808−65). Средний образец должен быть отобран из каждой партии однородного сена. Средний образец отбирают в количестве не менее 5 кг от каждых 25 т непрессованного и 50 т прессованного сена.

Отбор среднего образца силоса. Пробы силоса отбирают из разных мест силосного сооружения в количестве 500 г, просушивают до воздушно-сухого состояния и упаковывают в пергаментную бумагу.

Органолептический анализ кормов При поступлении образца корма для исследования проводят, прежде всего, органолептический анализ, заключающийся в определении запаха, цвета, иногда вкуса и в установлении видимых признаков поражения его грибами.

1. Органолептический анализ зерна

· Определение запаха. Запах определяют как целого, так и размолотого зерна. Для этого на ладонь берут около 100 г зерна и согревают дыханием. Для усиления запаха навеску помещают в стакан, заливают горячей водой (60−70°С), закрывают стеклом, оставляют на 2−3 минуты. Затем воду сливают и определяют запах корма.

· Определение вкуса. 100 г зерна размалывают на лабораторной мельнице и около 2 г исследуют на вкус, после чего обязательно прополаскивают рот водой.

· Определение цвета. Навеску зерна помещают на лист белой бумаги и определяют цвет при рассеянном свете, сравнивая его с цветом, установленным в стандарте на эту культуру.

· По органолептический показателям различают 4 степени порчи зерна. Первая степень. Зерно имеет солодовый запах, цвет без изменений.

Вторая степень. Зерно имеет плеснево-затхлый запах, внешний покров зерен без блеска, потемневший.

Третья степень. Зерно с плеснево-гнилостным запахом, внешние покровы зерна темные.

Четвертая степень. Зерно имеет гнилостный запах, цвет эндосперма коричневый.

2. Органолептический анализ комбикормов, отрубей и других сыпучих кормов.

· Определение запаха. Берут навеску 20 г, высыпают на чистую бумагу, для усиления ощущения запаха навеску помещают в фарфоровую чашку, покрывают стеклом, ставят на предварительно прогретую до кипения водяную баню и прогревают в течение 5 минут. После этого определяют запах.

· Определение цвета выполняют так же, как и у зерна.

3. Органолептический анализ грубых кормов (сено, солома)

· Определение запаха. Клочок корма помещают в стакан, обливают небольшим количеством горячей воды и покрывают стеклом. Через 2−3 минуты исследуют запах.

· Определение цвета. Цвет грубых кормов определяют при осмотре внутренних слоев кип или скирд, помещая клочок сена или соломы на лист белой бумаги, а не путем осмотра среднего образца.

4. Органолептический анализ силосованных кормов: запах, цвет определяют так же, как сена.

Микроскопическое исследование кормов При обнаружении видимых грибных поражений на зерне, стебле, листьях прибегают к микроскопическому исследованию. Препараты готовят путем соскабливания грибного налета скальпелем, помещают на предметное стекло в каплю 5%-го водного раствора глицерина, накрывают предметным стеклом и рассматривают при малом и среднем увеличении. В поле зрения видны нити септированного многоклеточного мицелия, от которого отходят темноокрашенные конидиеносцы, стеригмы и конидии. Вместо глицерина можно использовать дистиллированную воду.

При наличии поверхностных спороношений и легко смывающихся спор этих грибов можно пользоваться методом смыва спор. Для этого исследуемый материал измельчают, помещают в колбу, заливают чистой водой и в течение 20 минут взбалтывают. Каплю полученной взвеси наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Микроскопическое исследование позволяет установить род гриба, а иногда и вид его.

Выделение грибов из кормов и других субстратов Выделение поверхностных грибов из зерна. Наиболее простым способом является отмывка спор в воде и сразу в питательной среде. Полученную взвесь разливают на поверхности плотной питательной среды или заливают расплавленной средой в чашках Петри. Для выделения глубинной микрофлоры необходимо проводить дезинфекцию зерна формалином, хлорной или бромной водой. Наиболее доступный и эффективный метод протравливания 3%-ным раствором формалина в течение 5 минут с последующей промывкой в стерильной воде, куда добавляют небольшое количество 5%-го раствора аммиака (2−3 капли на 50 см³ воды). Продезинфицированные зерна раскладывают по поверхности питательной среды, если мицелий гриба располагается в глубоких частях зерна, то обработанные зерна расщепляют пополам (по 10 штук на чашку Петри, а крупные — горох, бобы, кукуруза — по 5 штук).

Число чашек при посеве должно быть не менее 5, а при посеве крупных зерен не менее 10.

Выделение грибов из сыпучих кормов методом непосредственного посева. Исследуемый материал небольшими кучками (несколько крупинок) раскладывают по поверхности агаризованной среды (10 кучек).

Выделение грибов из грубых кормов осуществляется несколькими способами. На дно чашки Петри кладут кружок фильтровальной бумаги, затем чашки стерилизуют, перед посевом бумагу увлажняют небольшим количеством среды Ван-Итерсона. Солому и сено нарезают кусочками длиной 2 см и стерильным пинцетом помещают во влажную камеру (по 5−10 кусочков). Для получения культур грибов в искусственных условиях необходимо с учетом предполагаемого вида выбрать питательные среды. Для аспергиллов и пенициллов чаще применяют агар Чапека или мальц агар, для мукоровых — сусло-агар, для фузариев — среда Билай и сусло-агар, культивировать при температуре 22−25°С. Сроки культивирования зависят от вида гриба.

Токсико-биологическое исследование культур грибов Определение токсичности культур грибов на простейших Paramecium

Для быстрого определения токсичности берут кусочек колонии гриба, выросшего при первичном посеве, переносят на предметное стекло иглой или шпателем, измельчают, заливают несколькими каплями дистиллированной воды и смешивают. Через 2 часа мицелиальную пленку в капле смеси удаляют, вносят каплю среды с простейшими и ведут наблюдение за поведением парамеций (объектив Х8, Х10). Многие микотоксины вызывают гибель парамеций от 1 до 30 минут, слабая токсичность до 2 часов. Для культивирования парамеций в качестве питательных сред используют сенной настой или молочную среду. Для приготовления сенного настоя злаковое сено нарезают кусочками, помещают в колбу, заливают водопроводной водой 1:2, закрывают ватно-марлевой пробкой, кипятят 20 минут, помещают в термостат (37°С) на 3 суток для накопления Bac. subtilis, которая служит кормом для парамеций, затем в полученную среду помещают парамеций и культивируют при комнатной температуре, периодически (1 раз в месяц) перенося их в новую среду. Для приготовления молочной среды кипяченую воду оставляют на 1 сутки для насыщения кислородом, на 15−20 мл воды добавляют 2−3 капли сырого молока и помещают в термостат (37°С) на 3 суток для размножения молочнокислых бактерий, которыми питаются парамеции, а затем в полученную среду помещают парамеции; 3−4 раза в месяц в среду добавляют молоко.

Токсичность определяют методом кожных проб на кролике. Для этого 50 г пораженной грибом измельченной соломы помещают в бумажные патроны из фильтровальной бумаги и экстрагируют в аппарате Сокслета серным эфиром в течение 6 часов. Эфир отгоняют, полученный экстракт переносят в сосуд и конденсируют при комнатной температуре до испарения эфира. Вместо эфира можно использовать ацетон, хлороформ и другие органические растворители. Полученный экстракт двукратно наносят на выбритую поверхность кролика размером 3Ч3. При положительной биопробе через 24−48 часов на коже появляется болезненная припухлость.

Кроме этого биопробу ставят на белых мышах, вводя им вытяжку в ЖКТ. При положительной биопробе наступает гибель животных.

Биопробу ставят на рыбках (вид гуппи), вводя вытяжку в аквариум. При наличии токсина рыбки погибают.

С такой же целью применяют куриные эмбрионы. После инокуляции токсина в желчный мешок 6−10-дневный эмбрионы погибают в течение 18 ч.

Определение токсичности кормов Кожная проба (на кролике) используется для определения токсичности фуражного зерна, комбикормов и других концентрированных кормов, а также грубых кормов. В банку или колбу притертой пробкой вместимостью 500 мл помещают 50 граммов измельченного корма, заливают 150 мл диэтилового эфира (эфира для наркоза) или ацетоном, экстрагируют 24 часа при комнатной температуре, встряхивают на шуттель — аппарате 3 часа. Если слой экстрагента над навеской менее 1 см, объем его увеличивают. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в выпаривательную чашку. Оставшуюся в колбе навеску дополнительно промывают небольшим количеством эфира (20 мл) и фильтруют через этот же фильтр. Эфир выпаривают на водяной бане до полного исчезновения запаха. У кролика массой 2−2,5 кг в области бедра, лопатки или бока в день постановки биопробы тщательно выстригают участок кожи размером 6×6 см. На одном кролике допускается ставить не более 4 проб. На выстриженный участок кожи стеклянной лопаткой наносят, слегка втирая, половину экстракта. Для предупреждения слизывания на шею кролику надевают воротник, который снимают не ранее чем через 3 дня. Учет реакции ведут на следующий день после повторного нанесения экстракта и продолжают в течение 3−5 дней.

Оценка результатов исследования:

· Корм нетоксичный — отсутствие воспалительной реакции или наличие гиперемии, сохраняющейся не более 2 суток;

· Корм слаботоксичный — гиперемия, сохраняющаяся 2−3 суток и заканчивающаяся шелушением кожи;

· Корм токсичный — резкая гиперемия, болезненность, складчатость, отек, появляются язвы, затем сплошной струп.

Определение токсичности на лабораторных животных Для определения токсичности концентрированных или комбинированных кормов используют 10−15 суточных цыплят, 10 суточных утят, молодых мышей массой 20−25 граммов, а при определении токсичности грубых кормов — молодых морских свинок или кроликов. Подозрительный по качеству корм вводят в суточный корм взамен доброкачественного корма. Скармливание проводят не менее 10 дней подряд. Животных перед опытом выдерживают на голодной диете 5−6 часов, дачу воды не ограничивают. Для опыта берут 5 животных, за ними ведут ежедневное наблюдение. Показателями токсичности кормов являются: потеря массы, расстройство функции желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы (дрожь, угнетение или возбуждение, нарушение координации движений, судороги, параличи); у цыплят и утят — цианоз гребня и сережек, сонливость, понос; у голубей — рвота. Токсичные корма могут вызвать гибель без проявления клинических признаков.

В случаях, если токсичность корма не выявлена вышеперечисленными методами, для установления роли кормов применяют скармливание кормов тем видам животных, которые болели в хозяйстве.

Химические методы определения токсичности кормов Резорциновая проба. Берут 1 мл эфирного экстракта из исследуемого материала, добавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и несколько кристаллов резорцина. При наличии токсических веществ соляная кислота окрашивается в интенсивный красный цвет, через 24−48 часов выпадает красный осадок.

Проба трихлоруксусной кислотой. Готовят эфирные экстракты чистых культур грибов и к 1−2 каплям экстрактов в фарфоровой чашке добавляют 5−8 капель 90%-го раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и наблюдают в течение 15 минут. При наличии в экстрактах токсинов Stachybonis alternans происходит окрашивание в желтый или коричневый.

9. Меры борьбы и профилактика стахиботриотоксикоза

Своевременное обнаружение больных и исключение из рациона кормов, пораженных грибом Stachibotrys alternans, в большинстве случаев приводит к выздоровлению больных животных.

Для предупреждения проводят скирдование только сухой соломы, не оставляют незавершённые скирды, соблюдение агротехнических правил уборки и хранения грубых (сено, солома) кормов; не допускают самозапаривания поражённой соломы, а в подозрительных случаях направляют ее в лабораторию для токсикомикологического исследования. В неблагополучных хозяйствах проводят ветеринарно-санитарные мероприятия, влажную уборку помещения, биотермическое обеззараживание навоза, дезинфекцию помещений щелочными растворами, уничтожают остатки пораженных кормов.

Грубые корма (сено, солома). Токсичные грубые корма запрещается использовать в корм и на подстилку, а так же для хозяйственных целей. Её целесообразно уничтожать. Нельзя также применять в технических целях, так как возможны случаи заболевания людей, перерабатывающих такую солому. Нетоксичные и слаботоксичные грубые корма, токсичность которых обусловлена грибом Stachybotris alternans, разрешается использовать только после обезвреживания.

Комбинированные корма. Токсичные комбинированные корма запрещается использовать для фуражных целей.

Для выявления больных всех животных подвергают клиническому осмотру и термометрии, а подозреваемых в заражении — гематологическому исследованию.

Обработка некондиционных кормов Обезвреживание грубых кормов

1. Запаривание грубых кормов проводят в кормоприготовительных цехах. Для этого используют смесители периодического (С-12) и непрерывного (С-30 и ИСК-3) действия. Измельченный корм укладывают в запарные чаны слоями 40−50 см, равномерно поливают водой (80−100 л/ц), утрамбовывают, закрывают крышкой и пропускают пар 30−40 минут, выдерживают 6−8 часов и затем в теплом виде скармливают животным.

2. Обработка аммиаком. Стог или скирду укрывают пологом из мелиоративной (полукапроновой) ткани или поливинилхлоридной (полиэтиленовой) пленки, края пленки присыпают слоем грунта. Обработку сжиженным аммиаком производят с помощью специальных машин: В-3502, 3 БА-2,6, ABA-0,5. Сжиженный аммиак вносят из расчета 30 кг на 1 тонну корма. Сжиженный аммиак вводят с подветренной стороны через гибкий шланг с металлической иглой. Иглу вводят в скирду через каждые 4−5 м на глубину 2−2,5 м на высоте 1−1,5 м от основания и выдерживают скирду 10 — 12 дней. Аммиачной водой обрабатывают из расчета 120 л — 25%, 150 л — 20% и 170 л — 17,5% на 1 т корма.

3. Обработка гидроксидом натрия (каустическая сода). Обработку проводят в бетонированных траншеях. Ванну заполняют 2−3% раствором каустической соды, в которую погружают на 2−3 мин. сено или солому, затем корм вынимают и складывают на наклонные плоскости вокруг ванны, выдерживают 24 часа и без промывания водой скармливают животным.

4. Обработка негашёной известью. На 100 кг соломенной резки расходуют 3 кг негашёной извести или 9 кг известкового теста, содержащего 4,5 кг извести — пушёнки, 50 кг воды и 1 кг поваренной соли. Известь разводят небольшим количеством воды в бочках, а затем при помешивании доливают её до 250−300 л. Полученное при этом известковое молоко переливают в чан или бетонированную ванну и помещают резку так, чтобы она была равномерно увлажнена, выдерживают 10 мин., вынимают и складывают на деревянные щиты; выдерживают 24 часа и скармливают коровам и нетелям до 10 кг, овцам — 1−2 кг, молодняку крупного рогатого скота — 4−6 кг в сутки.

5. Обработка кальцинированной содой. Готовят 5%-ный раствор: 15 кг соды растворяют в небольшом количестве теплой воды, затем объём доводят до 300 л и добавляют 1 кг поваренной соли. В раствор порциями закладывают резку, увлажняют и затем переносят на специальную площадку и выдерживают 24 часа. Скармливают корм без промывания водой.

Обезвреживание зернофуража

1. Обработка зерна кальцинированной содой. Кальцинированную соду растворяют тёплой водой в концентрации 4%. Приготовленным раствором увлажняют зерно и выдерживают в ёмкостях 24 часа, затем просушивают в сушильных агрегатах при температуре 180−200°С. На 100 кг зерна расходуется 8 л 4%-ного раствора кальцинированной соды.

2. Обработка зерна раствором пиросульфита натрия (калия). Готовят 10%-ный раствор пиросульфита натрия, которым увлажняют зерно из расчёта 8 л на 100 кг, выдерживают 48 часов, сушат при температуре 180−200°С.

3. Обработка зерна порошком пиросульфита натрия. Пиросульфит натрия добавляют к зерну в количестве 1,5% по массе, тщательно перемешивают на механических смесителях или вручную лопатой. Обработанное зерно выдерживают в ёмкостях 30 суток, после чего допускают к скармливанию в количестве 30% от нормы концентрированных кормов. Продолжительность скармливания не более 20 дней, обезвреженное зерно можно хранить не более 30 дней.

4. Обработка зерна высокой температурой. Слаботоксичный зернофураж обрабатывают на сушильных агрегатах АВМ, СБ, СЗПБ — 2 при температуре 300 °C при экспозиции 10−12 минут; если влажность зернофуража более 22%, то его пропускают через зерносушилку дважды.

5. Гранулирование. Слаботоксичные комбикорма, а также продукты переработки зерна обезвреживают гранулированием на всех видах прессов-грануляторов при давлении пара 4−5 атмосфер.

· Проваривание. Корма заливают водой в соотношении 1: 4 и проваривают в котлах в течение 1 часа с момента закипания воды.

· Пропаривание. Корма пропаривают в кормозапарниках или других ёмкостях при температуре 100 °C в течение 2 часов в 0,1%-ном растворе кальцинированной соды.

10. Терапия стахиботриотаксикоза

Радикальных методов лечения стахиботриотаксикоза нет. В случаях необходимости используют систематическую лекарственную терапию (детоксиирующие и вяжущие средства), которая эффективна в начальной стадии заболевания.

В первой стадии токсикоза больным животным промывают ротовую полость слабыми растворами танина, сульфата меди и маргонцевокислого калия, растворами риваноля, трещины на коже смазывают цинковой мазью. Из кормового рациона исключают подозреваемые на заражение грибами корма.

Во второй и третьей стадиях заболевания назначают промывание желудка больного животного теплым раствором диоксида натрия (питьевая сода) для адсорбирования токсина. Дают слабительные, лучше касторовое масло, а затем внутрь и в прямую кишку вводят отвар крахмала, слизистые отвары льняного семени, овса. Для ускорения заживания язв применяют дезинфицирующие и вяжущие средства: слабые растворы перманганата калия, раствор Люголя, растворы этакридина, антибиотики.

Рекомендуется комбинированное лечение: внутривенно вводят 10%-ный раствор хлорида натрия в дозе 100−200 мл с последующим подкожным введением 2−5 мл раствора адреналина (1:1000), затем внутривенно спустя 30−40 минут вводят раствор 10% йодида калия в дозе 20−60 мл. Хороший лечебный эффект получают при внутривенном введении лошадям стрептомицина и даче внутрь фталазола.

При расстройствах жедудочно-кишечного тракта больным животным назначают обволакивающие, слизистые, дезинфицирующие и противовоспалительные средства внутрь и в прямую кишку, промывание желудка водным раствором перманганата калия или раствором диоксида натрия.

При развивающейся лейкопении (в субклинический период) своевременное устранение влияния яда гриба может привести к полному восстановлению костномозгового кроветворения. Н. К Олейник, А. А. Майборода и В. И. Ротов рекомендуют лечить аммаргеном. Препарат вводят внутривенно в дозе 125−400 мл раствора аммаргена в разведении 1:2000 или 400−500 мл в разведении 1:4000.

Для предупреждения вредоносного действия секундарной инфекции, если она возникнет, полезно применять антибиотики. Пенициллин и особенно террамицин действуют антибактериально. Применять их следует в общепринятых дозировках в комбинации с симптоматическими средствами, регулирующими сердечную деятельность, работу желудочно-кишечного тракта и поднимающими общую реактивность организма.

Успех лекарственной терапии в первую очередь зависит от своевременно начатого лечения, от ухода за больными животными.

Заключение

Проблема заболевания стахиботриотоксикозом в настоящее время осталась.

Были произведены исследования по выявлению грибов, образующих микотоксины, субстратов, на которых они растут, условий роста грибов и образования токсинов, восприимчивых к токсинам животных и патологических изменений, вызываемых микротоксинами, по разработке методов обнаружения микотоксинов в кормах и продуктов питания, а также мер профилактики микотоксикозов.

С помощью чувствительных методов было показано, что токсины присутствуют во многих кормах и продуктах питания.

Установлены факторы, благоприятствующие развитию грибов в кормовых средствах.

Во избежание попадания микотоксинов в организм животного и человека в концентрациях, могущих нанести вред их здоровью, в ряде стран установлены предельно допустимые количества (ПДК) некоторых токсинов в кормах для животных и отдельных продуктах питания.

Проведение скирдования только сухой соломы, соблюдение агротехнических правил уборки и хранения грубых кормов, правильная транспортировка и приготовление кормов, рациональное орошение, правильное применение ядохимикатов и многое другое будут препятствовать развитию заболевания.

Список литературы

1. Грожевская С. Б. Общие сведения о микотоксикозах — Профилактика отравления сельскохозяйственных животных, вызванных грибной флорой. Пермский СХИ, 1981; с. 204−205

2. Джилавян Х. А. Микотоксикозы: диагноз и лечение — Ветеринария, 1981; с 68−71.

3. Иванов В. Г. Как предупредить микотоксикоз — Ветеринария, 1981;143 с.

4. Колычев Н. М. Ветеринарная микробиология и иммунология.-2003. с.385−388

5. Костенко Т. С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. — М.: Колос, 2001. с. 325−328.

6. Котик А. Н. Обнаружение стахиботриотоксикозов — Ветеринария, № 5, 1982; с. 165−167.

7. Кочанова С. П. Микотоксины и микотоксикозы сельскохозяйственных животных.- М.: ВНИИТЭИСХ, 1983.с. 132−145.

8. Саркисов А.X. Микотоксикозы. — М., 1954; с. 150−168.

9. Спесивцева Н. А. Микозы и микотоксикозы.- М.: Колос, 1975;378 с.

10. Спесивцева Н. А. Микозы и микотоксикозы.- М.:Сельхозизд, 1960;284 с.

11. Тетерев И. И. Микотоксикозы животных и их лабораторная диагностика.- Киров: ВГСХА, 2006; С. 13

12. Тимчук В. Ф. Токсические грибы на комбикормах.- М.:1982

13. Чулков А. Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2009;№ 9 с. 11;

14. Чулков А. Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2009 — № 10, с.13−27

15. Харченко С. Н. Справочник по микозам и микротоксикозам сельскохозяйственных животных. — Киев, Урожай, 1982 — с. 44−47

16. Хмелевская Б. П., Пилипец З. И. Профилактика микотоксикозов животных.- М. Агропромиздат, 1985.-272с