Дополнение 2.3. Электрическая активность одиночных Na+-и К+-каналов

В середине 1970;х гг. в Германии Эрвину Нееру и Берту Сакманну впервые удалось зарегистрировать работу одиночных Na⁺— и К⁺-каналов. Для этого ими был разработан и использован новый оригинальный метод, который получил название пэтч-кламп (англ, patch-clamp), — локальная фиксация потенциала с помощью электрода-присоски. Данная методика заключается в использовании в качестве электрода стеклянной микропипетки с утолщенными стенками и кончиком, диаметр которого составляет 1—2 мкм. При понижении давления в микропипетке она присасывается к поверхности клеточной мембраны таким образом, чтобы под кончиком пипетки оказался фрагмент мембраны, содержащий один ионный канал. Благодаря присасыванию электрическое сопротивление контакта между стенками микропипетки и мембраной оказывается очень большим (гигаомным). В результате ток, идущий через канал при деполяризации мембраны, не утекает и не теряется во внеклеточном пространстве и может быть зарегистрирован (рис. 2.30).

Рис. 2.30. Принцип регистрации работы одиночных ионных каналов

методом пэтч-кламп

Фиксируя потенциал на мембране, можно зарегистрировать с помощью нэтч-нинетки ток, текущий через одиночный канал, активированный деполяризацией. На рис. 2.31 показаны результаты эксперимента, в ходе которого мембрану 10 раз подвергали деполяризации до одного и того же уровня, регистрируя с помощью пэтч-пипетки ответные токи, возникающие при открывании одного и того же Ыа⁺-канала или К⁺-канала.

Были выявлены следующие закономерности:

• • ток, текущий через одиночный ионный канал, всегда имеет прямоугольную форму и одинаков по амплитуде при данном потенциале на мембране;
• • сам факт открытия канала и длительность его пребывания в открытом состоянии имеют вероятностный характер и зависят от величины мембранного потенциала и наличия потенциал-зависимой инактивации канала;
• • суммарный ток определяется вероятностью нахождения в открытом состоянии определенного числа каналов в каждый конкретный период времени.

Рассчитано, что один активированный натриевый канал пропускает за 1 мс 6000 катионов, создавая микроскопический (порядка 1 пА) транс;

Рис. 2.31. Пример регистрации работы одиночных потеициал-зависимых натриевых {а) и калиевых (б) каналов методом пэтч-кламп:

показаны 10 ответов одиночного канала на одну и ту же деполяризацию мембраны; ответы канала (ток) варьируют; внизу — интегральный ток, полученный суммированием ответов канала мембранный ток прямоугольной формы. Суммарный (интегральный) Na⁺-TOK через мембрану за это же время значительно больше по амплитуде (порядка 1 нА). Интегральный ток имеет плавные нарастание и спад, поскольку представляет собой сумму элементарных токов от тысяч одиночных Ыа⁺-каналов, открывающихся по вероятностному закону и подверженных инактивации (см. рис. 2.31, а).

При регистрации работы одиночного К~-канала тем же методом были обнаружены сходные закономерности его работы, за исключением инактивации, которой у К⁺-канала нет. Ток, текущий через одиночный К⁺-канал, имеет прямоугольную форму. Переход калиевого канала в открытое состояние и продолжительность пребывания в открытом состоянии носят вероятностный характер и зависят от величины деполяризации мембраны (рис. 2.31, б).

Потенциал-зависимый Са²⁺-канал, так же как натриевый и калиевый, работает по принципу «все или ничего», т. е. открывается только в ответ на деполяризацию мембраны. При этом проводимость открытого канала является величиной постоянной, не зависящей от деполяризации. Однако время пребывания Са²⁺-канала в открытом состоянии зависит не только от деполяризации мембраны, но и степени фосфорилирования канала внутриклеточными ферментами-протеинкиназами — такими, например, как ПК А, СаМКИ и др.

На рис. 2.32 показано, как кальциевый канал отвечает на повторяющуюся стандартную деполяризацию мембраны. В контроле число открытий канала и время его пребывания в открытом состоянии невелико. При сочетании деполяризации с действием норадреналина, увеличивающим образование цАМФ и активацию ПКА, число открытий канала и вероятность его пребывания в открытом состоянии возрастают.

Рис. 232. Пример регистрации активности одиночного потенциалзависимого кальциевого канала в кардиомиоците методом пэтч-кламн в ответ на деполяризацию мембраны (а) и деполяризацию в сочетании с действием норадреналина, повышающим уровень внутриклеточного цАМФ и активность нротеинкиназы А (б).

Таким образом, в структуре и свойствах потенциал-зависимых Са²⁺-каналов обнаруживается ряд принципиально важных общих черт с потенциал-зависимыми натриевыми и калиевыми каналами. Вместе с тем у кальциевых каналов имеются и весьма существенные отличия в механизмах их активации, инактивации и других свойствах.