Исследование физиологических свойств штаммов Аzotobacter chroococcum, выделенных из различных типов почв

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования

" НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И. ЛОБАЧЕВСКОГО"

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ Исследование физиологических свойств штаммов azotobacter chroococcum, выделенных из различных типов почв.

Дипломная работа Студентки 3 курса СФО Румянцевой Е.А.

Научный руководитель:

Доц., к. б. н. Речкин А.И.

Нижний Новгород

• Введение
• 1. Обзор литературы
• 1.1 Эколого-физиологическая характеристика бактерий рода Azotobacter
• 1.1.1 Систематическое положение бактерий рода Azotobacter
• 1.1.2 Цитоморфологическая характеристика и цикл развития бактерий рода Azotobacter
• 1.1.3 Особенности распространения азотобактера в разичных типах почв
• 1.2 Свойства азотобактера
• 1.2.1 Морфологическая характеристика
• 1.2.2 Строение нитрогеназной системы
• 1.2.3 Регуляция нитрогеназной системы
• 1.2.4 Основные физиологические свойства азотобактера
• 1.3 Взаимодействие азотобактера с высшими растениями и почвенными микроорганизмами
• 1.4 Влияние факторов внешней среды на характер роста и физиологическую активность бактерий рода Azotobacter
• 2. Материалы и методы исследования
• 2.1 Подготовка реактивов и питательных сред
• 2.2 Отбор почвенных проб
• 2.3 Подготовка образца к микробиологическому анализу
• 2.4 Выделение и идентификация выделенных культур азотобактера
• 2.4.1 Количественный учёт
• 2.4.2 Посев на агаризованные среды в чашке Петри
• 2.4.3 Выделение чистых культур азотобактера
• 2.4.4 Идентификация выделенных штаммов
• 2.5 Методы исследования закономерностей роста и цикла развития клеток Az. chroococcum
• 2.6 Определение чувствительности выделенных штаммов к различным антибиотикам
• 3. Результаты и их обсуждения
• Выводы
• Цитируемая литература

Микроорганизмам принадлежит главная роль в биогеохимических процессах круговорота элементов и веществ, протекающих в водных и наземных экосистемах. Эти процессы прямо или косвенно влияют на состав атмосферы Земли, поэтому ключевым условием поддержания жизни является обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ.

В течении последних десятилетий из-за интенсификации промышленного и с/х производства повсеместно усилилось загрязнение почвенного покрова различными химическими веществами. Многие из этих веществ даже в относительно низких концентрациях могут подавлять жизнедеятельность микроорганизмов и тем самым изменять существующее в природе биогеохимическое равновесие-гомеостаз. Наблюдается деградация почвенных экосистем, происходит динамическое уменьшение многообразия групп микроорганизмов (редуцентов), снижается не только количество, но и их физиологическая активность, нарушается структура биоценозов и биогеоценозов.

Выходом из сложившейся ситуации является кардинальное изменение стратегии с/х производства от глобальной «химизации» к повсеместной «биологизации». «Биологизация» -это возвращение в практику сельского хозяйства биопрепаратов из естественной почвенной микрофлоры.

В связи с этим возрастает роль физиологически значимых микроорганизмов, прежде всего в плане регуляции круговорота биогенных элементов (азота), таких как Azotobacter.

В биосфере он выполняет:

1. Деструктивную функцию, осуществляя уникальный процесс фиксации молекулярного азота, вовлекая его в биологический круговорот.

2. Средообразующую функцию, как за счёт азотофиксации, так и за счёт продукции биологически активных веществ (ауксинов, гиббериллинов, витаминов группы В, фунгицидных веществ).

На современном этапе важно определить физиологическое состояние существующих азотофиксаторов в разных типах почв, оценить их адаптационные возможности по отношению к действию различных факторов.

На основании вышеизложенного целью настоящей работы явилось исследование физиологических свойств штаммов Azotobacter chroococcum, выделенных из различных типов почв Нижегородской области.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Подготовка почвенных образцов, отобранных в различных регионах Нижегородской области.

2. Выделение и идентификация штаммов рода Azotobacter по ключевым культуральным и физиологическим признакам.

3. Изучение влияния природных и синтетических антибиотиков на рост выделенных штаммов Azotodacter.

1. Обзор литературы

1.1 Эколого-физиологическая характеристика бактерий рода Azotobacter

1.1.1 Систематическое положение бактерий рода Azotobacter

Отдел Gracilicutes

Класс Scotobacteria

Семейство Azotobacteriaceae

Род Azotobacter

Вид Az. chroococcum, Az. agile, Az. vineladii

В 1901 году голландский учёный Бейкеринк открыл Azotobacter — аэробную бактерию, способную фиксировать молекулярный азот (Шлегель, 1987).

При первых попытках классификации азотобактера особое внимание уделялось его филогенезу ввиду сходства с водорослями и бактериями. На филогенетическую связь азотобактера с водорослями указал Бейеринк, давший организму название Azotobacter chroococcum (точный перевод видового нзвания — коричневеющий кокк — отражает одновременно и его морфологические и культуральные особенности — округлую форму клетки и способность выделять коричневый пигмент), вследствии сходства с некоторыми представителями сине-зелёных водоослей (Шлегель, 1987).

1.1.2 Цитоморфологическая характеристика и цикл развития бактерий рода Azotobacter

Бактерин рода Azotobacter характеризуются своеобразными морфологическими свойствами, сочетающими признаки палочек и кокков. Клетки молодых культур (18−24-часового возраста) имеют форму утолщенных палочек с овальными концами. Чаще они бывают сцеплены попарно. Размеры их 2,5−6×1,5−3 мкм. Цитоплазма гомогенная, мелкозернистая, нуклеоид компактный, обычно располагающийся в центре клетки. Молодые клетки подвижны, движение осуществляется с помощью перитрихально расположенных жгутиков. Кроме жгутиков, на поверхности клетки располагаются нитевидные структуры — фимбрии, служащие агрегации клеток и прикрепления их к твердым субстратам (Колешко, 1981). На твердых питательных средах, не содержащих азотных соединений, азотобактер образует крупные прозрачные, слизистые, гладкие, иногда морщинистые колонии.

У молодых клеток азотобактера плазма мелкозернистая. При старении клетки азотобактера теряют свою подвижность, укорачиваются и принимают почти кокковидную форму. В плазме появляются зерна, резко преломляющие свет. Их природа различна (жировые капли, волютин, метахроматические включения и т. д.). В этот период времени клетка (или группа клеток азотобактера) покрываются толстой слизистой капсулой. Вещество капсулы состоит из полисахаридов и содержит около 0,023% азота. Ангидрид уроновой кислоты составляет до 75% слизи азотобактера. Слизеобразное вещество азотобактера относительно устойчиво к воздействию микроорганизмов. Установлено, что полисахариды азотобактера в комплексе с солями меди и железа дают трудно разлагаемые микроорганизмами соединения. В старых культурах азотобактера могут быть найдены гигантские клетки шаровидной формы. Встречаются также очень мелки, до 0,2 мк в диаметре. Старение культур азотобактера сопровождается образованием пигмента, поэтому в зависимости от вида цвет микроорганизма может колебаться от свето-желтого до темно-коричневого (Az. chroococcum), от зеленовато-желтого флуоресцирующего (Az. agile), до розово-фиолетоваго флуоресцирующего (Az. vinelandii). Пигментообразование и интенсивность цвета зависят также от состава питательной среды и условий роста культуры (Блинков, 1959; Зайцева, 1965; Мишустин, Шильникова, 1968). Грам-, каталазоположительные, хорошо растут в аэробных условиях, оптимальная температура между 25^0-30⁰С, пределы pH 7,0−7,5 (Берги, 1997).

1.1.3 Особенности распространения азотобактера в разичных типах почв

Азотобактер развивается при наличии простых органических соединений, достаточной увлажнённости почвы, с нейтральной реакцией, а также наличии в них фосфор, кальция и ряда микроэлементов (в частности молибдена, магния и железа). Высокая требовательность к внешним факторам делает распространение азотобактера весьма ограниченным (Гиляров, Криволуцкий, 1985).

В целинных подзолах и дерново-подзолистых почвах азотобактер практически отсутствует. Это бедные гумусом (0,3−0,5%), имеющие кислую реакцию почвы, непригодные для существования данного микроорганизма. При окультировании условия для развития азотобактера улучшаются; органические и минеральные фосфорные удобрения стимулируют размножение азотобактера, а азотные минеральные в высоких дозах — подавляют его рост (Гиляров, Криволуцкий, 1985).

В кислых подзолистых почвах бактерия практически не встречается, а выделенные немногочисленные колонии оказываются ослабленными.

В серых лесных почвах в летний период, когда почва в достаточной степени увлажнена и устанавливается благоприятный температурный режим, количество азотобактера имеет наибольшее значение.

Считается, что светло-серые лесные почвы близки по свойствам к дерново-подзолистым, поэтому предполагается что и степень распространения в них азотобактер также равна, темно-серые же почвы по органическому составу близки к оподзоленным и выщелоченным чернозёмам (Звягинцев, 1987).

В почвах с повышенной степенью увлажнения и преобладанием луговой растительности азотобактер обычно встречается в течение всего вегетационного периода. К подобным почвам относятся почвы пойм, имеющие в подзолистой зоне благоприятную реакцию среды и относительно высокое содержание питательных веществ.

Болотно-низинные почвы нередко содержат азотобактер, но, вследствие неблагоприятного воздушно-водного режима, а также недостатка фосфора, кальция и микроэлементов этот микроорганизм здесь размножается слабо (Звягинцев, 1987).

В низинных целинных торфяниках азотобактер обнаруживается редко, а в верховных не встречается совсем, в связи с их сильным закислением. Окультуривание торфяных почв улучшает условия для размножения, но некоторые торфа токсичны для азотобактера (Мишустин, Шильникова, 1968).

Чернозёмы отличаются высокой активностью микробиологических процессов. Наиболее интенсивно они протекают весной и рано летом, когда почва имеет благоприятный температурный режим и достаточный запас влаги. Это нейтральные или слабощелочные почвы с высоким содержанием солей кальция и магния. Черноземные почвы более северных районов содержат азотобактер в течение всего вегетационного периода. В зоне обычных и южных черноземов данный микроорганизм встречается реже, так как в летний период эти почвы не так богаты органическими остатками. Наиболее часто азотобактер встречается в черноземных почвах лугов долин рек. Наиболее благоприятными оказывается лучше, чем в оподзоленных (Гиляров, Криволуцкий, 1985).

В целинных и неполивных, окультуренных каштановых почвах данный микроорганизм встречается лишь весной, с наступлением засушливой погоды его обнаружение очень затруднено.

В целинных почвах сероземной зоны, а также в степных солонцах азотобактер развивается в основном как весенний эфемер. По мере возрастания засоленности почв данный микроорганизм встречается реже.

Отмечено, что данный род бактерий более чувствителен к содовому засолению и менее к сульфатно-хлоридному (Мишустин, Шильникова, 1968).

Сильно окультуренные подзолистые почвы, образованные на суглинках, имеют благоприятный водно-воздушный режим, слабокислую реакцию (рН=5.5) чем обеспечивается активная деятельность полезной почвенной микрофлоры, в том числе и азотобактера (Мишустин, Шильникова, 1968).

В тропической зоне в достаточно увлажненных почвах наблюдается низкий показатель значения рН. В этих районах азотобактер замещается на более кислотоустойчивый микроорганизм Beijrinkia.

В хорошо окультуренных огородных почвах азотобактер обычно находиться в значительных количествах (Мишустин, Шильникова, 1968).

Таким образом, азотобактер может служить индикатором степени окультуренности почвы (Anderson, 2003).

1.2 Свойства азотобактера

1.2.1 Морфологическая характеристика

Азотобактер — аэробный почвенный микроорганизм, сочетающий в себе морфологию палочек и кокков.

Клетки молодых культур (вплоть до 2х суток культивирования) имебт форму палочек с закругленными концами, чаще расположены попарно. Молодые клетки подвижны, вследствие наличия на ее поверхности перитрихально расположенных жгутиков. Прикрепление бактерий, а также их агрегация осуществляется за счёт наличия нитевидных структур — фимбрий (Lin, Stewart, 1998).

Размеры клеток варьируют — 2,0−7,0×1,0−2,5 мкм. В отдельных случаях длина клеток достигает 10−12 мкм. Размножение азотобактера происходит путём простого деления клетки с образованием поперечной перегородки, иногда наблюдается перешнуровывание. В пределах рода существуют характерные распределения клеток видов азотобактера при его делении:

Клетки Az. chroococcum в начале деления располагаются концентрически, причем клетки агрегируются чаще по две. При дальнейшем делении формируются радиально расположенные ряды клеток, а также слоистость образуемой колонии. В процессе старения приобретают морфологию кокков — они округляются.

Клетки Az. vinelandii на начальных этапах формирования колонии располагаются радиально и сохраняют такое расположение на всем протяжении развития.

Клетки Az. agilis продуцируют большое количество слизи, за счёт чего колонии имеют выпуклое строение. Количество клеток в колонии значительно меньше двух предыдущих видов с расположением определенной закономерности — звездчато — рассеянный тип строения (Колешко, 1981).

Содержание ДНК в клетках азотобактера значительно ниже, чем у других видов бактерий и колеблется в пределах 0,81−0,70%. У молодых клеток азотобактера плазма мелкозернистая.

При старении клетки теряют подвижность, укорачиваются и приобретают почти кокковидную форму. В плазме появляются зерна, резко преломляющие свет. Природа этих включений различна (жировые капли, волютин, метахроматические включения и др.). В этот период времени клетки азотобактера покрываются толстой слизистой капсулой. Если капсула на поверхности клетки уплотняется, то по внешнему виду она становится похожей на хламидоспору низших грибов. Вещество капсулы состоит из полисахаридов и содержит около 0,023% азота. Ангидрид уроновой кислоты составляет до 75% слизи азотобактера. Слизеобразное вещество делает бактерию относительно устойчивой к воздействию микроорганизмов (Колешко, 1981). В старых культурах могут быть найдены гигантские клетки шаровидой формы, а также клетки очень мелких размеров (до 0,2 мкм в диаметре и мельче). При благоприятных условиях эти микроскопические клетки начинают развиваться и дают клетки нормальной величины (Шлегель, 1987).

Такое многообразие форм азотобактера в значительной степени определяется плейоморфизмом этой бактерии, а также зависит от состава среды.

Azotobacter на твердых питательных средах, не содержащих азотных соединений, образует крупные слизистые, иногда морщинистые колонии. При старении колонии данного микроорганизма приобретают характерную окраску за счет образования пигмента. Пигментообразование является одним из признаков систематики видов (Aquilanti, Favilli, 2004).

Для Az. agilis и Az. vinelandii характерно образование растворимых в воде флуоресцирующих пигментов желто-зеленого цвета. Клетки Az. chroococcum при старении накапливают меланоидные нерастворимые в воде пигменты, окрашивающие колонии в цвет от буро-коричневого до черного (Aquilanti, Favili, 2004).

1.2.2 Строение нитрогеназной системы

Характерной особенностью азотобактера является его способностью наряду со связанными формами азота усваиват молекулярный азот. Размер азотонакопления зависит прежде всего от свойств того или иного штамма азотобактера. По этому признаку различаются активные и пассивные культуры. В некоторых случаях под влиянием неблагоприятных условий среды азотобактер может терять способность усваивать молекулярный азот (Мишустин, Емцов, 1987).

Большинство культур азотобактера усваивает не более 10 мг молекулярного азота на 1 г потребленного источника углерода. Отдельные штаммы Az. chroococcum фиксировали до 15 мг азота на 1 г использованной глюкозы (Мишустин, Емцов, 1987).

Молекула атмосферного азота очень инертна, для разрыва 3-х ее химических связей необходимо затратить 225 ккал/моль.

При промышленном получении аммиака из N₂ затрачивается большое количество энергии, даже в присутствии катализаторов требуется повышение температуры до +500єС и давление до 300−350 атм., в то время как все процессы азотофиксации в клетке, идут при физиологических значениях температуры, низких давлениях и без загрязнения среды обитания. Биохимический механизм фиксации молекулярного азота воздуха сходен у всех диазотрофов. В основе его лежит процесс восстановления N₂ по уравнению:

N₂+6e^-+6H⁺>2NH₃

Реакция эта в клетке проходит при участии фермента нитрогеназы, расположенного на внутренних клеточных мембранах. Кроме того, для фиксации N₂ необходимы сильные восстановители (поток электронов), АТФ и Mg^{2+ (}Глик, Пастернак, 2002).

Нитрогеназа — сложный ферментативный ансамбль, состоящий из комплекса двух белков: Mo-Fe-белка (молибдоферредоксин) и Fe-белка (азотоферредоксина). Mo-Fe-белок — это тетрамер, содержащий 2 атома молибдена, негемовое железо и лабильный сульфид. Fe-белок является димером, тоже содержит негемовое железо и лабильный сульфид (Анисимова, 1986).

В процессе фиксации АТФ взаимодействует с азоферредоксином. При этом выделяется АДФ, а азоферредоксин претерпевает конформационную перестройку, вследствие чего его окислительно-восстановительный потенциал понижается с — 280 до — 400 мВ. Азоферредоксин становится сильным восстановителем, предает электроны на молибдоферредоксин, где и осуществляется восстановление N₂ до NH₃. Суммарно процесс фиксации азота можно выразить реакцией

N₂+6e^-+12АТФ+12Н₂О-2NH₄⁺+12 АДФ+12Н₃РО₄+4Н⁺

Нитрогеназа обладает широкой субстратной специфичностью, кроме азота она может восстанавливать цианиды, закись азота, ацетилен и др.

Нитрогеназа при участии АТФ катализирует также восстановление ионов водорода с образованием молекулярного водорода (Lin, Stewart, 1998).

Нитрогеназа — анаэробный фермент, инактивирующийся в присутствии кислорода воздуха. Он повреждает оба белка, хотя наиболее чувствителен к нему Fe-белок. Чувствительность белков нитрогеназы к О₂ определяется главным образом чувствительностью их металлоцентров, участвующих в связывании субстрата и переносе электронов. При взаимодействии нитрогеназы с О₂ может происходить 4-х ступенчатое восстановление О₂ с образованием супероксида, Н₂О₂ и синглетного кислорода. Ферредоскины и флаводоксины, переносящие электроны на нитрогеназу также могут поддвергаться необратимым окислительным повреждениям (Готтшалк, 1982).

Азотобактер относиться к облигатным аэробам. При избыточном количестве кислорода начинает резко интенсифицировать процессы дыхания, как бы стараясь выбрать весь кислород и обеспечить выполнение ею функций азотофиксации. Процесс этот малопродуктивен и кончается снижением азотофиксирующей активности. Ещё одним способом защиты от кислорода воздуха является конформационное изменение нитрогеназы с особыми FeS-белками, в результате чего повышается ее стабильность в присутствии кислорода (Громов, Павленко, 1989).

1.2.3 Регуляция нитрогеназной системы

Общее свойство всех препаратов нитрогеназы — их чувствительность к присутствию кислорода. Фермент необратимо ингибируется кислородом поэтому фиксацию азота можно называть строго анаэробным процессом. Для защиты нитрогеназы от повреждения кислородом у таких аэробов, как представители рода Azotobacter, существует два механизма.

1. Дыхательная защита. Бактерии, относящиеся к роду Azotobacter, обладают очень активной разветвленной дыхательной системой. В одной из ветвей цепи переноса электронов имеются три пункта сопряженного фосфорилирования; в двух других — только один такой пункт. Поэтому при увеличении концентрации кислорода скорость дыхания микроорганизмов может повышаться за счет частичного разобщения фосфорилирования. Это приводит к потере NADH₂, но зато нитрогеназа защищается при этом повреждения кислородом.

2. Конформационная защита. Осуществляется за счет конформационных изменений в молекуле фермента и ассоциации с защитными белками (Готтшалк, 1982).

Много исследований посвящено вопросу о влиянии на азотофиксацию связанных форм азота, так, например, малые дозы селитры не только не снижают, но даже нередко стимулируют фиксацию, но по мере повышения конценрации селитры фиксации азота понижается. При содержании 24 мг нитратного азота на 100 мл среды связывание азота уже не происходит, аналогично нитратам влияют на азотофиксацию и аммонийные соли, а при длительном культивировании азотобактера в присутствии азотистых соединений, он теряет свою способность усваивать азот атмосферы (Блинков, 1959). Дело в том, что ионы аммония подавляют синтез нитрогеназы. В регуляции образования нитрогеназы большую роль играет глутаминсинтетаза. Глутаминсинтетаза и глутаматсинтетаза нужны бактериям для включения ионов аммония в органические соединения в том случае, если ионы присутствуют лишь в низкой концентрации. Эта система обладает высоким сроством к ионам аммония, и поддерживает их концентрацию в клетке на низком уровне. Повышение концентрации ионов аммония в окружении клетки (а тем самым и внутри клетки) подавляет образование глутаминсинтетазы, а в результате — и нитрогеназы.

1.2.4 Основные физиологические свойства азотобактера

К основным физиологическим свойствам бактерий рода Azotobacter относится его резко выраженная способность усваивать азот атмосферы. Большинство штаммов усваивают не более 10 мг азота на 1 г. Потребляемого источника углерода, некоторые штаммы азотобактера способны фиксировать до 15 мг азота на 1 г глюкозы (Самсонов, 1987).

Азотобактер является полифагом, в качетсве источника углерода может использовать моно-, ди — и полисахариды, органические кислоты жирного и ароматического ряда, летучие органические соединения (пары этилового спирта, ацетона), но предпочтительным энергетическим материалом являются однои многоатомные спирты: этиловый, бутиловый. Отдельные штаммы и даже виды азотобактера по-разному относится к источнику углерода, — так можно встретить штаммы, не ассимилирующие лактозу, маннит, бензойную кислоту и др. если в среде несколько источников углерода, то они используются в порядке доступности (Мишустин, Шильникова, 1968).

Культура азотобактера образует значительное количество биологически активных веществ, среди них витамины группы В, гормоны растений (гиббереллины, цитокинины, ауксины (в частности, индолил-3-уксусная кислота (ИУК)) (Воробьева, 1982; Мишке, 1988).

Было установлено, что Az. chroococcum на 10-е сутки ферментации выделяет в культуральную жидкость в количестве 5 мкг/мл, а на 17-е сутки-20 мкг/л гиббереллин подобных веществ. Сам гиббереллин к концентрации 0,1−100 мкг/мл не оказывает влияния на размножение азотобактера, но имеются сведения о повышении азотофиксирующей способности при добавлении гиббереллина (Мишке, 1988).

Важнейшим природным ауксином является индолил-3-уксусная кислота. Данный фитогормон был обнаружен в бактериях, грибах, низших и высших растениях (Гамбург, 1990). Для образования ауксина грибы и бактерии нуждаются в питательной среде, содержащей глюкозу, а также необходимо присутствие триптофана, тирозина и других аминокислот. Несмотря на то, что культуры сами выделяют биологически активные вещества, внесение их в среду ускоряет процесс роста азотобактера. Под влиянием регуляторов роста увеличивается также и продуктивность азотофиксации (Мишке, 1988).

Весьма важное свойство азотобактера заключается в том, что он вырабатывает фунгистатическое вещество, представляющее собой метиловый эфир алифатической тетраеновой кислоты, содержащей гидроксильную и В-метильную группы. Обнаруженный антибиотик-азохроомицин, по данным Н. И. Придачиной, активен против значительного числа фитопатогенных грибов. Благодаря описываемому свойству при бактеризации азотобактером в ризосфере угнетается развитие микроскопических грибов, многие из которых задерживают рост растений. Так, культура Az. chroococcum снимает угнетающее действие фитотоксичного гриба Alternaria на кукурузу, а рост не заряженного растения стимулирует.

1.3 Взаимодействие азотобактера с высшими растениями и почвенными микроорганизмами

Жизнедеятельность азотобактера осуществляется в зоне окружающей корень растения — ризосфере. Ризосферу (с окружающей ее почвой) растений можно рассматривать как своеобразный проточный культиватор микроорганизмов, где наблюдается высокая активность естественно смешанных культур микроорганизмов. В ризосфере сталкиваются метаболические процессы клеток микроорганизмов и клеток корневых систем растений. На поверхность корневой системы и наземных частей растений во время их жизни, выделяются различные органические соединения, синтезированные растительным организмом. Это явление называется экзоосмосом. (Мишустин, 1972).

Количественные соотношения ризосферных микроорганизмов формируются на пищевой базе корневых выделений. Ризосферный эффект (отношение числа микроорганизмов в зоне корня к числу микроорганизмов в почве) служит подтверждением обилия питательных веществ в корневых выделениях. Чем более развитых фотосинтезирующим аппаратом обладают растения, тем больше транспортируют энергетических веществ в прикорневую зону. Тем выше уровень несимбиотической азотфиксации в ризосфере и больше азотсодержащих соединений поступает в прикорневую область (Шильникова, Серова, 1983).

В свою очередь азотобактер оказывает стимулирующее действие на прорастание семян растений и ускорение их роста (что особенно важно в ранние фазы их развития) за счет продукции биологически активных веществ (ауксинов, витаминов, гибереллинов). Синтез азотобактеров ростовых веществ может иметь существенное значение для растений, произрастающих в условиях недостаточной влажности (Шильникова, Серова, 1983).

Как указывает Федоров М. В., благодаря воздействию на растение ростовых веществ, происходит быстрое удлинение зародышевого корня, позволяющего ему уходить из пересыхающего горизонта вглубь почвы, где лучшие условия снабжения влагой (Федоров, 1963).

Кроме того обнаружена антогонистическая активность по отношению к возбудителям болезней растений. Азотобактер обладает фунгистатическим действием, за счет продукции антибиотических веществ, задерживающих развитие плесневых грибов (Клешко, 1981).

Кроме растений на жизнедеятельность азотобактер могут оказывать влияние и почвенные микроорганизмы. Обнаружено наличие так называемых бактерий — спутников, которые содержатся в слизи, выделяемой азотобактером. Одним из представителей является Pseudomonas radiobaster. Развиваясь безазотистой среде, он обладает способностью фиксировать молекулярный азот. За счет деятельности протеолитических и амилолитических ферментов Ps. radiobacter активирует биохимическую активность азотобактера (Мишустин, Шильникова, 1968).

Стимулирующий эффект оказывают некоторые бактерии из родов Pseudomonas и Mycobacterium.

Сильными антагонистми азотобактера являются Bacillus subtilis, Bacillus cereus, грибы родов Penicillium и Aspergillus, которые задерживают или полностью подавляют его развитие на питательных средах в первые сутки культивирования (Мишустин, Шильникова, 1968).

Среди почвенных микроорганизмов плесневые грибы составляют основную массу активных антаганистов — 40−80%. Их численность и активность возрастают в летний период в связи с понижением влажности почвы. В весенний период большую долю антаганистов составляют бактерии (до 40%) (Колешко, 1981).

1.4 Влияние факторов внешней среды на характер роста и физиологическую активность бактерий рода Azotobacter

На рост и развитие азотобактера огромное влияние оказывают условия внешней среды.

Концентрация ионов водорода, определяющая активность срды, оказывает влияние н разные стороны жизнедеятельности микроорганизмов.О. И. Колешко с сотрудниками (1981) изучал характер роста и азотофиксацию Az. chroococcum при различных значениях рН среды. Полученные данные показали, что сильнокислая среда (рН 5,5−5,29) оказала губительное действие на развитие азотобактера в первые же сутки роста. Гораздо меньше сказывается действие щелочной среды — увеличивается время генерации, сокращается число делений клеток в сутки, численность популяции возрастает незначительно.

Повышенная кислотность и щелочность среды отрицательно сказывается на интенсивности потребления энергетического материала и продуктивности азотофиксации.

Физиологические и биохимические процессы протекают весьма неравномерно: чрезвычайно слабо в сильно килой среде, удовлетворительно в слабо-кислой и сильнощелочной (рН 5,8; 9,12), относительно хорошо при рН 8,05−8,29 и наиболее интенсивно при рН=7,2−7,4. Таким образом кислые среды по сравнению со щелочными менее благоприятны для развития азотобактера (Колешко, 1981).

По отношению к температуре азотобактер типичный мезофил. Темературный оптимум его развития соответствует 25−30єС, максимальный — 35−37єС, минимальной температурой, при которой ещё возможно развитие данных бактерий, лежит в диапозоне 5−10єС. Азотобактер переносит пониженные температуры лучше, чем повышенные. По данным О. И. Колешко (1981) показано, что при температуре 5єС заметного развития в культурах не происходит и численность популяции держится на одном уровне. При 20єС число клеток в культуре значительно увеличивается. Однако максимальная скорость роста азотобактера наблюдается при 30єС. При 40єС у Az. chroococcum сокращается цикл развития. Высокая и низкая температуры снижают интенсивность не только роста и размножеия, но и использование энергетического материала, а также продуктивность азотофиксации.

Жизнедеятельность азотобактера в естественной среде тесно связана с наличием влаги. Его потребность во влаге приравнивается к потребности высших растений. Оптимальная влажность для развития азотобактера в почве соответствует 60−80% полной влагоемкости. Иссушение почвы оказывает губительное влияние на жизнедеятельность микроорганизма. Это обусловлено не только тем, что в данных условиях азотобактер лишен возможности потреблять воду, но и потерей ее из собственных клеток. В высушенном состоянии микроорганизмы неактивны. У них прекращаются или предельно замедляются все процессы метаболизма, происходит торможение жизнедеятельности. Степень торможения и потеря жизнеспособности зависит от уровня остаточной влажности в клетках и индивидуальных свойств культуры, которые определяются их ксерочувствительностью. Азотобактер обладает повышенной ксерочувствительностью в зоне остаточной влажности 20−30%. Обезвоживание биомассы азотобактера до 60−70% остаточной влажности существенно не сказывается на жизнеспособности. Дальнейшее обезвоживание вызывает значительное отмирание клеток. При остаточной влажности 20% и ниже, жизнеспособное состояние сохранялось только у 8,9−2,6% клеток. Этот уровень можно считать пороговым (Колешко, 1981).

На развитие азотобактера в почве и его азотофиксацию оказывает большое влияние минеральный состав почвы. Например, отсутствие или недостаток фосфора уменьшает развитие культуры и азотофиксацию. В определенных условиях азотобактер может использовать фосфолипиды как источник фосфора. Гидролиз фосфолипидов осуществляется с помощью фосфолипаз, а образующиеся эфиры фосфорной кислоты расщепляются фосфотазами. Однако фосфолипазная активность азотобактера довольно низкая.

Из микроэлементов наиболее значимым является молибден, т.к. входит в состав нитрогеназы. Клетки азотобактера, как жизнедеятельные, так и покоящиеся, поглощают молибден из среды, причём растущие клетки поглощают значительнее активнее чем старые. Для азотобактера установлена необходимая концентрация молибдена в виде соли Na₂MoO₄10−100 мг/л.

Для нейтральных почв требуемая концентрация молибдена больше, чем для кислых, потому что соли молибдена здесь уже растворены и доступны микроорганизмам (Львов, 1983, 1989). Ванадий оказывает положительное влияние на азотофиксацию, он может частично заменять молибден для некоторых азотофиксаторов, но не оказывает влияние на азотобактер. Бор стимулирует размножение микроба и процесс азотофиксации в концентрации 0,005%. Он является полезным, но не жизненно необходимым. В железе потребность невелика, но стимулирует синтез флуоресцирующего пигмента, локализуемом в цитоплазматической мембране клетки. Бром угнетает азотофиксацию (Мишустин, Шильникова, 1968).

Азотобактер аэроб и аэрация благоприятствует его размножению, поэтому в природных условиях почва должна быть уплотнена в пределах 1,2−1,4 г/см. установлено, что при наличии 4% О₂ в атмосфере усваивается азота в 3 раза больше, чем при 10−20% и было высказано мнение, что азот и кислород могут конкурировать в качестве конечных акцепторов Н⁺, азотфиксация представляет одну из форм дыхательного процесса (Бачинская, 1979).

Азотофиксаторы не живут изолированно. Они тесно связаны с другими живыми существами, входящими в состав биоценозов и окружающей их природной средой, их активность не прекращается даже зимой, благодаря чему к началу весенних полевых работ в пахотном слое восстанавливается до 40% азотных соединений (Самсонов, 1987).

2. Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили образцы почв, а так же культуры азотобактера, выделенные из них.

В работе было исследовано 17 образцов различных типов почв Нижегородской области и выделено 6 культур азотобактера (таб. 1).

Пробы почвы:

№ 1 Чернозем оподзоленный (Арзамасский район)

№ 2 Светло-серая лесная (Вадский район)

№ 3 Серая лесная (Дальне-Константиновский район)

№ 4 Темно-серая лесная (Арзамасский район)

№ 5 Подзолистая почва (Дзержинский район)

№ 6 Дерново-карбонатная (Дальне-Константиновский район)

№ 7 Серая лесная (Дальне-Константиновский район)

№ 8 Болотно-черноземная (Дальне-Константиновский район)

№ 9 Дерново-подзолистая (Сосновский район)

№ 10 Выщелоченный чернозем (Дальне-Константиновский район)

№ 11 Подзолистая (Сосновский район)

№ 12 Дерново-подзолистая (Сосновский район)

№ 13 Пойма реки Сережа (Арзамасский район)

№ 14 Болотно-подзолистая (Сосновый лес)

№ 15 Болотная (Верховое болото)

№ 16 Пойма озера

№ 17 Сильноокультуренная подзолистая почва, образованная на суглинках

Таблица 1

Типы почв, содержащие бактерии рода Azotobacter.

2.1 Подготовка реактивов и питательных сред

Для культивирования азотобактера использовались

1. Элективная питательная среда Эшби следующего состава (г/л): К₂НРО₄-0,2, MgSO₄-0,2, NaCl-0,2, K₂SO₄-0,1, маннит-20,0, СаСО₃-5. Вода водопроводная до 1 л. приготовленную среду (без маннита) стерелизуют автоклавировнием при 1 атм. в течение 20 минут, после добавления маннита ещё 20 минут при 0,5 атм. Для получения твердой питательной среды Эшби добавляют 1,5% агар-агара.

2. Для получения жидкой культуры азотобактера использовалась элективная безазотистая питательная среда Берка следующего состава (г/л): К₂НРО₄-0,8; КН₂РО₄-0.2; MgSO₄-0,2; CaCl₂-0,1; FeSO₄-0,005; Fe (SO₄) ₃-0,005; NaMoO₄-0,005; лимоннокислый натрий — 0,5; сахароза — 20,0. К₂НРО₄, КН₂РО₄, СаСl₂ растворяли отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды и стерилизовали. Эти компоненты прибавляли к основной среде в охлажденном виде во избежание образования осадка. В среду вносили триптофан (0,4г/л) в качестве предшественника синтеза ИУК. В некоторых вариантах эксперимента в среду добавляли экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) в количестве 500 мг/л, как стимулятор роста.

Приготовленную среду (без сахарозы) стерилизуют автоклавированием при 1 атм. В течение 20 минут, после добавления сахарозы ещё 20 минут при 0,5 атм.

Для идентификации выделенных культур использовались следующие среды:

выявление способности использовать углеводы (рамноза) и сахароспирты (маннит). Состав среды: основной фон 0,5% пептона, 0,1% К₂НРО₄, 1% углевода, индикатор бромкрезолпурпур 2 мл 1,6% спиртового раствора на 1 л среды. Среду разливают в пробирки по 9 мл и стерилизуют автоклавированием при 1 атм. Затем добавляют углерод и стерелизуют 30 мин. при 0,5 атм. Индикатор добавляют перед посевом.

выявление способности к гидролизу крахмала. Состав среды: пептон — 1,0 г; крахмал-0,2; КН₂РО₄-0,5 г; агар-агар-1,5 г; вода — до 40 мл, рН среды 6,8−7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм.20 мин., затем добавляют углевод и стерелизуют 30 мин. при 0,5 атм.

2.2 Отбор почвенных проб

Пробы брались чистым инструментом с верхнего слоя почвы. Материал исследования помещали либо в стерильную банку с ватной пробкой. Для каждой пробы писалась подробная этикетка, обозначающая дату взятия образца и место.

2.3 Подготовка образца к микробиологическому анализу

Хорошо перемешанную почву засыпают на сухое стерильное стекло, раскладывая ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляют корешки и другие посторонние включения. Непосредственно перед работой пинцет прокаливают в пламени и слегка остужают на воздухе. Из очищенной почвы для удобства проведения дальнейших отбирают небольшие порции.

2.4 Выделение и идентификация выделенных культур азотобактера

Накопительные культуры азотобактера получают, используя в качестве посевного материала непосредственно почву. 50 мг почвы увлажняют до пастообразного состояния и с помощью бактериологической петли раскладывают 20−25 комочков на поверхность среды в чашку Петри. Для удобства под дно чашки подкладывают трафарет. Закрытые чашки помещают во влажную камеру, которую выдерживают в термостате при температуре 28−30єС в течение 2−4 суток. Вокруг комочков должны появиться слизистые колонии, которые пересеваются на скошенный агар для дальнейшего анализа. Метод почвенных комочков является наиболее удачным, так как он наиболее приближен к естественным условиям (Aquilanti L., Favilli F., Clementi F., 2004).

2.4.1 Количественный учёт

Приготовление разведений

Почва — материал, имеющий обильную микрофлору. Для выделения из него культуры исследуемого микроорганизма необходимо приготовление последовательных разведений. Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных частиц проб поддвергают специальной обработке. Навеску почвы массой 1 грамм помещают в колюу со 100 мл водопроводной воды. Колбу с почвенной суспензией стряхивают на качалки в течение 5 минут (150 об/мин).

После этого суспензия должна отстояться (30 секунд), чтобы осели крупные частицы и тотчас же используют ее для приготовления дальнейших разведений, при этом учитывается, что в полученной исходной суспензии исследуемый материал разведен в 100 раз (второе разведение).

Стерильный раствор NaCl (0,5%) разливают стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Стерильной пипеткой переносят 1 мл почвенной суспензии в пробирку с 9 мл раствора NaCl, получая разведение 10³, так как исследуемый материал в ходе подготовки к микробиологическому анализу уже был разведен. Суспензию полученного разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая и выпуская полученную взвесь. Эту процедуру продолжают 3−5 раз, что обеспечивает перемешивание почвенной суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку-это четвертое разведение (10⁴).

2.4.2 Посев на агаризованные среды в чашке Петри

Накопительные культуры азотобактера получают на среде Эшби. В качестве энергетического материала используется сахароза, как наиболее легкодоступная форма органического субстрата. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную агаризованную среду по 10−20 мл в каждую. Посев делают из разведений 10², 10³, 10⁴. Стерильной микропипеткой наносят 0,05 мл почвенной суспензии соответствующего разведения на поверхность агаровой пластинки. Этот объем раствора распределяют по поверхности среды шпателем. Затем этим же шпателем проводят по поверхности второй чашки. Куда посевной материал внесен. Чашки с засеянными средами помещают в термостат при температуре в 26єС на 2 суток.

2.4.3 Выделение чистых культур азотобактера

Изолированные колонии рассевали методом истощающегося штриха, предварительно приготовив фиксированный препарат для подтверждения чистоты выделенной культуры и изучения морфологии клеток.

2.4.4 Идентификация выделенных штаммов

Идентификацию выделенных штаммов проводили по комплексу ключевых признаков согласно определителю Берги (1997)

Ключевые признаки для дифференцировки бактерий рода Azotobacter (Bergey, 1997)

2.5 Методы исследования закономерностей роста и цикла развития клеток Az. chroococcum

При исследовании закономерностей роста культуры Az. chroococcum использовалась твердая питательная среда Эшби. Чашки засевались суспензией данных микроорганизмов (ОП=0,27−0,30) в количестве 0,1 мл и термостатировались при 26єС в течение 24 часов. Отбор проб производился через каждые 2 часа, путем смысла клеток с поверхности среды 4 мл воды и определялась оптическая плотность суспензии на ФЭКе при л=590 нм.

Параллельно исследовался цикл развития микроорганизма, для этого готовились препараты живых и фиксированных клеток.

Прижизненное исследование микроорганизма производилось с целью изучения его морфологии и подвижности. Для этого использовался: препарат «раздавленная капля». На предметное стекло наносим каплю воды, в нее помещаем исследуемые микроорганизмы, перемешиваем и покрываем покровным стеклом, микроскопируют, как правило, сухой системой.

Препарат фиксированных окрашенных клеток служил для выявления морфологических изменений в цикле развития Az. chroococcum, а также слизи и капсул, образующихся при старении клеток азотобактера.

Культивирование клеток азотобактера проводили в жидкой среде Берка, для исследования нарастания биомассы клеток и синтеза ИУК. В качестве посевного материала использовалась двухсуточная культура азотобактера, выращенная предварительно на плотной среде Эшби. Клетки смывали средой Берка. Культивирование проводили при 26 єС на качалке 110 об/мин. Пробы отбирали каждые 2 часа. Определяли оптическую плотности (ОП) бактериальной суспензии на ФЭКе при л=590 нм. Значения ОП переводили затем в число клеток в 1 мл., далее строили кривую. Параллельно определяли количество накопленной ИУК.

2.6 Определение чувствительности выделенных штаммов к различным антибиотикам

Бактериальную суспензию объемом 5 мкл приготовленную по стандарту мутности 10 ед. высевают на чашку Петри «сплошным газоном». Производится делением чашки на сектора. В отдельные сектора размещаются дисковые системы с антибиотиками.

3. Результаты и их обсуждения

Первым этапом работы было выделение штаммов азотобактера из образцов различных типов почв.

Результаты представлены в таблице 1 и 4. Выявлено наличие типичных колоний штаммов азотобактера в 6 образцах почв — чернозема оподзоленного (Арзамасский район), серой лесной (Дальне-Константиновский район), темно-серой лесной (Арзамасский район), выщелоченного чернозема (Дальне-Константиновский район) и сильноокультуренной подзолистой (Уренский район).

Из 11 проб (Вадский, Дзержиновский, Дальне-Константиновский, Сосновский районы) азотобактер не высевался.

На следующем этапе изучались культуральные признаки-морфологические особенности колоний и клеток, физиолого-биохимические признаки выделенных штаммов с целью подтверждения принадлежности их к роду Azotobacter и определенным видам. Результаты приведены в таблице 3 и 4. Установлено, что выделенные штаммы бактерий из различных образцов почв по ключевым морфологическим и физиолого-биохимическим признакам относились к роду Azotobacter и виду Azotobacter chroococcum (таб.2).

Таблица 3. Признаки выделенных штаммов Azotobacter

Таблице 4. Морфологические особенности колоний Azotobacter

Третьим этапом работы являлось определение уровней антибиотикорезистентности выделенных нами штаммов Azotobacter chroococcum.

Ставив эту задачу мы исходили из следующих известных представлений о том, что в природе микроорганизмы существуют в тесных ассоциациях друг с другом и в процессе эволюции у определенных групп видов микроорганизмов населяющих почву и другие естественные субстраты, выработались разнообразные механизмы адаптации к условиям среды и к ее обитателям. Это привело к заселению разнообразных экологических ниш микробными сообществами. В этих сообществах микроорганизмы связаны энергетическими цепями и испытывают взаимное влияние. Взаимоотношения между участниками сообществ сложны и динамичны в связи с постоянными изменениями экологических условий и физиологической изменчивости самих микроорганизмов. Взаимоотношения регулируются продукцией либо стимулирующих жизнеспособность ассоцианта веществ, либо ингибирующих жизнеспособность. Эта регуляция необходима в природных условиях для поддержания численности и оптимального видового состава популяции. Продукция естественной микрофлорой в природных условиях антибиотических веществ по разному влияет на ассоциантов — они либо погибают, если нет адаптивных механизмов, либо преодолевают неблагоприятное воздействие.

Как относятся азотофиксирующие бактерии к действия антибиотических препаратов? Этот вопрос в современной литературе не обсуждается. Однако он представляет несомненный интерес для понимания специфики экологии азотофиксаторов и механизмов их адаптации к неблагоприятным воздействиям.

Чувствительность штаммов азотобактера определялась к природным (продуценты-микроорганизмы) и синтетическим антибиотикам методом бумажных дисков. Результаты исследования представлены в таблице 5.

Таблица 5. Чувствительность и резистентность к антибиотикам штаммов Azotobacter chroococcum

Установлено, что штамм Az. chroococcum выделенный из образца чернозема оподзоленного (Арзамасский район) был резистентным к 8 природным и синтетическим антибиотическим препаратом (карбеницилину, линкомицину и фузидину, ристомицину, полимиксину М, оксацилину, бакцитрацину и новобиоцину) и чувствителен к 10 антибиотикам (рис.2).

Резистентность штамма, выделенного из образца серой лесной почвы определялась пятью антибиотическими препаратами (линкомицину, ристомицину, полимиксину М, новобицину, бацитрацину) и чувствительностью к 13 антибиотикам.

Штамм Az. chroococcum, выделенный из темно-серой лесной почвы (Арзамасский район) был резистентным к 6 природным и синтетическим препаратам (карбеницилину, линкомицину, ристомицину, оксацилину, бацитрацину и новобиоцину) и чувствителен к 12 антибиотикам (рис.3).

Штамм, выделенный из образца выщелоченного чернозема (Дально-Константиновский район) был резистентными к 3 антибиотическим препаратам (линкомицину, новобиоцину и бацитрацину) и чувствителен к 15 остальным (рис.3).

Резистентность штамма, выделенного из образца сильно-окультуренной подзолистой почвы (Уренский район) определялась пятью антибиотическими препаратами природного и синтетического происхождения (карбеницилину, линкомицину, оксацилину, бацитрацину и новобиоцину) и чувствителен к 13 антибиотикам (рис.4).

Резистентность эталонного штамма отмечена к 6 антибиотическим препаратам (карбеницилину, линкомицину, ристомицину, полимиксину М, оксацилину и новобиоцину) и чувствительностью к 12 антибиотикам (рис.4).

Устойчивость к линкомицину, бацитрацину и новобиоцину выявлена у 6 исследуемых штаммов азотобактера, выделенных из различных типов почв.

Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что азотфиксирующие бактерии Az. chroococcum имеют определенные адаптационные механизмы, способствующие сохранению жизнеспособности в неблагоприятных условиях воздействия биотических факторов.

Выводы