Способы оценки микробного разнообразия в природе

Современная экология микроорганизмов обладает целым набором методов, позволяющих оценить присутствие и функционирование микроорганизмов в природных условиях. Методы классической микробиологии, основанные па выделении чистых культур, составляют лишь часть этого набора. Считается, что на современном этапе развития науки мы можем культивировать лишь от 0,1 до 1% представителей мира микробов. Выделение и определение членов микробного сообщества с помощью рассева на чашки эффективны при высокой концентрации микробных клеток. При этом получают отдельные колонии чистых культур микроорганизмов, пригодные для проведения физиолого-биохимических тестов, но результатам которых возможна идентификация микроорганизма. Клетки из отдельно взятой колонии могут быть подвергнуты мультисубстратным тестам (ЛР/-тест, Biolog) для выявления спектра используемых субстратов, по результатам которых возможно определение микроорганизма до рода или даже вида. Если же относительное количество клеток искомого вида в пробе невелико, то они могут «потеряться» в случае прямого рассева на чашки с разведениями пробы. Для более полного выявления членов сообщества используют одновременные посевы на среды различного состава (например, для копиотрофов и олиготрофов, органотрофов и литотрофов, азотфиксаторов, бродилыциков и т. д.). Для выявления отдельных групп микроорганизмов применяют селективные и диагностические среды, среды с антибиотиками, специфически подавляющими развитие отдельных групп микроорганизмов.

Микроорганизмы могут быть обнаружены и химическими методами, когда определяют наличие в природной пробе комплекса веществ, характерных для конкретной группы. Так, каждый микроорганизм имеет свой особенный липидный состав, и это свойство положено в основу химической идентификации. Липиды — обязательные компоненты мембран, окружающих цитоплазму каждой микробной клетки. Липидный состав различных микроорганизмов в значительной степени отличается друг от друга. Существует несколько классов липидов, которые обнаружены у микроорганизмов. Данный метод не идеален, поскольку любые микроорганизмы могут существенно менять профиль липидов в зависимости от возраста культуры и условий культивирования клеток. Анализ, основанный на изучении и сравнении метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), входящих в состав липидов, получил широкое распространение вследствие его простоты и доступности. Полный процесс идентификации включает этерификацию липидов, метилирование входящих в их состав жирных кислот, их разделение на хроматографических колонках и количественное определение с помощью газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Специальным образом обработанные колонки дают хорошее разрешение МЭЖК, что позволяет сравнивать их время удерживания с ранее идентифицированными липидными профилями (стандартами). Анализ МЭЖК, экстрагированных из почвенных образцов, позволяет быстро и относительно недорого идентифицировать состав популяции почвенных микроорганизмов. Интерпретация результатов, однако, иногда встречает значительные трудности вследствие идентичности многих липидов у различных представителей изучаемого микробного сообщества.

Для оценки микробного разнообразия применяют прямые микроскопические наблюдения и различные молекулярно-генетические методы исследования. Прямое микроскопирование в природных пробах позволяет не только наблюдать за микроорганизмами, но и с помощью прижизненного окрашивания различать мертвые и живые, физиологически активные клетки. Этот метод позволяет зарегистрировать гораздо больше клеток, чем дают результаты высевов на различные среды. Большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос: являются ли прижизненно окрашенные микроорганизмы живыми или мертвыми? При применении в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого было замечено, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть — остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу, что зеленые клетки — живые, а оранжевые — мертвые. Впоследствии было выяснено, что цвет флуоресценции зависит от соотношения ДНК/белок в клетке, поэтому активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми. В дальнейшем были разработаны прямые методы, основанные на оценке метаболической активности клеток (клеточному дыханию), позволяющие отличить в природных пробах живые клетки от неживых. Применение различных солей тетразолия, которые при восстановлении в клетке дегидрогеназами (при дыхании) превращаются в нерастворимый формазан красного цвета, позволяет обнаружить это визуально под микроскопом. Есть способ различать живые, мертвые и поврежденные клетки при измерении состояния мембранного потенциала с помощью флуорохромов. Предлагают также добавление к пробам живых клеток ингибитора клеточного деления (налидиксовой кислоты), при котором активно растущие клетки будут удлиняться без вступления в фазу бинарного деления. Многие микроорганизмы, наблюдаемые при прямом микросконировании как живые, находятся в некультивируемой форме. Для их выявления особенно важны прямыс микроскопические наблюдения, поскольку среди некультивируемых форм значительную часть составляют патогенные для человека микроорганизмы. Так, Legionella pneumophila, Salmonella enteritidis, Vibrio cholerae и V. vulnificus постоянно пребывают в некультивируемой форме в природных эконишах. Они не растут на лабораторных средах, но в природе ведут активный образ жизни, сохраняя способность заражать человека.

Молекулярные методы, основанные на анализе нуклеиновых кислот, позволяют обнаружить и определить микроорганизмы без их выделения в чистые культуры. Из почвенных, осадочных или водных образцов извлекают всю имеющуюся ДНК, очищают ее и анализируют с помощью градиентных гель-электрофорезов — термического (ТГГЭ) и денатурирующего (ДГГЭ). Основной трудностью при экстракции тотальной ДНК является ее отделение и очистка от гуминовых веществ почвы, хотя методы, позволяющие проводить такую очистку, постоянно совершенствуются. После экстракции ДНК подвергают иммобилизации на нитроцеллюлозном или нейлоновом фильтре, плавят и затем гибридизуют с известными последовательностями генов, ответственными за синтез тех или иных специфических ферментов. Так, наличие в пробе тотальной ДНК генов, гибридизуемых с геном, кодирующим нитрогеназу, говорит о присутствии в анализируемом сообществе азотфиксаторов, генов метанмонооксигеназы — о присутствии метанотрофов, а генов Рубиско — о наличии автотрофных микроорганизмов, фиксирующих углекислоту через цикл Кальвина.

Генов, кодирующих ключевые реакции тех или иных процессов, расшифровано уже несколько десятков, и, применяя метод гибридизации, можно делать выводы о наличии определенных микроорганизмов в анализируемой пробе. Разработаны «универсальные» праймеры на бактерии, археи и эукариоты, которые позволяют специфически амплифицировать последовательности этих трех разных групп микроорганизмов, разделить их с помощью ТГГЭ/ДГГЭ-методов и затем, после вторичной амплификации отдельных полос, получить почти полный профиль микробного сообщества с идентификацией отдельных филогенетических линий и классификацией микроорганизмов на основе последовательностей 16S рРНК. С использованием таких последовательностей было обнаружено, что морские воды содержат многие виды архей и бактерий, которые не поддаются культивированию в лаборатории. Наиболее подходящими для такой диагностики являются олигонуклеотидные пробы длиной 18—20 нуклеотидов, так как они легко гибридизуются со специфическим участком ДНК искомого организма. В популяциях природных образцов с помощью ПЦРамплификации диагностических последовательностей ДНК могут быть обнаружены даже небольшие количества некультивируемых форм.

Жизнеспособные клетки микроорганизмов могут быть идентифицированы также с помощью специфических иРНК методом обратной транскрипции, при этом следует помнить, что время полужизни некоторых бактериальных иРНК может составлять меньше минуты. Для идентификации нужных микроорганизмов в сообществе используют гены-репортеры, которые легко обнаружить после проведения химических реакций (например, lacZ-ген, кодирующий р-галактозидазу, и xylE-ген, кодирующий синтез фермента метаболизма толуола) или заявляющие о себе после экспрессии в клетке испусканием света различной длины волны (lux-гены или GFPгены, кодирующие синтез зеленого флюоресцирующего белка).

Гены-репортеры используют обычно при определении выживаемости введенных в образец микроорганизмов, для обнаружения тех или иных активностей в природных образцах, для выявления экспрессии и изучения активности нужного гена/фермента, под контролем промотора которого экспрессируется и ген-репортер. Генетическая конструкция в таком случае выглядит и работает следующим образом. Если нужный ген экспрессируется и фермент осуществляет свою функцию (например, расщепляет тот или иной ксенобиотик), то по люминесценции гена-репортера об этом можно судить на удалении (например, в толще почвы). Свет от места реакции трансмиттируется в таком случае с использованием оптоволоконных световодов. По тушению люминесценции в генно-инженерных штаммах Е. coli судят о степени токсичности пробы воды или почвы.

Определение численности микроорганизмов сводится к прямому подсчету клеток под микроскопом и непрямому подсчету после подращивания на твердых средах (учитываются только живые клетки). Чаще всего микробные клетки подсчитывают прямым счетом под микроскопом, при этом обычно не различая живые и мертвые клетки (по Виноградскому). Метод можно модифицировать с применением эпифлуоресцентного микроскопа и флуоресцирующих дифференциальных красителей для подсчета живых и мертвых клеток в препарате. Клетки микроорганизмов можно подсчитывать также в определенном объеме жидкой пробы иод световым микроскопом (в камерах Тома — Горяева или Петрова — Хаузера). Число специфических клеток микроорганизмов в природных образцах может быть установлено с помощью применения техники флуоресцирующих антител. Предварительная подготовка этого метода заключается в выделении чистых культур искомых видов и наработке специфических антител к таким клеткам. Этот метод позволяет следить за развитием индивидуальных микроорганизмов в их естественных местах обитания. Антитела являются чрезвычайно специфичными по отношению к выбранному виду, что в целом делает этот метод поразительно точным инструментом исследования. Модификациями метода являются применение специфичных флуоресцирующих антител, выработанных по отношению к определенным ферментам, а также использование флуоресцирующих генетических проб (генных зондов), позволяющих идентифицировать микроорганизмы с идентичными генами в популяции. В одной и той же популяции можно обнаруживать различные гены, имея генетические зонды, флуоресцирующие разным цветом.

При учете живых микроорганизмов после подращивания применяют, в основном, два метода: подсчет на чашках выросших колоний после соответствующих разведений и учет по методу предельных разведений. Оба этих метода требуют разделения микроорганизмов перед посевом на индивидуальные клетки, которые затем дают потомство. Применение методов подсчета с посевами требует бережного отношения к пробам для сохранения жизнеспособных клеток. Следует учитывать, что для подсчета микроорганизмов различных групп необходимо применять разные среды, которых разработано более тысячи для выявления бактерий, архей, грибов, водорослей, простейших, как аэробов, так и анаэробов. Модификацией метода служит гибридизация колоний, при которой из тысяч выросших колоний на чашке можно выявить одну, специфически гибридизующуюся с выбранным геном-маркером. Метод позволяет подсчитать число микроорганизмов нужного вида или с нужной функцией (в зависимости от примененного гена для гибридизации) среди большого количества сопутствующей микробиоты из природных проб.

Измерение биомассы применяют для подсчета урожая микроорганизмов, понимая под биомассой сухую массу живого материала, выраженную в граммах на литр. Измерение биомассы природных проб часто не приводит к желаемым точным результатам вследствие большого количества побочных эффектов, связанных с отбором проб и их измерением. Наиболее приемлемыми методами определения биомассы в природных образцах являются методы, связанные с определением биохимических параметров клеток. Для таких измерений предполагают, что количество измеряемого компонента клеток одинаково для всех видов клеток, что, конечно же, является допущением. Поэтому измерения биохимических параметров биомассы необходимо экстраполировать с осторожностью. Определение биомассы чаще всего осуществляют путем измерения содержания АТФ и адениновых нуклеотидов с последующим пересчетом на содержание углерода клетки или веса сухой биомассы. Метод позволяет быстро и точно (с помощью люциферин/люциферазной пробы) измерить содержание АТФ в образце. Количество АТФ строго соответствует биомассе живых клеток, так как после отмирания клетки пул АТФ в ней резко снижается или исчезает вовсе. Общее содержание аденилатов (АТФ + АДФ + + АМФ) нс зависит от метаболического состояния клетки и говорит о всей микробной биомассе анализируемой пробы.

Другим способом является измерение содержания компонентов клеточных стенок, например, ацетилмурамовой кислоты (МК) или липополисахаридов. Для оценки содержания мурамовой кислоты ее гидролизуют с высвобождением лактата, который определяют энзиматически. Установлено, что все грамположительные бактерии содержат 44 мкг МК/мг С клетки, тогда как для грамотрицательных клеток это соотношение равно 12 мкг/мг С. Для оценки содержания грибной биомассы используют определение концентрации хитина, хотя на точность метода может влиять количество почвенных членистоногих и насекомых.

При отсутствии в пробе растений можно определять биомассу фототрофных водорослей и бактерий, измеряя количество хлорофилла после экстракции пробы хлороформ/метанольной смесью с последующим измерением поглощения при 665 нм. Поглощение того же экстракта, измеренное при 850 нм, будет отражать количество всех бактериальных хлорофиллов, таким образом оценивают количество пурпурных фототрофных бактерий. Содержание различных хлорофиллов можно измерять и по спектрам флуоресценции.

Концентрация ДНК в клетках микроорганизмов довольно постоянна, и определение ДНК может способствовать определению биомассы. В природных образцах, где чувствительность метода определения ДНК имеет первостепенное значение, применяют пробы с флуоресцентными красителями, такими как этидиум бромид или Hoechst 33 258 с использованием спектрофлуорометрии. Перед измерением необходима тщательная очистка тотальной ДНК и постановка контролей на наличие эукариотической ДНК.

Бактериальные гемопротеины имеют характерную хемилюминесценцию, однако при таком определении следует убедиться, что фоновые концентрации белков незначительны. Поскольку различные микроорганизмы содержат очень разные количества белка, определение этого компонента биомассы целесообразно проводить в ситуациях, когда в пробе присутствует один вид микроорганизмов.

Определение липидов служит хорошим маркером для подсчета биомассы, поскольку все клетки окружены мембранами, содержащими липиды. Количество эргостерола в пробе отражает содержание грибов, поскольку его практически не содержат ни растения, ни археи и бактерии. Определение содержания и состава МЭЖК позволяет, наряду с качественной оценкой наличия той или иной группы микроорганизмов в образце, количественно определить содержание общей биомассы в природной нише.

Физиологические подходы к определению биомассы основаны на измерении дыхания пробы после добавления субстрата или на измерении количества С0₂, выделившегося после разложения микробной биомассы после стерилизации пробы при добавлении хлороформа. Оба метода требуют постановки многочисленных контролей.