Практикум. 
Микробиология: теория и практика

Вопросы и задания для самоконтроля.

• 1. Что происходит с микробиотой здорового семени растения при его посеве в почву и прорастании? Опишите возможные изменения структуры микробного сообщества.
• 2. Проанализируйте свойства грамотрицательных и грамположительных бактерий, позволяющие им успешно вступать в микробно-растительные взаимодействия.
• 3. В каких случаях мутуалистический ризосферный или филлосферный симбиоз может превратиться в паразитический? Приведите примеры.
• 4. Проанализируйте действие погодных факторов окружающей среды на развитие инфекционных болезней растений. Какие мероприятия в этих случаях могут замедлить распространение инфекции?
• 5. Предложите организационные мероприятия при вспышке инфекционного заболевания сельскохозяйственной культуры в отдельно взятом фермерском хозяйстве.

Семинар 1.

Разнообразие микробно-растительных взаимодействий Семинар рекомендуется проводить в форме докладов и презентаций студентов и последующего их обсуждения. При подготовке материала студенты должны руководствоваться соответствующим разделом учебника как планом, который дополнен конкретными примерами из монографий и оригинальных статей научных микробиологических журналов, найденных, но ключевым словам, а также из рекомендованной литературы.

Лабораторная работа 1.

Применение постулатов Коха для доказательства инфекционной природы мягкой гнили моркови.

Цель работы: при выполнении работы студенты узнают правила и овладеют приемами постановки экспериментов для доказательства микробного происхождения заболевания, проследив развитие инфекции на модельной системе. В качестве объекта исследования выбрана бактериальная болезнь растений, которая называется корневая, или мягкая гниль, возбудителем которой является Erwinia carotovora, непатогенная для человека.

Уже в античные времена признавали, что болезнь может быть заразной, т. е. передаваться от человека к человеку. В 1876 г. Роберт Кох, изучая развитие сибирской язвы, нашел убедительные доказательства тому, что эту болезнь вызывает бактерия Bacillus anthracis. Р. Кох исследовал коров, зараженных сибирской язвой, и обнаружил у них в крови огромное количество бактериальных клеток. Предположив, что именно они являются причиной заболевания, Кох выделил в чистую культуру и инкубировал в лаборатории бактерии из крови зараженных животных. Затем он заразил этой чистой культурой здоровую корову, и у нее появились все симптомы сибирской язвы. Исследователь вновь выделил в чистую культуру бактерии из экспериментально зараженной коровы и сравнил их с предыдущей чистой культурой. Две культуры оказались идентичными. После множества повторений этого эксперимента Кох пришел к заключению, что именно эти бактерии являются причиной возникновения болезни. На основе своих исследований и результатов, полученных другими учеными, он сформулировал правила и разработал последовательность действий, позволяющие установить, микробную этиологию заболевания, которые получили название «постулатов Коха»:

• 1. Микроорганизм, вызывающий болезнь, должен обнаруживаться в заболевшей особи (организме-хозяине) и других особях, пораженных той же болезнью. Этот микроорганизм не должен обнаруживаться у здоровых особей. Микроорганизм должен быть выделен в чистую культуру и устойчиво поддерживаться в лабораторных условиях.
• 2. Данная чистая культура, введенная здоровой особи, должна вызывать у нее симптомы изучаемой болезни.
• 3. Чистая культура, выделенная из экспериментально зараженной особи, должна быть идентична первоначально выделенной чистой культуре предполагаемого возбудителя.

Из десятков тысяч различных микроорганизмов, населяющих любую экологическую нишу, только несколько сотен являются патогенными. Болезнетворные микроорганизмы передаются от особи к особи различными путями. Только некоторые болезни одновременно являются смертельно опасными и легко передающимися. Соблюдение правил гигиены в значительной степени предохраняет людей от большинства болезней, вызываемых микроорганизмами.

Патогенные микроорганизмы, являющиеся возбудителями различных болезней, и в настоящее время часто определяют, руководствуясь постулатами Коха. Однако они не всегда применимы к новым смертельно опасным возбудителям, таким как вирусы ВИЧ или Эбола, поскольку эти инфекционные агенты могут не выделяться из зараженного организма в виде чистой культуры и не способны расти в лабораторных условиях. Некоторые новые возбудители не заражают лабораторных животных или не вызывают видимых симптомов заболевания при попадании в экспериментально зараженный организм. В большинстве случаев новые возбудители отличаются высокой изменчивостью, поэтому чистые культуры, выделенные из больного и экспериментально зараженного животного, могут не совпадать.

Необходимые материалы: их количество рассчитывается в зависимости от числа студентов в группе; культура Envinia caratovora, корнеплоды моркови, водопроводная или дистиллированная вода в колбах, пустые чашки Петри и чашки Петри со стерильным МПА, автоклав, сухожаровой шкаф, бумажные полотенца или фильтровальная бумага, 95%-й этанол, нож, микробиологическая петля, пинцет, ножницы, спиртовка или газовая горелка, маркер, термостат, мыло, дезраствор.

Заранее заворачивают и стерилизуют в сухожаровом шкафу пустые чистые чашки Петри и кружки, вырезанные из бумажного полотенца или фильтровальной бумаги и равные по размеру дну чашки Петри. Готовят в колбах МПА и стерилизуют его в автоклаве при 1,0 ати. Расплавленный МПА разливают в стерильные чашки Петри по 20—25 мл у пламени горелки (из расчета 2 чашки на студента). Часть стерильных чашек оставляют пустыми (из расчета 3—5 чашек на студента). За 1—2 сут. до постановки опыта готовят несколько «больных» кусочков моркови. Для этого в стерильную чашку Петри помещают кусочки моркови и наносят на них петлей видимое количество биомассы Erwinia caratovora. Чашку выдерживают при комнатной температуре или в термостате при 25 °C до появления видимых признаков заболевания (размягчение корнеплода, потемнение и возникновение неприятного запаха).

По окончании инкубации необходимо описать признаки и зарисовать вид «больной» и «здоровой» моркови. На дно первой пустой чашки Петри помещают в 2—3 слоя стерильные кружки, вырезанные из бумажного полотенца или фильтровальной бумаги, и добавляют стерильную воду для их смачивания. Избыток воды сливают. Стерильным пинцетом переносят кусочек «больной» моркови на влажную салфетку в чашке Петри. Затем пинцетом, простерилизованным в спирте и обожженным в пламени горелки, кладут кусочек «здоровой» моркови на кусочек «больной». «Здоровый» кусочек необходимо тесно прижать к пораженному участку на «больном» корнеплоде и затем положить рядом с «больным» в ту же чашку, чтобы их края соприкасались. Чашку закрывают крышкой, маркируют, помечая, что это — опытная чашка. Используя другую чашку Петри, повторяют шаги, описанные выше, для двух «здоровых» срезов моркови. Чашку закрывают крышкой, маркируют, помечая, что это — контрольная чашка.

Далее следует выполнить первый постулат Коха. Небольшое количество инфицированных тканей моркови петлей переносят на чашку со стерильным МПА. Для этого аккуратно потирают пораженное место кусочка «больной» моркови зеркальцем петли и делают на агаре посев зигзагообразным шрихом, занимая всю площадь агара, как на рис. 12.9. Чашку маркируют. Все чашки инкубируют в течение 24—48 ч при комнатной температуре или при 25 °C в термостате. Руки и рабочую поверхность стола после работы дезинфицируют.

После инкубации следует рассмотреть кусочки моркови, зарисовать содержимое чашек, отметить, появились ли симптомы заболевания в опытных и контрольных чашках и сделать вывод о развитии инфекции. Затем просматривают чашки, засеянные материалом пораженной моркови, описывают выросшие колонии, готовят и микроскопируют препарат «раздавленная капля» и фиксированный окрашенный препарат. Зарисовывают микроскопическую картину.

Готовят новую стерильную чашку Петри с 2—3 слоями кружков из бумажного полотенца или фильтровальной бумаги на дне. Кружки смачивают стерильной водой, избыток которой сливают. Свежие кусочки «здоровой» моркови моют водой с мылом и прополаскивают в проточной воде. Продезинфицировав нож спиртом, срезают внешнюю оболочку моркови. Очищенную морковь протирают дезинфицирующим раствором и сразу же промывают стерильной водой. Снова простерилизовав нож, отрезают от моркови четыре кружочка по 5—8 мм толщиной. Для выполнения второго постулата Коха стерилизуют пинцет в спирте и помещают с его помощью четыре кусочка моркови на дно чашки с бумажными кружками. Стерильной петлей переносят небольшое количество биомассы бактерий из отдельных колоний в чашке с МПА в центр трех кружочков моркови. Четвертый кружок нс заражают. Па дне чашки с внешней стороны помечают, какие кружки были заражены. Закрытые чашки маркируют и ставят, не переворачивая, на инкубацию при 25 °C в течение 24—48 ч.

По окончании инкубации рассматривают содержимое чашек, определяют наличие запаха и консистенцию поверхности пораженной моркови, прикасаясь к ней петлей. Сравнивают вид трех кружков с внесенной инфекцией и незасеянного кружка, делают их описание и зарисовывают.

После этого выполняют третий постулат Коха. Материал с «больного» кусочка моркови переносят петлей на стерильную чашку с МПА, осуществляя посев зигзагообразным штрихом, как описано выше. Чашки маркируют и инкубируют в перевернутом виде при 25 °C в течение 24—48 ч. После инкубации рассматривают посевы, описывают и зарисовывают выросшие колонии. Готовят из них препараты и микроскопируют их, зарисовывая полученную картину. Сравнивают колонии и микроскопическую картину, полученные на первом и втором этапах опыта, делают выводы о выполнении требований постулатов Коха и об этиологии мягкой гнили моркови.

Если в течение 24—48 ч видимых результатов роста не появляется, инкубируют бактерии дольше, так как скорость образования колоний может зависеть от первоначальной концентрации клеток, взятых для посева.