Рост и культивирование микроорганизмов

После изучения данной главы студент должен: знать

• • особенности роста микроорганизмов в периодических и непрерывных культурах; уметь
• • рассчитывать скорость роста микробных культур; владеть
• • навыками выращивания сапротрофных микроорганизмов на соответствующих средах, контроля их роста и количественного учета.

Основные параметры роста культур

У одноклеточных форм понятия «рост» и «развитие» почти равнозначны. Из-за малых размеров микроорганизмов оценка роста происходит не для индивидуального организма, а для популяции. Графическое отражение процесса называется кривой роста. Простейшими параметрами для оценки роста культуры служат время генерации, константы скорости роста и скорости деления. Для их подсчета пользуются таким легко измеряемым показателем, как количество клеток в единице объема. Методы определения числа клеток бывают прямые и косвенные. Прямыми методами можно подсчитать под микроскопом достаточно крупные клетки, не образующие скопления. При таком подсчете без специальных приемов не удается различить живые и мертвые клетки. Для этого готовят различные препараты с определенной площадью мазка или применяют специальные счетные камеры, обеспечивающие заданный объем клеточной суспензии (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Камера Горяева — Тома для подсчета клеток:

а — вид сверху; 6 — вид сбоку; в — разметка (сеточка) средней части (увеличено) Косвенные методы основаны на измерении показателей, зависящих от количества клеток (число колониеобразующих единиц, значение мутности суспензии, содержание белка, поглощение кислорода, количество образованной биомассы и др.). Обычно исследователь параллельно использует два-три метода определения численности клеток, так как любой способ подсчета имеет свои ограничения. Так, не все клетки способны дать колонии на твердой среде, и не существует питательной среды, подходящей для всех без исключения микроорганизмов.

Из косвенных методов наиболее часто применяют получение отдельных колоний на плотных средах по Коху. Поскольку колония — это потомство одной клетки, то, подсчитав выросшие на агаризованной среде колонии, можно узнать число клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ) в единице объема исходной суспензии. Для получения изолированных колоний готовят десятикратные разведения. Посев можно осуществить по поверхности застывшей агаризованной среды в чашках Петри (рис. 5.2) или глубинно (рис. 5.3), внося заданный объем суспензии в порцию расплавленной и остуженной до 45 °C агаризованной среды и выливая смесь в чашку Петри для застывания. Чашки с посевами помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода не мешала образованию отдельных колоний. Когда колонии станут хорошо различимыми, проводят их подсчет, учитывая объем внесенной пробы и разведение.

Рис. 5.2. Схема поверхностного посева по Коху для получения отдельных колоний

Рис. 53. Схема глубинного посева по Коху для получения отдельных колоний.

При периодическом культивировании в экспоненциальной фазе роста увеличение числа клеток, размножающихся бинарным делением, происходит в геометрической прогрессии: 2°—>2^!—>2²—> … —>2″. Если обозначить начальное число клеток как JV₀, количество делений как п_} то число клеток через промежуток времени (t — t₀) будет равно N_t = N₀ • 2″ . Тогда число делений можно выразить через количество клеток: п = (lgN_t — lgN₀)/ lg2.

Константа скорости деления (число удвоений в единицу времени) обозначается v и вычисляется следующим образом: v = n/(t — 1₀) = (lgN_t — - gN₀)/ [lg2 • (t — ^₀)]. Обратной величиной является время генерации (промежуток времени, за который число клеток удваивается): g = (t — t₀)/n = = 1/v. Важной характеристикой культуры является константа скорости роста (удельная скорость роста) р. При стандартных условиях независимо от места выращивания конкретная культура имеет совершенно определенную одну и ту же константу скорости роста. Ее вычисляют по формуле р = (lgN_t — lgiV₀) / [0,4343(7 — 7₀)]. Для проведения расчетов принимают некоторые допущения. Микробную культуру рассматривают как саморазмножающуюся систему, а не как набор индивидуальных особей. Считают, что в экспоненциальной фазе роста все клетки физиологически активны и способны к делению. Рост биомассы в этом случае прямо пропорционален увеличению числа клеток.

Для характеристики эффективности процесса используют ряд дополнительных параметров (урожай, экономический и энергетический коэффициенты). Под урожаем (или выходом) биомассы понимают разность между максимальной и исходной массой бактерий: X = Х_тах — Х₍₎ (г сухого вещества). Огромное значение имеет экономический коэффициент, т. е. отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата: У = X/S (в г). Применяют также энергетический коэффициент: У_АТР = X (г)/АТР (моль). Для его расчета нужно знать катаболические пути использования данного субстрата.

Если бы рост микроорганизмов не ограничивался доступностью питательных веществ, то через 48 ч микробные клетки образовали бы биомассу, в 150 раз превышающую массу нашей планеты. Быстрее всего из известных микроорганизмов растут фотобактерии, удваивающиеся каждые 8—10 мин Е. coli в оптимальных условиях делится через 20 мин. Продуктивность одноклеточных микроорганизмов в 10—100 тыс. раз превышает продуктивность сельскохозяйственных растений и животных (рис. 5.4). Так, корова массой 500 кг за 1 су г. дает привес в 0,5 кг (массу морской свинки), такая же масса сои — 5 кг (массу кошки), в то время как 500 кг дрожжей нарабатывают 50 000 кг (массу 10 слонов).

Рис. 5.4. Продуктивность различных организмов за сутки.