Формирование пространственных структур РНК

В силу того что молекулы РНК имеют небольшую длин}? и являются одноцепочечными, для них характерно формирование «антипараллельных» шпилек замыканием цепи самой на себя. Это может приводить к формированию довольно интересных пространственных структур, как, например, в случае молекул тРНК или молекул РНК, участвующих в процессах сплайсинга (см. рис. 1.12, 1.32). Анализ известных пространственных структур молекул РНК показал, что помимо доминирующей А-формы углы вращения химических связей, формирующих основную цепь, образуют несколько кластеров (рис. 1.42). На рис. 1.42, а и б приведены кластеры, формируемые углами, а — р — у, для С₃'-эндо и С₂'-эндо конформаций фуранозного кольца. На рис. 1.42, в приведены кластеры, формируемые группой углов 5 — е — ф Следует отметить строгую бимодалыюсть угла 8, что соответствует двум конформациям фуранозного кольца.

Рис. 1.42. Кластеры групп углов вращения, характерных для реальных структур РНК:

а, б: а — р — у; в: 6 — е — С,

Формальное разделение структуры молекулы РНК на вторичную и третичную (пространственную) можно описать следующим определением: вторичная структура РНК — это список нуклеотидных пар такой, что для пары с индексами i, j, где i и другой пары /г, / (г < к) выполняются следующие условия:

Условие (1.1) требует, чтобы каждый нуклеотид участвовал не более чем в одном комплементарном взаимодействии, а условие (1.2) запрещает формирование таких сложных структур, как псевдоузлы (рис. 1.43). Определение третичной структуры РНК позволяет не выполняться условию (1.2), что и приводит к закручиванию элементов вторичной структуры в сложные трехмерные комплексы.

Рис. 1.43. Простой пример псевдоузла — элемента третичной структуры, формируемой молекулой РНК (а); абстрактное представление псевдоузла (б).

Энергетика формирования вторичной структуры молекулы РНК описывается тремя факторами:

• 1) энтальпийным эффектом от формирования водородных связей между комплементарными основаниями и стекинг-взаимодействием ароматических колец соседних пар;
• 2) энтропийным эффектом, определяемым числом степеней свободы мономеров цени;
• 3) влиянием окружающих положительно заряженных ионов, так как за счет остатков фосфорной кислоты молекула РНК обладает сильным отрицательным зарядом, без нейтрализации которого фрагменты цепи испытывают отталкивание.

При наличии внутри одной молекулы РНК нескольких альтернативных вариантов спаривания олигонуклеотидных фрагментов (элементов вторичной структуры) реально формируемая пространственная структура зависит от точного баланса данных взаимодействий, что позволяет молекуле эффективно переключать состояния при изменении условий. Например, подобное поведение молекул РНК активно используется прокариотами для регуляции реализации генетической информации, а именно терминации транскрипции с использованием эффекта аттенюации (рис. 1.44, 1.45).

Эффект аттенюации используется как для штатной Rho-независимой терминации с З'-конца транскрипта, так и для регуляторной терминации в районе 5'-нетранслируемого участка, что предотвращает синтез транскрипта, если клетка не нуждается в данном продукте.

Рис. 1.44. Иллюстрация процессов, происходящих при Rho-независимой терминации транскрипции у прокариотических организмов:

UBS, RBS и HBS — сайты связывания РНК-полимеразы с матрицей и транскриптом; NusA — белок, входящий в комплекс РНК-полимеразы и способный стабилизировать формируемые транскриптом вторичные структуры, способствуя терминации транскрипции.

Rho-независимая терминация происходит в специально организованных З'-концсвых терминирующих участках, последовательность которых состоит из фрагмента с чередующимися ГЦ-нуклеотидами и поли-Аучастка. После прохождения ГЦ-участка РНК-полимераза притормаживает на поли-А-участке. Параллельно с замедлением РНК-полимеразы происходит формирование стеблевой (шпилечной) вторичной структуры вновь синтезированным ГЦ-фрагментом РНК. Формирование локальной вторичной структуры молекулы РНК, в свою очередь, приводит к отталкиванию транскрипта от матрицы (аттенюация), чему способствуют более слабая связь поли-А-участка с вновь синтезированной поли-У-частыо РНК-транскринта и блокирование образовавшейся шпилькой двух сайтов связывания РНК-полимеразы с матрицей и РНК-трапскриптом. Этого оказывается достаточно для начала диссоциации всего комплекса «транскрипт — РНК-полимераза — ДНК-матрица».

Что касается 5'-регуляторной терминации транскрипции, то выделяют несколько ее вариантов (рис. 1.46). Классическим примером подобной регуляции является контроль триптофанового оперона (рис. 1.45 и 1.46, в). Триптофановый оперон кодирует пять белков, необходимых для синтеза триптофана. Помимо «обычной» схемы регуляции оперона с помощью белка-репрессора TrpR, который, будучи связан остатком триптофана, т. е. при избытке триптофана в матриксе клетки, блокирует оператор, в триитофановом опероне используется дополнительная схема регуляции. Эта схема связана с лидерным участком оперона, который содержит несколько антипаралельных комплементарных фрагментов, что позволяет транскрибированному участку РНК формировать два типа пространственных структур (рис. 1.45).

Рис. 1.46. Различные варианты регуляторной 5'-терминации транскрипции:

во всех случаях схема включает аттенюатор в виде ГЦ-богатой шпильки и следующего за ним поли-У-участка (отмечены вертикальными стрелками) обеспечивающего терминацию транскрипции. При этом вместо шпильки аттенюатора возможно формирование альтернативной структуры, не препятствующей транскрипции (участки обозначены пунктирными стрелками) Выделяют следующие варианты 5'-регуляторной терминации:

• • РНК-переключатели (см. рис. 1.46, а). При наличии в матриксе клетки определенных низкомолекулярных веществ, являющихся продуктом регулируемого оперона, происходит формирование сложной пространственной структуры, связывающей на 5'-конце РНК-транскрипта вещество-регулятор. Образовавшаяся пространственная структура не дает сформироваться альтернативной (нетерминирующей) шпильке, что приводит к появлению аттенюатора и терминации транскрипции;
• • Т-box (см. рис. 1.46, б). Схема аналогична РНК-переключателю, однако вторичная структура РНК-транскрипта, препятствующая формированию антитерминатора, складывается только при наличии в среде молекул тРНК определенного типа, не связанных с соответствующим аминокислотным остатком. Данная схема применяется для операторов, кодирующих аминоацил-тРНК-синтетазы;
• • система с лидерным пептидом (см. рис. 1.46, в). Данной схеме соответствует описанный выше триптофановый оперон. Используется для контроля оперонов, синтезирующих определенные аминокислоты;
• • контроль генов рибосомных белков (см. рис. 1.46, г). Особенность белков, входящих в рибосомы, состоит в том, что они штатно связываются со специализированными рибосомальными рРНК. Для контроля синтеза подобных белков 5'-участок их мРНК имеет структурное сходство с рРНК, которые в норме связывает данный белок. В результате, когда все имеющиеся в клетке рРНК оказываются связанными с соответствующими белками, появляется вероятность того, что свободный рибосомный белок свяжется с 5'-участком своей мРНК, а это позволит сформироваться шпильке аттенюатора и приведет к преждевременной терминации транскрипции;
• • прямое связывание терминатора/антитерминатора белком-мишенью (см. рис. 1.46, д). Данная схема состоит в прямом белок-мРНК взаимодействии и может встречаться при регуляции совершенно различных белков. Сродство белка к связываемой последовательности РНК может регулироваться физиологическими условиями или дополнительными факторами.

Из приведенных примеров видно, что в большинстве случаев формирование пространственных структур молекулами РНК направляется комплементарным взаимодействием азотистых оснований. Однако, как уже говорилось, в случае наличия нескольких энергетически почти равнозначных вариантов возможного спаривания нуклеотидов моделирование вторичной структуры становится более сложной задачей.

В число дополнительных факторов, влияющих на принятие цепью определенной конфигурации, можно внести: воздействие низкомолекулярных лигандов, динамические эффекты, взаимодействие с белками и влияние неканонического (не уотсон-криковского) спаривания азотистых оснований. Все вышесказанное не позволяет ограничиться при моделировании молекул РЫК простым поиском обращенных повторов, а требует привлечения дополнительных подходов, таких как сравнительное моделирование или молекулярная динамика.