Исследование и применение FRET-метода в медицине

1. Основы квантовой теории

1.1 Общие представления

1.2 Квантовые переходы

2. Физические основы флуоресценции

2.1 Понятие и виды флуоресценции. Квантовый выход

2.2 Флуорохромы

2.2.1 Флуорохромы, возбуждаемые синим светом

2.2.2 Флуорохромы, возбуждаемые зеленым светом

2.2.3 Флуорохромы, возбуждаемые ультрафиолетом

2.3 Совмещение флуорохромов и задача колокализации

3. FRET-микроскопия

4. Подбор пар для FRET

5. FRET как явление

5.1 Механизм FRET

5.2 Принцип FRET

5.3 Физические показатели. Обоснование теории Ферстера

6. Исследования в области FRET. Применение FRET-методов

6.1 FRET-исследования в области клеточной биологии

6.2 Исследование и применение FRET-метода в медицине Выводы Библиографический список

Перечень сокращений

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (Fluorescence resonance energy transfer) — FRET;

Собственный момент импульса (направлением вращения) — s;

Основное синглетное состояние молекулы — S₀;

Триплетное состояние молекулы — Т₁;

Квантовый выход — QY;

Квантовый выход донора — QYD;

Акридиновый оранжевый - AO;

Бромид этидия — БЭ;

Зеленый флуоресцирующий белок - GFP;

Синий флуоресцирующий белок — BFP;

Циановый флуоресцирующий белок — CFP;

Красный флуоресцирующий белок - RFP;

Коэффициент молярной экстинции — е;

Родамин — TRITC, R;

Фотодинамическая терапия — ФДТ;

Фотосенсибилизаторы — ФС;

Хлорин е6 — ХЕ6;

Скорость передачи энергии при FRET — КТ;

Эффективность передачи энергии при FRET — ET;

Квантовые переходы — К. п.;

Р-гликопротеине — Pgp;

Hoechst 33 342 — H33342.

" Описание квантово-механической природы передачи энергии электронного возбуждения между аналогичными молекулами приводится в более ранней теории Перрена. Критическое максимальное пространственное разделение между молекулами, ниже которого происходит передача энергии при жизненном возбуждении можно вычислить исходя из спектров поглощения и флуоресценции и возбуждения жизни молекулы «.

Т. Ферстер Большой интерес во многих областях биологических исследований представляет определение точного местоположения и характер молекулярного взаимодействия между живыми клетками. Но такого рода исследованиям часто препятствует ограниченное разрешение приборов, используемых для изучения этих явлений. Обычная флуоресцентная микроскопия позволяет определить локализацию флуоресцентно-меченых молекул в оптически-пространственных пределах, определяемых критерием Рэлея, примерно в 200 нм (0,2 микрона). Однако, для того, чтобы понять физические взаимодействия между белками, участвующих в типичном молекулярно-биологическом процессе, относительная близость молекул должна быть определена значительно точнее, чем позволяют сделать традиционные дифракционные оптические методы. Методика флуоресцентного резонансного переноса энергии в применении с оптической микроскопией позволяет определить взаимодействие между двумя молекулами на расстоянии нескольких нанометров — достаточно близкое для молекулярных взаимодействий. Флуоресцентная микроскопия основана на поглощении света флуорофором на одной длине волны (возбуждения), а затем последующей эмиссии флуоресценции при большей длине волны.

Рис. 1. Квантовый механизм флуоресценции Волна возбуждения и волна излучения отличаются обычно в пределах десятков и сотен нанометров. Данный метод позволяет установить, что молекулы, которые находятся ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, находятся в одном объеме пространства. В соответствии с вышесказанным можно выделить следующие цель и задачи данной работы:

Цель: описать механизм безызлучательной передачи энергии возбуждения от донора к акцептору при использовании в качестве донора энергии препарат для фотодинамической терапии, а в качестве акцептора — специфически связывающийся с органеллами флуорофор.

Задачи:

1) воспроизвести процесс безызлучательной передачи энергии флурофором,

2) определить специфичность связывания флуорофора с мембранами клеток,

3) доказать факт процесса передачи энергии по спектрам возбуждения и излучения,

4) определить возможность повышения эффективности фотодинамической терапии при помощи FRET.

квантовый флуоресценция флуорохром fret

1. Основы квантовой теории

1.1 Общие представления

Одним из инструментов, который помог «заглянуть» внутрь невидимых, микроскопических атомов, послужила квантовая теория.

Берлинский профессор М. Планк в течение многих лет занимался проблемой физических явлений излучения и характером передачи энергии. Он пришел к выводу, что излучение света веществом происходит не непрерывно, а отдельными «элементарными» порциями энергии (квантами), которые рождаются колеблющимися атомами.

По мнению Планка, в нагретом веществе группы атомов, колеблющихся с очень высокими (и очень низкими) частотами не могут составлять большинство, и основная масса порций энергии выделяется в области каких-то промежуточных, «средних» частот. Элементарная «порция» энергии е (эпсилон) связана с частотой электромагнитной световой волны, которая эту энергию несет, простым соотношением е = hn, где h — некоторая константа, необходимая уже для того, чтобы уравнять размерности энергии Е (Дж) и частоты n (1/сек). Эта элементарная порция волновой энергии получила, как мы уже знаем, название кванта, а константа h называется постоянной Планка.

В дальнейшем на квантовую гипотезу обратил внимание датский физик Нильс Бор, который применил ее к модели атома Резерфорда и получил поразительные результаты в объяснении атомных спектров испускания водорода. Бор предположил, что электронный «рой» в модели Резерфорда не беспорядочен. Электроны в нем располагаются на строго определенных, постоянных орбитах.

В модели Резерфорда электроны тоже двигались по орбитам, но эти орбиты могли быть «спиралевидными». Двигаясь по спирали ближе или дальше к ядру, атом мог излучать или поглощать энергию. В этом случае спектры испускания атомов должны были быть похожими на непрерывный солнечный спектр, а спектр испускания водорода оказался прерывистым, линейчатым.

Бор предложил считать аксиомой тот факт, что только на постоянных, стационарных орбитах электрон может существовать устойчиво, не падая на ядро. Постулаты Бора можно сформулировать следующим образом:

1. В атоме существуют орбиты, находясь на которых электрон не излучает энергию. Эти орбиты называются стационарными.

2. Излучение происходит только при перескоке электрона с одной стационарной орбиты на другую.

Например, переход электрона с одного из высоких уровней на 2-й уровень сопровождается выделением отдельных «порций» световой энергии — квантов света в видимой области. Переходы между близко расположенными уровнями дают менее энергичные кванты красного цвета. Наиболее энергичные (ультрафиолетовые) кванты выделяются при возврате электрона на ближайший к ядру 1-й уровень. Кванты одного вида сливаются вместе и наблюдаются в спектрометре в виде тонких линий.

Рис. 2. Электронные переходы в атоме водорода:

серия Лаймана (самое богатое энергией ультрафиолетовое излучение) возникает в результате переходов с уровней n = 5, 4, 3, 2 в основное состояние (n = 1; cерия Бальмера (видимый свет) возникает при переходах с уровней n = 5, 4, 3 на уровень n = 2; cерия Пашена (красный свет) возникает в результате переходов с уровней n = 6, 5, 4 на уровень n = 3.

1.2 Квантовые переходы

Квантовые переходы — скачкообразные переходы квантовой системы (атома, молекулы, атомного ядра, твёрдого тела) из одного состояния в другое. Наиболее важными являются К. п. между стационарными состояниями, соответствующими различной энергии квантовой системы. При переходе с более высокого уровня энергии Ek на более низкий Ei система отдаёт энергию Ek — Ei, при обратном переходе — получает её. К. п. могут быть излучательными и безызлучательными. При излучательных К. п. система испускает (переход Ek > Ei) или поглощает (переход Ei > Ek) квант электромагнитного излучения — фотон — энергии hн (н — частота излучения, h — Планка постоянная), удовлетворяющей фундаментальному соотношению:

Ek — Ei = hн В зависимости от разности энергий состояний системы, между которыми происходит К. п., испускаются или поглощаются фотоны радиоизлучения, инфракрасного, видимого, ультрафиолетового, рентгеновского излучения, г-излучения. Совокупность излучательных К. п. с нижних уровней энергии на верхние образует спектр поглощения данной квантовой системы, совокупность обратных переходов — её спектр испускания.

При безызлучательных К. п. система получает или отдаёт энергию при взаимодействии с другими системами. Например, атомы или молекулы газа при столкновениях друг с другом или с электронами могут получать энергию (возбуждаться) или терять её.

Важнейшей характеристикой любого К. п. является вероятность перехода, определяющая, как часто происходит данный К. п. Вероятность перехода измеряют числом переходов данного типа в рассматриваемой квантовой системе за единицу времени (1 сек); поэтому она может принимать любые значения от 0 до? (в отличие от вероятности единичного события, которая не может превышать 1).

К.п. принято разделять на:

1) излучательные квантовые переходы:

a) спонтанные — не зависящими от внешних воздействий на квантовую систему;

b) вынужденные (индуцированные) — под действием внешнего электромагнитного излучения резонансной.

Но в рамках данной работы данный вид перехода рассматриваться не будет.

2) безызлучательные квантовые переходы также характеризуются вероятностями соответствующих переходов Cki и Cik, — средними числами процессов отдачи и получения энергии Ek — Ei в 1 сек, рассчитанными на одну частицу с энергией Ek (для процесса отдачи энергии) или энергией Ei (для процесса получения энергии).

Если возможны как излучательные, так и безызлучательные К. п., то полная вероятность перехода равна сумме вероятностей переходов обоих типов.

Учёт безызлучательных К. п. играет существенную роль, когда его вероятность того же порядка или больше соответствующего К. п. с излучением. Например, если с первого возбуждённого уровня E₂ возможен спонтанный излучательный переход на основной уровень E₁ с вероятностью A₂₁ и безызлучательный переход на тот же уровень с вероятностью C₂₁, то полная вероятность перехода равна A₂₁ + C₂₁, а время жизни на уровне равно ф'2 = 1/(A₂₁ + C₂₁) вместо ф2 = 1/ A₂ при отсутствии безызлучательного перехода.

Таким образом, за счёт безызлучательных К. п. время жизни на уровне уменьшается. При A₂₁ >> C₂₁ время ф'2 очень мало по сравнению с ф'₂, и подавляющее большинство частиц будет терять энергию возбуждения E₂ — E₁ при безызлучательных процессах — будет происходить тушение спонтанного испускания.

Рис. 3. Часть уровней квантовой системы:

Е1 — основной уровень (уровень с наименьшей возможной энергией), Е2, Е3, Е4 — возбуждённые уровни. Стрелками показаны квантовые переходы с поглощением (направление вверх) и с отдачей энергии (направление вниз).

2. Физические основы флуоресценции

2.1 Понятие и виды флуоресценции. Квантовый выход

Флуоресценция представляет собой одну из разновидностей «холодного свечения» молекул — люминесценци. Люминесценция обладает двумя свойствами, принципиально отличающими ее от других излучательных и безызлучательных процессов с участием света: отсутствием зависимости от температуры и большой длительностью, значительно превышающей период излучаемой световой волны.

Люминесценцию классифицируют по типу возбуждения, длительности свечения и механизму преобразования энергии. Фотолюминесценция возбуждатся светом, радиолюминесценция — ионизирующей радиацией, триболюминесценция — механическими деформациями, электролюминесценция — электрическим полем, хемилюминесценция — химическими реакциями и т. п.

По длительности свечения люминесценцию подразделяют на относительно быстро затухающую флуоресценцию (10^-11-10^-6 с) и более продолжительную фосфоресценцию (10^-3-10^-2 с). С точки зрения квантовой механики различия времени жизни люминесценцирующих молекул объясняются закономерностями поведения их электронов. Согласно этим представлениям электроны обладают спином — собственным моментом импульса (направлением вращения) s, который может принимать значения + Ѕ или — Ѕ. Атомы и молекулы имеют суммарный баланс спинов S = ?s, а также мультиплетность, которая определяется по формуле M = 2S + 1. Обычно молекула в невозбужденном состоянии содержит четное число электронов, причем число электронов со спином + Ѕ равно числу электронов со спином s = - Ѕ и поэтому S = 0, а М = 1. Это состояние молекулы обозначается как основное синглетное, или S₀. При возбуждении квантом энергии наиболее вероятным является переход молекулы из синглетного состояния S₀ в синглетное состояние S₁ без изменения баланса спинов и мультиплетности. Возможен также случай, когда в результате внутреннего энергетического процесса спин одного из электронов меняет знак, что приводит к появлению двух неспаренных электронов и переходе молекулы из синглетного S₀ в триплетное состояние Т₁ с S = 1 и М = 3. При обратной конверсии молекулы из возбужденного в основное состояние избыток энергии может излучаться в виде кванта света — фотона. Более вероятный излучательный переход между двумя энерегетическими уровнями одинаковой мультиплетности (S₁>S₀ или Т₁>Т₀) будет порождать флуоресценцию, тогда как при менее вероятном переходе между уровнями различной мультиплетности (например, Т₁>S₀) будет наблюдаться фосфоресценция. В связи с тем, что в микроскопах используется явление флуоресценции, все дальнейшее изложение будет касаться именно этой разновидности люминесценции.

По механизму преобразования энергии выделяют спонтанную, резонансную, вынужденную и рекомбинационную флуоресценцию. Элементарные акты спонтанной флуоресценции иллюстрирует диаграмма Яблонского (Рис. 8):

Заменить На более качественный

Рис. 4. Диаграмма Яблонского: S₀ — основной энергетический уровень молекулы, S₁' — безызлучательный энергетический уровень возбужденного состояния, S₁ — излучательный энергетический уровень возбужденного состояния; 1 — поглощение кванта hн_ex, 2 — релаксация молекулы, 3 — испускание кванта hн_em

В этой диаграмме, демонстрирующей для упрощения только синглетные переходы молекулы флуорохрома, рассматриваются три энергетических уровня: основной энергетический уровень S₀, излучательный уровень возбужденного состояния S₁ и безызлучательный уровень возбужденного состояния S₁'. Наличие двух уровней возбужденного состояния S₁' и S₁ отражает то обстоятельство, что, находясь в возбужденном состоянии, молекула теряет часть своей энергии из-за релаксации.

При спонтанной флуоресценции поглотившая энергию фотона молекула переходит из основного состояния S₀ в возбуждённое состояние S₁', затем совершает безызлучательный переход на энерегетичекий уровень S₁ и, наконец, переходит обратно в основное состояние S₀ с испусканием фотона (Рис.4).

Резонансная флуоресценция отличается тем, что после возбуждения молекул и переходе их из основного состояния S₀ в возбужденное состояние S₁', они возвращаются в состояние S₀, минуя энергетический уровень S₁. Условием резонансной флуоресценции является близкое и пространственно упорядоченное расположение молекул.

Может также возникнуть ситуация, когда молекула из возбужденного состояния S₁' не переходит сразу в излучательное состояние S₁, а оказывается в метастабильном состоянии с пониженной по сравнению с S₁ энергией. Поэтому для перехода молекулы в S₁ ей необходимо сообщить дополнительную энергию с помощью теплового движения или инфракрасного света. Этот физический процесс характерен для метастабильной, или стимулированной флуоресценции.

Поскольку на заключительном этапе передачи энергии в этом случае происходит рекомбинационное восстановление частиц, такой процесс обозначается как рекомбинационная флуоресценция.

Рассеяние энергии при безызлучательном переходе S₁'>S₁ в случае спонтанной флуоресценции приводит к двум последствиям.

Во-первых, энергия излученного фотона становится ниже энергии поглощенного фотона, и поэтому длина волны флуоресценции будет больше длины волны возбуждающего света. Следует, однако, отметить, что в новых микроскопах стали применять двухи многофотонную флуоресценцию, при которой молекулы флуорохрома на стадии возбуждения поглощают сразу два кванта или даже более. Энергия излучаемого фотона при этом будет не меньше, а больше энергии возбуждения.

Таблица 1

Сравнительная характеристика видов флуоресценции

Во-вторых, часть молекул в возбужденном состоянии не способна испускать фотоны при переходе в основное состояние, поскольку теряет энергию при конформационных перестройках и взаимодействии с молекулярным окружением. Для оценки эффективности излучательного перехода S₁>S₀ используется квантовый выход (QY) флуоресценции, который представляет собой отношение числа излученных фотонов к числу поглощенных. Квантовый выход не зависит от длины волны возбуждающего света, что связано с высокой скоростью колебательной релаксации молекулы флуорохрома. В случае спонтанной однофотонной флуоресценции из-за потерь энергии QY будет меньше 1.

Безызлучательную потерю энергии при переходе молекулы S₁>S₀ принято называть тушением флуоресценции. Тушение подразделяют на внутреннее (температурное), внешнее, концентрационное и т. д. Внутреннее, или температурное, тушение обусловлено колебательной релаксацией молекулы, которая возрастает при увеличении температуры. Внешнее тушение наблюдается при физических и химических взаимодействиях с другими молекулами, в результате которых флуорохром теряет способность к флуоресценции. Концентрационное тушение характерно для высоких концентраций флуорохрома, при которых его молекулы начинают поглощать собственное излучение. Различные вещества, например, многие цитологические фиксаторы и красители, могут полностью подавлять флуоресценцию.

Представленный на диаграмме Яблонского процесс флуоресценции является в реальных условиях циклическим, поскольку одна и та же молекула многократно поглощет и испускает фотоны. Поэтому для многоатомных молекул в растворе представленные на диаграмме дискретные переходы S₀>S₁ и S₁>S₀ будут порождать непрерывные энергетические спектры возбуждения и испускания, соответственно.

Следует отметить, что в разбавленных растворах спектр возбуждения флуорохрома совпадает с его спектром поглощения. Другая особенность большинства флуорохромов в растворе — зеркальная симметрия спектров возбуждения и испускания, при этом положение оси симметрии соответствует энергии электронного перехода S₁>S₀.

В связи с тем, что интенсивность флуоресценции значительно слабее интенсивности возбуждающего света, для ее наблюдения и регистрации необходимы специальные источники света, а также оптические фильтры для выделения спектров возбуждения и испускания.

2.2 Флуорохромы

Флуорохромами (флуорофорами) называют вещества, применяемые в флуоресцентной микроскопии для окрашивания микроструктур, не обладающих собственной флуоресценцией. В качестве флуорохромов могут быть использованы флуоресцирующие красители, пигменты и их производные, алкалоиды, антибиотики и другие соединения. Особый тип флуорохромов составляют флуорецентные молекулярные зонды (molecular probes), обладающие способностью специфически связываться с определенными молекулами в клетке, например, с ДНК. Благодаря специфичности их связывания и высокой чувствительности флуоресцентной микроскопии флуоресцентные зонды используются в очень низких концентрациях, что позволяет применять их для изучения живых клеток.

Рассматривая флуорецентную микроскопию в ретроспективном плане, видно, что каждый этап ее развития оставил в наследство современной клеточной биологии флуорохромы, которые до сих пор применяются при решении ее типичных задач. Большое распространение получили такие красители, как акридиновый оранжевый (АО), бромид этидия (БЭ) и иодид пропидия, представляющие собой специфические и стабильные зонды на ДНК. В последнее десятилетие большую популярность в качестве молекулярного зонда приобрел выделенный из медузы зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Этот белок представляет собой новый тип флуорохромов — молекулярно-генетические зондов, позволяющий маркировать гены и изучать их экспрессию в живых клетках.

Для того чтобы реализовать метод, основанный на конкретном флуорохроме, необходимо знать его спектры возбуждения и испускания, что является определяющим фактором для выбора необходимого для наблюдения его флуоресценции набора фильтров.

2.2.1 Флуорохромы, возбуждаемые синим светом

Наибольшей популярностью в микроскопии пользуются флуорохромы, возбуждаемые синим светом (450−490 нм), при этом наблюдается флуоресценция, цвет которой может варьировать от зеленого до темно-красного (> 520 нм). Этим условиям удовлетворяет целый ряд флуорохромов: флуоресцеин и его производные, аурамин, тетрациклин, корифосфин, GFP, АО и многие другие.

В частности АО флуоресцирует зеленым при связывании с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами и красным при связывании с одноцепочечными. Эти свойства АО позволяют различать ДНК и РНК, а также исследовать денатурацию ДНК при ее повреждении. Свободная форма АО флуоресцирует, создавая повышенный фон, он быстро разрушается под действием возбуждающего света, для измерения ДНК надо предварительно удалить РНК.

2.2.2 Флуорохромы, возбуждаемые зеленым светом

В значительной мере недостатков, присущих АО, лишен другой флуорохром на ДНК? БЭ, который использовался в ветеринарии как средство против трипаносом. БЭ возбуждается зеленым светом и флуоресцирует красным в соответствии с его спектрами возбуждения и испускания.

2.2.3 Флуорохромы, возбуждаемые ультрафиолетом

В последнее время часто пользуются флуоресцентным зондом на двухцепочечную ДНК Hoechst 33 342 (H33342), или бисбензимид.

В отличие от АО, БЭ и иодида пропидия, которые интеркалируют между основаниями двухцепочечной ДНК, H33342 встраивается в ее малую бороздку, значительно увеличивая при этом свою яркость. Этот флуорохром часто применяется для подсчета погибших апоптозом клеток, поскольку даже на малом увеличении микроскопа видно, что их ядра отличаются измененной морфологией и яркой синей флуоресценцией.

2.3 Совмещение флуорохромов и задача колокализации

Для отслеживания на клеточном уровне закономерностей синтеза биомолекул в ходе физиологических и патологических процессов возможно использование подхода сочетания ДНК-специфических зондов, по-разному взаимодействующих с клетками. Например, одновременная окраска клеток АО и БЭ позволяет различать живые клетки и погибшие некрозом или апоптозом (Рис. 9).

Рис. 5. Индикация живых клеток (alive), погибших некрозом (necrosis) и апоптозом (apoptosis). Клеточная линия К562, АО и БЭ.

БЭ не проникает в живые клетки и поэтому их ядра флуоресцируют зеленым из-за интеркаляции АО в двухцепочечную ДНК. Содержащие большое количество РНК ядрышки живых клеток флуоресируют красным, поскольку флуоресценция АО при связвании с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами смещается в длиннолволновую область. АО проникает также в клетки, погибающие апоптозом, в ядрах которых наблюдается распад хроматина на отдельные компактные скопления и фрагментация ДНК. Образующиеся при апоптозе фрагменты ДНК могут быть как двух-, так и одноцепочечными, поэтому хроматин этих клеток из-за наложения зеленой и красной флуоресценции приобретает желто-коричневые тона. В погибшие некрозом клетки проникает БЭ и, по-видимому, за счет более высокого сродства к ДНК, вытесняет АО, флуоресцируя насыщенным красным светом.

Таким образом, несмотря на внешнюю простоту методики, в ее молекулярном механизме сочетается сразу несколько факторов — различия флуорохромов по способности проникать через плазмалемму живых и мертвых клеток, изменения спектра излучения при взаимодействии с однои двухцепочечными формами нуклеиновых кислот и конкуренция флуорохромов за места связывания. Еще одним примером совмещения ДНК-зондов при анализе состояния клеток является одновременная их обработка H33342 и БЭ, при которой живые клетки флуоресцируют синим, а погибшие — красным. При выборе флуорохромов, особенно для задач совмещения и колокализации, целесообразно учитывать не только их спектральные характеристики, но также коэффициент молярной экстинции (е) и квантовый выход (QY), от которых зависит относительная яркость флуоресценции. В таблице приведены основные фотофизические свойства ряда известных флуорохромов.

Таблица 2

Фотофизические свойства некоторых флуорохромов

Из приведенных в таблице данных следует, что флуорохромы могут достаточно сильно отличаться по своей относительной яркости. Среди флуоресцентных меток более высоким QY обладает родамин (TRITC). Флуоресцентные зонды на ДНК не отличаются высокой яркостью за исключением флуорохромов Hoechst, сопоставимых по этому показателю с флуоресцентными метками антител и GFP.

Наиболее высокой яркостью обладают универсальные флуорохромы Quantum Dots (QD) на основе нанокристаллов ZnS/CdSe — наночастицы люминесцентных полупроводников, которые привлекли большой интерес ввиду их потенциального применения в различных биологических и медико-биологических областях. Размер QD зависит от фотолюминесценции, широты и интенсивности спектров поглощения, высокой фотостабильности и гибкой модификации поверхности QD.

Несколько лет назад было высказано предположение, что QD могут быть использованы в фотодинамической терапии (ФДТ) рака, как доноры энергии для обычных фотосенсибилизаторов (ФС) порфиринового типа. Порфирины — типичные светзависимые вещества, используемые ФДТ, характеризующиеся высоким QY синглетного кислорода и его дальнейшим накоплением в опухоли.

3. FRET-микроскопия

В то время как световая микроскопия позволяет нам понять организацию клеточной структуры и связанные с ней функции, молекулярно-биологических исследований на протяжении последних нескольких десятилетий показали, что клеточные события, такие как передача сигналов и транскрипция генов, требует сборки белков в специфические макромолекулярные комплексы. Традиционные биофизические и биохимические методы не предоставляют прямой доступ к взаимодействиям этих белков-партнеров в их естественной среде. Достижения в области FRET-микроскопии (широкопольная, конфокальная и многофотонная т.д.) позволяют изучать эти взаимодействия в неповрежденных живых клетках.

FRET-микроскопия основана на способности улавливать флуоресцентные сигналы от взаимодействия меченых молекул в живой или фиксированный клетках. Если FRET происходит, то сигнал донора угаснет, а сигнал акцептора будет повышенным.

Существует несколько видов FRET-микроскопии, каждый со своими преимуществами и недостатками. Они используются для различных биологических исследований, включая исследования структуры органелл, конъюгированных антител, цитохимических идентификации и окислительного метаболизма.

Конфокальное FRET-изображение (Figure 1), с улучшенным пространственным разрешением дает богатство спектральной информации с несколькими преимуществами по сравнению с широкопольным изображением, в том числе возможность регулировать показатель резкости.

Конфокальный FRET обеспечивает новый подход к измерению вязкоупругости и биохимических реакций живых клеток и позволяет проводить мониторинг изменений клеточной мембраны в естественной среде в реальном времени. Однако конфокальная микроскопия ограничивается стандартным лазером с определенной длинной волны. MP-FRET-микроскопия позволяет преодолеть это ограничение с помощью перестраиваемого лазера (с диапазоном 700−1000 нм), что позволяет возбуждать флуорофоры боле широкого спектра и давать более высокое разрешение, снижение фотообесцвечивания маркера красителей и повышение жизнеспособности клеток. Эти преимущества позволяют проводить исследования на толстых образцах живой ткани. Тем не менее, FRET-методы требуют программного обеспечения для обработки, чтобы удалить нежелательные «затемнения» компонентов в изображение (Figure 2).

Другими методами визуализации FRET является техника прижизненной флуоресценции (FLIM). Данный метод отслеживает локальные изменения флуоресценции зондов и обеспечивает огромное преимущество для визуализации разичных событий в живых клетках. В сочетании с FRET, этот подход обеспечивает прямые доказательства физического взаимодействия между двумя или более белками с очень высоким пространственным и временным разрешением.

4. Подбор пар для FRET

Открытие зеленого флуоресцентного белка GFP и получение мутантных форм GFP с широким спектром флуоресценции, а также открытие новых флуоресцентных белков, привело к созданию ряда FRET-пар, представляющих собой генетически кодируемые сенсоры внутриклеточных процессов.

В связи с этим, FRET-подход используют для оценки расстояния между связанным субстратом и каталитическими сайтами в очищенном Р-гликопротеине (Pgp) (мембранный белок-переносчик, отвечающий за выведение цитостатиков из клетки, что способствует приобретению клеткой полирезистентности (множественной лекарственной устойчивости)).

Флуоресцентный краситель H33342, имеющий высокое сродство к Pgp, связывается с белком-переносчиком и выступает в качестве донора. H33342 флуоресцентный краситель высококачественные решения H33342 — краситель для фиксированных и живых клеток для флуоресцентного окрашивания ДНК и ядер в методах клеточной визуализации. Интересно заметить, что H33342 показал значительное повышение флуоресценции при связывании, указывая, что сайт связывания с лекарственными препаратами находится в неполярной среде.

Помимо H33342, были хорошо исследованы пары на основе красителей родамин 123 (R123), родамин 610 (R610) и оксазин 4 (Ox4). Молекулы красителя играют роль молекулярных доноров энергии (R123), энергитических акцепторов (Ox4), или обоих (R610). В биохимии широко применяется R123, как ингибитор функций митохондрий. R123 связывается с митохондриальной мембраной и подавляет транспортные функции. Данный краситель является основанием Pgp, который обычно выявляется в раковых клетках.

Следует отметить, что FRET-пары на основе флуоресцентных белков имеют ряд недостатков. Во-первых, флуоресценция значительной части пар белков или накладывается на собственную флуоресценцию живых клеток, или имеет сильное перекрывание спектров возбуждения донора и флуоресценции акцептора. Во-вторых, светорассеяние клеток является причиной значительного фонового сигнала.

В настоящее время разработан ряд систем с временным разрешением, полученных химическим путем, позволяющих решить проблему фонового сигнала за счет принципа временной дискриминации.

FRET-пары на основе лантанидов нашли применение в гомогенных методах анализа белков, гормонов, лиганд-рецепторных взаимодействий, для определения ПЦР продуктов, олигонуклеотидных сшивок и внутри и межмолекулярных расстояний между нуклеотидами.

Генетически кодируемые FRET-пары на основе пептидных хелатов и флуоресцентных белков имеют два важных преимущества. Во-первых, для использования в аналитических реакциях in vitro становится возможным получать генноинженерными методами высокостандартизованные биохимические реагенты со строго определенными точками присоединения доноров и акцепторов к белкам и антигенам, отличие от химической модификации белков и антигенов, при которой точки присоединения к белкам не всегда могут быть точно установлены. Во-вторых, такие FRET-пары в экспериментах in vivо не требуют внешней инъекции и минимизируют стрессовое воздействие на клетку, что делает возможным их использование в активно растущих и постоянно делящихся клетках.

К примеру, можно привести такие FRET-пары, как BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, and Cy3-Cy5, TagBFP-TagGFP2, TagGFP2-TagRFP и т. д.

5. FRET как явление

5.1 Механизм FRET

FRET — процесс, при котором происходит безызлучательнный перенос энергии из возбужденного состояния одного флуорофора на другой хромофор в непосредственной близости:

D*+A=D+A*

А из-за того, что диапазон, в котором осуществляется передача энергии составляющий примерно 10 нм (100 ?), и эффективность самой передачи сильно зависят от расстояния между флуорофорами.

Механизм FRET включает в себя наличие доноров флуорофора в возбужденном электронном состоянии, которые могут безызлучательно передавать свою энергию возбуждения хромофору-акцептору через дальнее диполь-дипольное взаимодействие. Теория механизма FRET основана на рассмотрении возбужденного флуорофора как осциллирующего диполя, который может подвергаться обмену энергией со вторым диполем с одинаковой частотой резонанса. В связи с этим, FRET аналогичен поведению связанных осцилляторов (например, паре камертонов, которые вибрируют на одинаковой частоте), в отличие от излучательного переноса энергии, который требует испускания и реабсорбции фотонов, и который зависит от физических размеров и оптических свойств образца. Таким образом, в отличие от радиационных механизмов, FRET может предоставить значительно больше структурной информации о донорно-акцепторные паре.

Явление FRET не опосредовано излучением фотона, и более того, даже не требует флуоресценции акцептора. В большинстве случаев и донор, и акцептор флуорицируют, и тогда FRET проявляется через тушение флуоресценции донора и сокращение времени самой флуоресценции, что сопровождается также и увеличением излучения флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния между молекулами донора и акцептора. Следовательно, измерения FRET могут быть использованы в качестве эффективного молекулярного «двигателя» для определения расстояния между биомолекулами, описанными как донор и акцептор, если они находятся в пределах 10 нм друг от друга.

Рис. 6. Изображение межмолекулярного FRET

Пример явления FRET между двумя флуорохромами, прикреплёнными к противоположным концам одного макромолекулярного белка, представлен?? на Рис. 6. В нативной конформации (Рис. 6 (а)), два флуорофора отделены друг от друга на расстоянии около 12 нм — слишком далеко для протекания FRET. Однако, когда белок претерпевает конформационные изменения (под действием каких-либо факторов) (Рис. 6 (b)), два флуорохрома становятся гораздо ближе друг к другу, и теперь могут участвовать во взаимодействии. На Рис. 6 (а), возбуждение донора обозначено голубым свечением вокруг желтой трехядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая эмиссия акцептора (Рис. 6 (b)) представлена?? зеленым свечением, окружающее второй гетероциклический флуорохром с правой стороны белка.

Измерение FRET часто используются для оценки расстояния между макромолекулами и конформационных изменений на этих расстояниях. В данном случае, степень FRET используется для расчета расстояния между донором и акцептором и с целью получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя FRET часто используются для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных изменений в белках и липидах, основным препятствием на пути реализации FRET в живых клетках было отсутствие подходящих методов для маркировки конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофорами. Клонирование GFP и его экспрессия в самых разнообразных типах клеток стало основополагающим ключом к развитию маркеров для экспрессии генов и локализации структурных белков в живых клетках. Было разработано несколько спектральных различных вариантов мутации белка, в том числе флуоресцентный белок, который испускает синий свет (BFP). Оба спектра возбуждения и излучения в нативных GFP и BFP мутантах оказались различны по длине волны, и, следовательно, не могут быть совместимы с FRET подходом.

Рис. 7 иллюстрирует механизм выявления белок-белковых взаимодействий с помощью FRET и мутантов флуоресцентных белков. Если два белка, один меченный BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то увеличение интенсивности излучения максимума (510 нм) акцептора будет наблюдаться, когда комплекс возбуждается на максимальной длине волны поглощения (380 нм) донора. Если белки будут образовывать комплекс, то флуоресценция акцептора (GFP) не будет наблюдаться.

Рис. 7. Выявление FRET in vivo в белок-белковых взаимодействиях

В сочетании с достижениями в технологи лазеров, оптики микроскопа и компьютерных технологий визуализации, разработки маркировочной методики, в которой доноры и акцепторы флуорофора на деле являются частью биомолекул, позволили визуализировать динамические взаимодействий белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белков, недавние достижения во FRET исследовании включают изучение изменения потенциалов мембраны, кальциевого обмена, а также проведение множества скрининг-анализов, например, для количественной оценки экспрессии генов в отдельных живых клетках.

5.2 Принцип FRET

FRET можно наблюдать, когда флуорофор-донор в электронно-возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору-акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы донора перекрывает спектр поглощения молекулы акцептора, а обе молекулы находятся в минимальном пространственном радиусе, то донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через дальнее диполь-дипольное межмолекулярное взаимодействие.

Теория, предложенная Теодором Ферстером в конце 1940;х, первоначально описывает молекулярные взаимодействия молекул, участвующих в передаче энергии резонанса. Также Ферстер разработал уравнение, определяющее отношения между скоростью передачи энергии, межхромофорное расстояние и спектральные свойства участвующих хромофоров.

FRET — это безрадиационный квантовый механический процесс, который не требует физического столкновения и не связан с производством тепла. Когда происходит передача энергии, молекулы акцептора подавляет флуоресценцию молекулы донора, и если акцептор сам является флуорохромом, то наблюдается повышение флуоресцентного излучения (Рис. 8). Явление можно наблюдать при возбуждении образца, содержащего как молекулы донора, так и молекулы акцептора, светом с длинами волн, соответствующих максимуму поглощения флуорофора-донора, и выявление света, излучаемого при длинах волн с максимумом излучения акцептора.

Альтернативный метод обнаружения, который к слову становится наиболее популярным на сегодняшний день, заключается в измерении флуоресценции жизни донора-флуорофора в присутствии и в отсутствии акцептора.

Рис. 8. Диаграмма Яблонского

На Рис. 8 представлена диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и абсорбции акцептора. Переходы поглощение и излучение представлены прямыми вертикальными стрелками (зеленые и красные, соответственно), в то время как колебательная релаксация обозначается волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы нарисованы пунктирными линиями, которые предлагают их правильное размещение на диаграмме, если они возникли посредством электронных переходов фотонов. В присутствии подходящего акцептора, донор может передать энергию возбуждения непосредственно акцептору без излучения фотона (синяя стрелка на Рис. 8).

Сенсибилизация флуоресцентного излучения имеет характеристики аналогичные спектру излучения акцептора.

5.3 Физические показатели. Обоснование теории Ферстера

Дополнительное требование для передачи энергии заключается в том, что прижизненная флуоресценция молекулы донора должна быть достаточно продолжительной. Оба показателя — скорость (КТ) и эффективность передачи энергии (ET) — имеют непосредственное отношение к времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Согласно теории Ферстера, проверенной экспериментально, скорость передачи энергии задается уравнением:

KT = (1/tD) * [R0/r]⁶

где R0 — Ферстерское расстояние, TD — время жизни молекулы донора в отсутствии молекулы акцептора, а r — расстояние между молекулами донора и акцептора. R0 считается как радиус, разделяющий акцептор и донор, для которых скорость передачи энергии равна скорости высвечивания (потери флуоресценции) донора в отсутствие акцептора. Другими словами, когда r между молекулами донора и акцептора равен R0, то коэффициент передачи составляет 50%. В этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается через резонансный перенос акцептору, в то время как другая половина рассеивается через какие-либо другие различные процессы, включая флуоресцентное излучение.

R0 является максимальным расстоянием между молекулами донора и акцептора, при которых по-прежнему будет происходить передача энергии. Значение R0 обычно находится в пределах от 2 до 6 нм (максимально 10 нм). Кроме того, диапазон R0 также может соответствовать нескольким другим биологическим значимым размерам, таким как толщина мембраны и расстояние, отделяющее сайты на белках, имеющих несколько подразделений.

Значение R0 может быть рассчитано по следующей формуле:

R0 = 2.11×10^-2 * [k² * Jl * h^-4 * QD]^1/6

где k² — фактор, характеризующий относительную ориентацию в пространстве между переходом диполей донора и акцептора, Jl — интеграл перекрытия в области спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора (с длиной волны в нм), h — показатель преломления среды, и QD — квантовый выход донора.

ET — мера (доля) поглощения фотонов донором, которые передаются акцептору, и связана с донорно-акцепторными расстоянием r по уравнению:

r = R0 * [(1/ET) — 1]^1/6

Таким образом, ET вычисляется как:

ET = 1 — (tDA/tD)

где tDA — время жизни донора в присутствии акцептора и tD — время жизни донора в отсутствии акцептора.

Поэтому, измеряя время прижизненной флуоресценции донора в присутствии и в отсутствии акцептора (что свидетельствует о степени тушения донора из-за активности акцептора), можно определить расстояние, отделяющее молекулы донора и акцептора.

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени спектрального перекрытия излучения донора и поглощения акцептора (Рис. 9), QY_D, взаимной ориентации преобразования дипольных моментов молекул донора и акцептора, а также расстояния, отделяющего молекулы донора и акцептора. Любое событие, которое влияет на показатель расстояния между донором и акцептором, повлияет и на скорость передачи энергии, и, следовательно, позволит произвести количественные расчёты, при условии, что артефакты будут устранены.

Рис. 9. Спектры поглощения и излучения белка CFP и белка RFP

На Рис. 9 представлены спектры поглощения и излучения белка CFP (донор) и белка RFP (акцептор) в сравнении на предмет их потенциального применения в качестве флуоресцентной пары для передачи энергии. Спектры поглощения для обоих биологических пептидов показаны как красные кривые, в то время как спектры излучения представлены в виде синих кривых. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена серой зоной у основания кривых. Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул увеличивается, наблюдается явление, известное как спектральное bleed-through («проступание»), или пересечение, при котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий в результате возбуждения донора) и излучения донора обнаруживаются в акцепторном канале излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который должен быть извлечен из слабого флуоресцентного излучения акцептора.

Теория безызлучательной передачи энергии непосредственно применима к донорно-акцепторной паре, разделенной фиксированным расстоянием. В этом случае КТ зависит от R0, которое в свою очередь, зависит от k², Jl, h, и QD. Если эти факторы известны, то можно рассчитать расстояние между молекулами донора и акцептора. Поскольку переменная включает в себя квантовый выход донора QYD и степень спектрального перекрытия Jl (оба зависят от условий окружающей среды) Ферстерское расстояние должно быть определено при одинаковых условиях эксперимента.

Показатель преломления среды h, как правило, известен из состава растворителя, или может быть рассчитан для конкретной макромолекулы, и обычно равен 1,4 в водном растворе. QYD определяется в сравнении со стандартными флуорофором с уже известным QY. Поскольку QYD находится как корень шестой степени из R0, допускаются небольшие ошибки или неопределенности в значении QYD и не имеют большого влияния на расчет R0. В связи с этим R0 не сильно зависит от изменения Jl, но интеграл перекрытия все равно должен быть рассчитан для каждой донорно-акцепторной пары. В целом, более высокие степени перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора увеличивают значение Ферстерского расстояния.

Неопределенность в оценке фактора ориентации k² широко обсуждается в литературе и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Ферстера действительна и применима, эта переменная продолжает носить спорный характер. Это значение результатов от рандомизации донорных и акцепторных ориентации вращательной диффузии до передачи энергии. Ориентационный фактор k² зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора, и может варьировать от 0 до 4. Значение 1 соответствует параллельному переходу диполей, в то время как значение 4 — диполи параллельны на одной прямой.

Наиболее серьезные ошибки происходят в случае, если диполи ориентированы строго перпендикулярно друг к другу и соответствующее значение k² становится равным 0. Измерение анизотропии флуоресценции для донора и акцептора может позволить определить пределы вариации значения k². Кроме того, использование флуорофоров с низкой флуоресцентной поляризацией снижает неопределенность в значении фактора ориентации k². Таким образом, ограничение возможных значений k² снижает вероятность ошибки расчета расстояния (до 10%).

Во многих случаях, фактор ориентации k² трудно определить, и точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема. Однако некоторые данные указывают на ограничения важности фактора в расчетах. Для сравнение расстояния донор-акцептор, используя FRET спектроскопию и рентгеновский дифракционный метод, в значительной степени оправдывает предполагаемое значение 0,67 для фактора ориентации k² (как предложено теорией Ферстера), по крайней мере для малых пептидов и белков. Данное значение для фактора ориентации k² является действительным при условии, что оба — донор и акцептор — смогут свободно проходить неограниченность изотропного движения.

Рис. 10. Факторы ориентации

Зависимость фактора ориентации от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (Рис. 10) задается уравнением:

k² = (cos qT — 3cos qD cos qA)² = (sin qD sin qA cos f — 2cos qD cos qA)²

где qT — угол между испускания диполя донора и поглощением диполя акцептора, qT и qA — углы между этими диполями и вектором, соединяющий донор и акцептор, f — угол между плоскостями.

FRET очень чувствителен к изменениям расстояния между молекулами донора и акцептора. Рис. 11 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью передачи и расстоянием, отделяющего молекулы донора и акцептора. Эффективность резко возрастает до 100%, в то время как расстояние уменьшается ниже R0, и, наоборот, уменьшается до 0, когда r больше, чем R0. Из-за высокой зависимости эффективности передачи энергии от расстояния, измерение донорно-акцепторного расстояния применимо только тогда, когда радиус донор-акцептор лежит в пределах расстояния Ферстера. Когда r составляет около 50% от R0, то степень FRET почти достигает своего максимума и более не возможно достоверно определить короткие расстояния. Когда расстояние донор-акцептор R0 превышает 50%, наклон кривой можно принимать как незначительный.