Лекция № 5. Общая вирусология. 
Классификация, структура и особенности биологии вирусов. 
Бактериофаги

Открытие вирусов Д. И. Ивановским в 1892 г. положило начало развитию науки вирусологии. Более быстрому ее развитию способствовали: изобретение электронного микроскопа, разработка метода культивирования микроорганизмов в культурах клеток.

Слово «вирус» в переводе с латинского — яд (животного происхождения). Этот термин применяют для обозначения уникальных представителей живой природы, не имеющих клеточного (эукариотического или прокариотического) строения и обладающих облигатным внутриклеточным паразитизмом, т. е. которые не могут жить без клетки.

В настоящее время вирусология — бурно развивающаяся наука, что связано с рядом причин:

• — ведущей ролью вирусов в инфекционной патологии человека (примеры — вирус гриппа, ВИЧ — вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус и другие герпесвирусы) на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии;
• — использованием вирусов для решения многих фундаментальных вопросов биологии и генетики.

Основные свойства вирусов (и плазмид), по которым они отличаются от остального живого мира.

• 1. Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие — от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм.
• 2. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа — или ДНК (ДНК — вирусы) или РНК (РНК — вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК.
• 3. Вирусы не способны к росту и бинарному делению.
• 4. Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты.
• 5. У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок — синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.
• 6. Средой обитания вирусов являются живые клетки — бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.

Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной — вирион и внутриклеточной — вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов — конечной фазы развития вирусов.

Строение (морфология) вирусов.

• 1. Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК — вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК — вирусов).
• 2. Капсид — белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц — капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид — спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы).

При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего — двадцатигранники — икосаэдры.

• 3. Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид, т. е. комплекс генома с капсидом и называются «голыми».
• 4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина — суперкапсид. Такие вирусы называют «одетыми».

Кроме вирусов, имеются еще более просто устроенные формы способных передаваться агентов — плазмиды, вироиды и прионы.

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

• 1. Адсорбция — пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа — гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека — гликопротеин gp 120).
• 2. Проникновение — путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).
• 3. Освобождение нуклеиновых кислот — «раздевание» нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.
• 4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т. е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.
• 5. Сборка вирионов — ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.
• 6. Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.

Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина.

• 1. Абортивный процесс — когда клетки освобождаются от вируса:
  • — при инфицировании дефектным вирусом, для репликации которого нужен вирус — помощник, самостоятельная репликация этих вирусов невозможна (так называемые вирусоиды). Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, его Hbs — антигена, аденоассоциированный вирус — в присутствии аденовируса);
  • — при инфицировании вирусом генетически нечувствительных к нему клеток;
  • — при заражении чувствительных клеток вирусом в неразрушающих условиях.
• 2. Продуктивный процесс — репликация (продукция) вирусов:
  • — гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект) — результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц — характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;
  • — стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные инфекции) — так называемая вирусная трансформация клетки.
• 3. Интегративный процесс — интеграция вирусного генома с геномом клетки хозяина. Это особый вариант продуктивного процесса по типу стабильного взаимодействия. Вирус реплицируется вместе с геномом клетки хозяина и может длительно находиться в латентном состоянии. Встраиваться в ДНК — геном хозяина могут только ДНК — вирусы (принцип «ДНК — в ДНК»). Единственные РНК — вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина — ретровирусы, имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции — синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Основные методы культивирования вирусов.

• 1. В организме лабораторных животных.
• 2. В куриных эмбрионах.
• 3. В клеточных культурах — основной метод.

Типы клеточных культур.

• 1. Первичные (трипсинизированные) культуры — фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т. д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т. е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.
• 2. Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).
• 3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т. е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе — например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

Специальные питательные среды для культур клеток.

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста — среда 199, Игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L — цистеин и L — глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови) — их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) — для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Выявляемые проявления вирусной инфекции клеточных культур.

• 1. Цитопатический эффект.
• 2. Выявление телец включений.
• 3. Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.
• 4. Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2) — красный. Размножение клеток меняет рН и соответственно — цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.
• 5. Выявление гемагглютинина вирусов — гемадсорбция, гемагглютинация.
• 6. Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки — вирусные «клеточно — негативные» колонии.

Номенклатура вирусов.

Название семейства вирусов заканчивается на «viridae», рода — «virus», для вида обычно используют специальные названия, например — вирус краснухи, вирус иммунодефицита человека — ВИЧ, вирус парагриппа человека типа 1 и т. д.

Вирусы бактерий (бактериофаги).

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки — икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т. е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т. е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий.

• 1. Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).
• 2. Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.
• 3. Репродукция фага.
• 4. Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие редуктивную фаговую инфекцию (редукцию фага). В последнем случае геном фага в клетке не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка — репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями — в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на:

• — поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);
• — моновалентные (лизируют бактерии одного вида);
• — типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) — теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа).

Практическое использование бактериофагов.

• 1. Для идентификации (определение фаготипа).
• 2. Для фагопрофилактики (купирование вспышек).
• 3. Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).
• 4. Для оценки санитарного состояния окружающей среды и эпидемиологического анализа.