Специальные исследования. 
Молочнокислые бактерии: молочнокислые стрептококки

В специальных научно-производственных лабораториях выделяют штаммы молочнокислых микроорганизмов, изучают их свойства, селекционируют, составляют и получают закваски, которые направляют на предприятия молочной промышленности, где вырабатывают производственные закваски.

В цехах по производству заквасок готовят сухой и жидкий бактериальные концентраты, маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок, а также получают натуральные и сухие кефирные грибки (зерна).

Сухой бактериальный концентрат в нашей стране чаще вырабатывают трех видов: мезофильных молочнокислых стрептококков, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных молочнокислых палочек. Жидкий бактериальный концентрат готовят из мезофильных молочнокислых стрептококков.

Процесс приготовления сухого бактериального концентрата включает следующие основные этапы: выращивание заквасочных микроорганизмов, бактофугирование полученной культуры, высушивание суспензии клеток, фасование бакконцентрата. бактерия стрептококк кисломолочный Питательной средой для выращивания молочнокислых бактерий является молочная сыворотка с добавлением кукурузного экстракта (или аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса), буферных солей и стимуляторов роста. В качестве буферных солей используют цитрат натрия или ацетат натрия. Стимуляторами роста молочнокислых бактерий являются сульфат марганца, аскорбиновая кислота и др.

Молочнокислые бактерии различаются по потребности в стимуляторах роста, в связи с этим предложены различные питательные среды для выращивания мезофильных, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек.

В Приложении № 1 представлены рецептуры питательных сред (на 1000 дм³) для наращивания клеток молочнокислых бактерий различных видов.

При приготовлении среды в сыворотке устанавливают рН 4,5−4,6 (оптимальную для выделения белков), нагревают ее до 95? С и выдерживают 60 мин для более полного выделения белков. После этого сыворотку осветляют путем сепарирования.

В осветленную сыворотку добавляют компоненты среды согласно рецептуре, устанавливают оптимальную рН, стерилизуют при 0,05 МПа в течение 60 мин и охлаждают до температуры, оптимальной для роста микроорганизмов.

Стерилизация и охлаждение питательной среды, а также наращивание клеток молочнокислых бактерий осуществляются в ферментере, имеющем мешалку, в котором автоматически регулируются температура и рН на заданном уровне.

В подготовленную стерильную среду, охлажденную до оптимальной температуры развития того или иного вида молочнокислых бактерий, подают закваску в количестве 5−8% (на сывороточной среде) или 3−5% (на обезжиренном молоке).

Наращивание клеток мезофильных молочнокислых стрептококков ведут в ферментере при температуре 30? С в течение 10−12 ч, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек — при 40 °C на протяжении 8−9 ч при автоматическом поддерживании рН. При этом рН культуральной жидкости достигает для стрептококков 6,5−6,8, для ацидофильных палочек 5,7−6,0.

После окончания выращивания культуру охлаждают до 3−8°С и направляют на бактофугирование для получения бактериальной массы.

Отделение клеток от среды осуществляют в конце логарифмической фазы роста, когда в культуральной жидкости (в 1 см³) содержатся сотни миллионов — единицы миллиардов активных клеток. Бактериальную массу из культуральной жидкости выделяют на бактофуге. Для этой цели можно использовать центрифугу и молокоочиститель.

Бактериальная масса после бактофугирования содержит сотни миллиардов клеток в 1 см³; выход бакмассы составляет 0,5−0,8%. Полученную бактериальную массу смешивают с защитной средой в соотношении 1: 2 — 1: 4. В состав защитной среды для мезофильных молочнокислых стрептококков входят: обезжиренное молоко с содержанием 16% сухих веществ — 30% и 70% водного раствора, содержащего сахарозу (5%), желатозу (5%), цитрата натрия (5%), глутамата натрия (2%). В состав защитной среды для ацидофильной палочки вместо цитрата натрия вносят 5% уксуснокислого натрия. Защитная среда для термофильного стрептококка включает 20% обезжиренного молока и 80% водного раствора, содержащего по 2,2% сахарозы, желатозы, лимоннокислого натрия и 1,2% глутамата натрия.

Желатоза представляет собой желатин после стерилизации под давлением 0,15 МПа в течение 2,5−3,0 ч. После стерилизации желатин теряет способность образовывать гель.

Полученную суспензию клеток молочнокислых бактерий высушивают. Для этого ее разливают на лотки слоем 6−8 мм или фасуют по 2 см³ во флаконы. Суспензию высушивают в установке для сублимационной сушки сначала при низкой отрицательной температуре —35-(-45)°С, досушивание — при положительной температуре (40−45 °С). Продолжительность сушки суспензии на лотках 6−12 ч, во флаконах.

24−42 ч. Сухой бактериальный концентрат, высушенный на лотках, размельчают и фасуют во флаконы порциями по 1−1,5 г.

Концентрат содержит от 150 до 300 млрд клеток в 1 г. Массовая доля влаги в нем не должна превышать 3,5%. Допускается наличие посторонней непатогенной микрофлоры не более 10 клеток в 1 г.

Продолжительность свертывания молока при внесении одной порции концентрата на 1 дм³ молока при оптимальной температуре составляет: у мезофильных стрептококков 4,0−5,5 ч, у термофильных молочнокислых стрептококков 3,0−4,5, а у ацидофильных палочек 2.5−3,5 ч.

Срок хранения концентрата при температуре 3−10 °С 8 мес со дня выработки.

Жидкий бактериальный концентрат мезофильных молочнокислых стрептококков так же как и сухой, применяется при производстве творога и сметаны. Его готовят так же, как и сухой. Приготовление отличается лишь исключением двух операций: замораживания и сушки. Концентрат разливают во флаконы по 5±0,5 см³ (полпорции) и по 10 ± 0,5 см³ (порция), укупоривают, охлаждают до температуры +8-(-5) °С и хранят не более двух месяцев со дня выработки. Жидкий бактериальный концентрат содержит не менее 150 млрд. клеток в 1 см³. Допускается содержание посторонней непатогенной микрофлоры не более 20 клеток в 1 см³.

Кефир — кисломолочный продукт смешанного брожения, для приготовления которого используются кефирные грибки. Они имеют определенную структуру и ведут себя биологически, как живой саморегулирующийся организм: растут, делятся и обладают наследственностью.

При гистологическом исследовании срезов видны переплетения нитей, которые образуют строму грибка, удерживающую остальную группу микроорганизмов, состоящую из:

• 1) из мезофильных молочнокислых стрептококков (Str. lactis);
• 2) из мезофильных молочнокислых палочек (Betaи Streptobacterium);
• 3) из термофильных молочнокислых палочек (L. casei);
• 4) из молочных дрожжей, прочно связаных со стромой гриба.

Молочнокислые бактерии, гидролизуя лактозу, снабжают молочные дрожжи кислотой, необходимой им для жизнедеятельности, а дрожжи, вызывая спиртовое брожение, насыщают продукт углекислотой, что придает кефиру особый вкус.

Методика приготовления грибковой кефирной закваски: в пастеризованное и охлажденное до температуры +20°С молоко вносят 5% кефирных зерен, заквашивание происходит в течение 10−12 ч. Затем грибковую закваску процеживают через сито и используют как производственную закваску для приготовления потребительского кефира, у которого определяют вкус, запах и качество сгустка.

Качество закваски регулярно проверяют, определяют активность (скорость сквашивания, кислотность), органолептические качества, наличие посторонней микрофлоры путем просмотра микроскопического препарата в 10 полях зрения микроскопа.

Кефирные грибки (зерна) представляют естественную симбиотическую закваску для кефира. В них входят молочнокислые стрептококки, палочки, дрожжи и уксуснокислые бактерии (приложение № 2).

Процесс получения натуральных кефирных грибков включает подготовку молока, культивирование кефирных грибков, отделение, фасование, укупоривание, маркирование и хранение. Для культивирования кефирных грибков используют обезжиренное молоко, пастеризованное при температуре 92−95 °С в течение 20−30 мин, в которое помещают грибки в соотношении 1:20. Выращивание проводят при температуре 18−22 °С. Ежедневно молоко меняют, т. е. грибки заливают свежими порциями питательной среды. Молоко, в котором культивировались кефирные грибки, представляет собой уже культуральную кефирную закваску, содержащую ту же микрофлору, что и кефирный грибок.

По мере роста грибков 1−2 раза в неделю их отделяют от закваски, фасуют порциями в стерильные флаконы, заливают обезжиренным молоком или сывороткой. Срок хранения кефирных грибков составляет 10 дней при температуре 8−10 °С.

Сухие кефирные грибки получают из натуральных (живых) кефирных грибков путем высушивания в защитной среде, состоящей из молочной сыворотки с добавлением 0,5% сахара и 0,01% аскорбиновой кислоты.

Отделенные от культуральной закваски грибки помещают в защитную среду в соотношении 1:20 и выдерживают в ней 5−6 ч при температуре 20−22 °С для наращивания дрожжей, которые являются наиболее чувствительными к замораживанию и высушиванию. После этого грибки отделяют от защитной среды, укладывают на стерильные лотки слоем 8 мм, закрывают стерильной марлей и помещают в морозильный шкаф при температуре — 20−25 °С на 1,5−2 ч. Грибки сушат в установке сублимационной сушки. Температура в начале сушки 15−20°С, конечная температура досушивания 30−35°С. Продолжительность сушки 8−10 ч.

Сухие кефирные грибки фасуют порциями по 10, 20, 50, 100 г в пакеты из полиэтилен-целлофана и запаивают. Срок хранения кефирных грибков 3 мес при температуре не выше 8 °C. Сухие кефирные грибки содержат не более 4,5% влаги.

Продолжительность сквашивания молока при соотношении грибка и молока 1: 40 и температуре 18−22 °С для натуральных грибков составляет 16−18 ч, ддя сухих — 24−28 ч. Кислотность сгустка 90−110 °Т. В микроскопическом препарате наблюдаются диплококки, короткие цепочки, единичные палочки и клетки дрожжей.

Состав микрофлоры кефирной закваски (производственной и грибковой) определяют методом предельных разведений путем посева различных разведений в стерильное обезжиренное молоко и культивирования их в течение 3 сут. После этого микроскопируют препараты, приготовленные из содержимого пробирок со свернувшимся молоком. На основании полученных результатов составляют числовую характеристику и определяют количество лактококков и лактобактерий по методике, описанной при определении молочнокислых бактерий в молоке.

Ароматобразующие молочнокислые стрептококки выявляют на плотной среде с цитратом кальция при посеве различных разведений закваски. Посевы культивируют при 26 °C в течение 3−5 сут. Затем учитывают колонии, образующие зоны просветления в данной среде.

Дрожжи определяют чашечным методом на сусловом агаре при посеве различных разведений закваски и последующем выращивании при 24 °C в течение 3−5 сут.

Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений путем посева разведений в стерильное обезжиренное молоко и термостатирования их при 30 °C в течение 3−5 сут. Учет положительных результатов проводят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности свернутого молока.

Требования к закваскам, регламентируемые Санитарными правилами и нормами, представлены в Приложении № 3.

Наличие бактериофага устанавливают посевом закваски в стерильное обезжиренное молоко с добавлением раствора метиленового синего. Если в процессе культивирования после обесцвечивания метиленового синего через 4−5 ч снова наблюдается посинение молока, это указывает на наличие в закваске бактериофага.

Установление причин нарушения процесса сквашивания. Основными причинами нарушения процесса сквашивания является наличие в молоке ингибирующих веществ или бактериофага.

Для выявления причин несквашивания наблюдают за развитием молочнокислых стрептококков в молоке в первые часы после внесения закваски. Если молоко содержит ингибирующие вещества, развитие микроорганизмов закваски не наблюдается с самого момента заквашивания, если же причиной несквашивания является развитие бактериофага, то сначала наблюдается увеличение количества клеток, а через 2−3 ч — их исчезновение в результате лизиса.

Определение стафилококкового токсина в твороге и сметане.

Оборудование и реактивы: те же, что и при определении токсина в молоке, и 1 н раствор едкого натрия.

Ход определения. Определяют кислотность продукта по Тернеру. В стеклянный стаканчик (на 20−25 мл) вносят 5 г продукта (сметаны или творога) и вливают 10 мл физиологического раствора. Содержимое тщательно растирают стеклянной палочкой. Затем, если кислотность продукта не превышает 100 Т, в пробирку добавляют 0,3 мл 1 н раствора едкого натрия, а если кислотность выше 100°Т, то добавляют 0,5 мл 1 н раствора едкого натрия.

Содержимое пробирок центрифугируют при 2000 об./мин 10 мин, затем отсасывают жидкость над осадком. В пробирку наливают 2 мл надосадочной жидкости и добавляют по одной капле разведенных эритроцитов кроликов.

Дальнейшее исследование (за исключением центрифугирования) и оценку ведут так же, как и при исследовании стафилококкового токсина в молоке.

На приборе Клевер 1 М автоматически, точно и быстро можно определить в молоке и сливках жирность, СОМО и удельный вес согласно прилагаемой инструкции.