Получение липосом и липосомально-иммунопероксидазного конъ-югата

Липосомы получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из мозга к.р.с., а в последнее время из мозга свиньи (ТУ 9154−00−18 970 802 004), не являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии животных (коровье бешенство). Разработанная биотехнология выделения сырья для приготовления липосом включала следующие этапы:

• 1. Головной мозг животного в количестве 1000 г гомогенизировали в 4000 мл охлаждённого до минус 20 0С ацетона, периодически перемешивая в течение 12 ч. Суспензию фильтровали на воронке Бюхнера, осадок вновь суспендировали в 2000 мл охлаждённого ацетона в течение 4 часов и повторно фильтровали на воронке Бюхнера.
• 2. Для извлечения фосфолипидов и ганглиозидов полученный осадок экстрагировали 2000 мл смеси хлороформ — этанол (1:1) при встряхивании на шуттеле в течение 1 ч при температуре 20 0С. На этом этапе мы использовали указанную экстрагирующую смесь в отличие от традиционной, высокотоксичной смеси, включающей хлороформ и метанол.

Если традиционный метод выделения фосфолипидов требует удаления экстрагирующего раствора на роторном испарителе, то нами фосфолипиды осаждались из него при добавлении 1,5−2 объёмов охлаждённого (-20 0С) ацетона. При этом осаждался и холестерин, необходимый для стабилизации липосом в процессе их приготовления. Данный способ выделения фосфоли-пидов защищён патентом РФ № 2 192 265 от 10.10.2002.

3. Осадок фосфолипидов, собранный при фильтровании, высушивали при комнатной температуре до постоянного веса. Выход препарата составил 1,4% от массы исходного сырья. В дальнейшем препарат растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и хранили в сосуде с притёртой пробкой в темноте под подушкой инертного газа (азота) при температуре 4 0С.

Для предотвращения перекисного окисления липидов в процессе приготовления липосом в их хлороформный раствор вносили 0,05% атокоферола.

4. При внесении в надосадочную жидкость, образующуюся после изоляции из органической смеси фосфолипидов, дополнительно охлаждённого ацетона до 5 объёмного соотношения, в осадок выпадала фракция ганглиозидов, также используемая нами при конструировании липосом. Способ получения ганглиозидов защищён патентом РФ № 2 195 296 от 27.12.2002.

Высушенный осадок ганглиозидов растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и хранили в условиях, аналогичных хранению фосфолипидов. Разработанная биотехнология выделения фосфолипидов и ганглиозидов представлена на рис. 7.

Хроматографическое изучение полученного препарата фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол» в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4) с использованием в качестве свидетелей тест-наборов стандартов фосфолипидов и холестерина показало наличие в нём преимущественно фосфотидилхлолина, фосфотидилсерина, фосфотидилинозита и холестерина, которые выявлялись при прокрашивании парами йода (Кейтс М., 1975).

Липосомы получали методом «выпаривания в обращённой фазе» согласно методическим рекомендациям «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом» (2000 г.), используя в качестве сырья для их приготовления хлороформные растворы фосфолипидов и ганглиозидов в соотношении 20:1.

С этой целью в хлороформную смесь указанных липидов дополнительно вносили хлороформ до достижения липидной концентрации 30 мг/мл. К 3 мл этого раствора добавляли 1 мл водной фазы в виде 0,01 М ФСБ рН 7,2, содержащего 0,01% хлористого кальция. Для исключения негативного влияния ультразвука на липиды, которые при этом интенсивно окисляются, полученную смесь перемешивали в течение 10−12 мин на скоростной мешалке до образования стойкой эмульсии типа «вода в масле». Затем эмульсию упаривали в вакууме на роторном испарителе при температуре нагревающей жидкости 45 0С, не допуская кипения и вспенивания смеси, до полного удаления органической фазы. В дальнейшем колбу снимали с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М ФСБ рН 7,2 и интенсивно встряхивали в присутствии стеклянных бус до образования гомогенной структуры ли-посом. Контроль образования и размеров липосом осуществляли с помощью электронного микроскопа при инструментальном увеличении х 5000−50 000. Для этого на сетку-подложку, покрытой формваровой плёнкой, с помощью бактериологической петли наносили взвесь полученных липосом, предварительно разводя их 0,01 М ФСБ рН 7,2 до получения суспензии, хорошо просматривающейся при электронной микроскопии. После нанесения взвеси на сетку избыток удаляли фильтровальной бумагой. Липосомы, находящиеся на сетке, контрастировали 1% водным раствором уранилацетата, который наносили бактериологической петлёй.

В результате изучения полученных препаратов на электронном микроскопе были обнаружены липосомы со средним размером 150−300 нм, который рассчитывали по формуле: D = (X n * DV / X n) * К, где D — средний диаметр липосом в препарате (мкм); DV — средний размер липосом в каждой группе (мкм); n — число липосом в каждой группе; К — коэффициент увеличения, включая инструментальное увеличение микрофотографий.

Полученные липосомы были использованы в качестве «твёрдой» фазы при получении иммуноферментного препарата для диагностики МТБ. Ковалентно фиксируясь на поверхности мембраны липосом, фермент и иммуноглобулин резко снижают способность к конформационным изменениям структуры своих молекул под воздействием повышенной температуры, изменениях рН среды и т. д. Всё это способствует повышению стабильности и увеличению срока годности диагностической системы.

Для получения диагностикума мы предварительно активировали пе-роксидазу хрена. С этой целью (5 ±0,1) мг пероксидазы хрена растворяли в 1 мл раствора натрия углекислого кислого в концентрации 0,3 моль/л, добавляли 0,025 мл 0,32% раствора формалина. Смесь перемешивали на мешалке в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4) 0С и добавляли 1 мл раствора перйодата натрия в концентрации 0,04 моль/л, продолжая перемешивать в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4) 0С. Далее вносили 1,0 мл раствора этиленгликоля в концентрации 0,16 моль/л (для снижения поверхностного натяжения), осторожно перемешивая в течение (60±5) мин при температуре (22 ±4)0С. В конце процедуры препарат активированной пероксидазы должен быть жидким, прозрачным, без запаха, зеленовато-коричневой окраски. Активированную пероксидазу переносили в диализный мешок и диализовали против 1 л 0,01 М КББ рН (9,55 ±0,05), в течение (19±1) ч на мешалке при температуре 2−8 0С в холодильной камере. Данная процедура приводила к образованию альдегидных групп в углеводной части фермента пероксидазы.

В дальнейшем на наружной мембране липосом последовательно фик-сировали пероксидазу хрена и туберкулёзные иммуноглобулины класса G. С этой целью к 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов.*.

* Работа выполнялась совместно со с.н.с. СтавНИПЧИ Зайцевым А. А., гл.спец. Диковой С. П. и гл.спец. Головченко Т.В.

Суспензию подвергали в течение 1 мин ультразвуковой обработке, обеспечивающей эффективный контакт поверхности липидной мембраны липосом с ферментом, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре 1 ч. Ковалентное связывание липосом с ферментом осуществлялось за счёт части активированных групп пероксидазы и аминогрупп, присутствующих в молекулах ганглиозидов, встроенных в мембрану липосом при их приготовлении.

Несвязавшуюся пероксидазу удаляли хроматографически, используя колонку 100×12 мм с сефадексом G-100, уравновешенную 0,01 М КББ рН 9,5. В первом пике экстрагировались активированные ферментом липосомы, во втором — несвязавшийся фермент. Фракции первого пика объединяли и к ним добавляли туберкулёзные иммуноглобулины Ig G в количестве от 2,5 до 10 мг/мл. Фиксацию иммуноглобулинов на поверхности липосом с иммобили-зированной пероксидазой хрена проводили при температуре (22+4) 0С, помешивая на шуттеле в течение 1−24 ч и стабилизировали 5 мг боргидрида в холодильнике при температуре (4−6) 0С. При этом иммуноглобулины за счёт свободных аминогрупп связывались с оставшимися свободными альдегидными группами углеводной части пероксидазы. Для очистки конъюгата от несвязавшихся иммуноглобулинов использовали гель-хроматографию. Коньюгат наносили на колонку 100×12 мм с сефадексом G-100, уравнове-шенную ФСБ в концентрации 0,1 моль/л, рН (7,2+0,1). В результате происходило фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Поэтому в первом пике (свободном объёме колонки) выходил конъюгат, далее несвязавшиеся иммуноглобулины. Элюцию проводили тем же буферным раствором, фракции собирали по 2,0 мл и исследовали поглощение каждой фракции визуально по мутности раствора и на спектрофотометре при двух длинах волн — 280 и 403 нм. Фракции, имеющие отношение А403/А280, равное 0,4−0,5, объединяли и к готовому препарату добавляли до 1% БСА.

Установлено, что наиболее высокочувствительный липосомальный иммуноферментный диагностикум был получен при концентрации белка иммуноглобулинов 5 мг/мл и времени их инкубации с липосомальным ферментным конъюгатом 2 ч (рис.8).

Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замораживали и лиофилизировали в течение (18 ±2) ч до конечной температуры 25 °C. В готовом препарате контролировали физико-химические (растворимость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании) и иммунологические свойства (активность, специфичность, чувствительность) после лиофилизации и в процессе хранения в течение 2 лет (срок наблюдения). Чувствительность и специфичность конъюгата определяли в ИФА аналогично способу, описанному выше, с гомологичными и гетерологичными штаммами.

Биотехнологическая схема получения липосомального иммунофер-ментного диагностикума представлена на рисунке 9.

В таблице 8 представлены результаты анализов физико-химических свойств и чувствительности препарата. Разработанные препараты удовлетворяют требованиям нормативных документов, а их стабильность превосходила традиционные иммуноферментные конъюгаты.

Таким образом, в результате проведённых исследований разработана биотехнология изготовления иммобилизованного ферментного препарата, значительно увеличивающая его стабильность.

Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций: «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных Первым зам. министра здравоохранения РФ, Главным Государственным санитарным врачом России Г. Г. Онищенко 06.04.2000 г.

На Федеральном уровне утвержден нормативный документ (НД): технические условия (ТУ) 9154−00−1 897 080−2004 на фосфолипиды для получения липосом. Утверждены зам. Главного Государственного санитарного врача РФ Е. Н. Беляевым (Письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г).

На учрежденческом уровне утвержден регламент на липосомальную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 2°.°4.°4).