Иммобилизация ферментов. 
Использование иммобилизованных ферментов в пищевой промышленности

Общая характеристика иммобилизованных ферментов

В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т. д.

Иммобилизованные ферменты (от лат. immobiiis — неподвижный), препараты ферментов, молекулы которых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитические свойства. Иммобилизованные ферменты обычно не растворимы в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитической реакции, ингибиторов и активаторов. Существует несколько основных способов иммобилизации ферментов:

• 1) путем образования ковалентных связей между ферментом и матрицей;
• 2) полимеризацией мономера, образующего матрицу, в присутствуют фермента, который при этом оказывается включенным в сетку полимера — обычно геля;
• 3) благодаря электростатическому взаимодействию противоположно заряженных групп фермента и матрицы;
• 4) сополимеризацией фермента и мономера, образующего матрицу;
• 5) связыванием фермента и матрицы в результате не валентных взаимодействий — гидрофобных, с образованием водородных связей и др.;
• 6) инкапсулированием — созданием около молекул фермента полупроницаемой капсулы, напр., включением фермента в липосомы;
• 7) сшиванием молекул фермента между собой, например, глутаровым альдегидом, диметиловым эфиром диимида адипиновой кислоты.

Особый случай иммобилизации проведение ферментативных реакций в двухфазной системе, когда фермент находится в водной фазе, а субстраты и продукты реакции распределяются между организменной и водной фазами, что позволяет в зависимости от коэффициента распределения веществ между фазами сдвигать равновесие реакции в нужную сторону; диспергирование фаз увеличивает поверхностьсть их раздела и тем самым улучшает доступ субстрата к ферменту. Среди способов иммобилизации наибольшее распространение получили ковалентное связывание фермента с матрицей и включение фермента в гель. В первом случае в качестве матрицы обычно используют целлюлозу, декстрановые гели (сефароэу, агарозу), микропористые стекла или кремнеземы, а также синтетические полимеры. Матрицу при ковалентной иммобилизации ферментов обычно предварительно активируют, обрабатывая, напр., бромцианом, азотистой к-той или цианурхлоридом. Благодаря этому она становится носителем активных группировок, которые способны вступать в реакцию сочетания, взаимодействия с группами NH2, ОН, СООН. Во втором случае в качестве гелеобразующего полимера используют полиакриламид. На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно несколькими способами.

Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами и матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварительной химической модификации молекул фермента низкомолекулярными веществами или растворимыми полимерами, имеющими заряженные группировки, что изменяет у таких модифицированных белков электростатический заряд молекулы и позволяет достаточно прочно сорбировать их на ионообменных смолах. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространственные затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентном связывании фермента для предотвращения отрицательного влияния матрицы между ней и молекулой фермента вводят разобщающую цепь атомов — спейсер (наз. также «вставкой» или «ножкой»). Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естественное микроокружение. При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы не блокировали каталитический центр фермента, а условия иммобилизации не приводили к потере его активности. Определенные ограничения на способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомолекулярных субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель. Если матрица несет на себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетические параметры реакции: разноименные заряды на носителе и субстрате увеличивают скорость реакции, катализируемой иммобилизованными ферментами, одноименные заряды ее снижают и могут быть причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также на величину рН, при которой скорость ферментативной реакции максимальна. Важную роль играет распределение субстрата между фазами иммобилизованного фермента и раствора.

Ограниченная доступность субстрата к активному центру фермента может привести к изменению специфичности последнего. Особенно это характерно для высокомолекулярных субстратов, которые из-за малого коэффициента диффузии медленно переходят в фазу иммобилизованного фермента, что приводит к относит. увеличению скоростей других реакций с участием субстратов меньших размеров. В некоторых случаях возможно также изменение направления реакции. Так, фермент эндополигалактуроназа, катализирующий расщепление полигалактуроновой кислоты в середине молекулы, после иммобилизации отщепляет низкомолекулярные фрагменты от концов молекулы. Существенное влияние на кинетику реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, оказывают два диффузионных барьера — внешний и внутренний. Первый обусловлен наличием тонкого неперемешиваемого слоя растворителя вокруг частицы иммобилизованного фермента (слоя Нернста). Толщина этого слоя зависит от скорости перемешивания. Поэтому увеличение последней или скорости тока раствора в колонке с иммобилизованным ферментом увеличивает скорость ферментативной реакции. Внутренне диффузионный барьер возникает вследствие ограничения свободной диффузии субстрата внутри сетки полимерной матрицы. Иммобилизация ферментов создает ряд преимуществ.

К ним относятся: более высокая стабильность ферментных препаратов, возможность их удаления из реакционной среды и его повторного использования, а также возможность создания непрерывных процессов на ферментных колонках. Важное значение имеет относительная стабильность иммобилизованных ферментов к денатурирующим воздействиям — нагреванию, действию агрессивных сред, автолизу и других. Последнему подвержены протеолитические ферменты. Иммобилизация разобщает молекулы этих ферментов и полностью исключает такой процесс. Благодаря этому удалось изучить механизм образования протеолитического фермента пепсина из его предшественника пепсиногена (при этом от последнего отщепляется пептид, состоящий из 42 аминокислотных остатков). Было показано, что эта реакция катализируется самим пепсином.

Иммобилизованные ферменты применяют в производстве L-аминокислот, 6-аминопенициллановой кислоты, из которой получают полусинтетической пенициллины, в синтезе преднизолона, для удаления лактозы из продуктов питания, используемых больными с лактазной недостаточностью, в изготовлении ферментных электродов для экспресс-определения мочевины, глюкозы и других веществ, для создания аппаратов «искусственная почка» и «искусственная печень», для удаления эндотоксинов, образующихся в процессе заживления ран и ожогов, при лечении некоторых онкологии, заболеваний и другого. Большое значение приобрели в клинической и лабораторной практике иммуноферментные методы анализа, в которых также используются иммобилизованные ферменты. 6].