Фармацевтический анализ группы пенициллинов

Структурной основой лекарственных веществ природных и полусинтетических пенициллинов является 6-аминопенициллановая кислота, которая включает конденсированные тиазолидиновый и лактамный цикл Лактамный цикл впервые обнаружен в природных пенициллинах и отличается большой лабильностью к воздействию различных факторов.

Специфичность биологической активности пенициллинов прежде всего обусловлена наличием в молекуле тиазолидинового и в-лактамного циклов. Расщепление одного из них приводит к полной потере активности. Важная роль в сохранении антибактериальной активности принадлежит также пространственной конфигурации молекул пенициллинов. Характер группировок, присоединенных к гетероциклической системе в положениях 1 и 3. не оказывает заметного влияния на биологическую активность. Различную химическую структуру может иметь радикал, замещающий атом водорода в аминогруппе, которая присоединена к лактамному циклу в положении 6. Это позволило получить ряд высокоактивных полусинтетических аналогов более устойчивых, чем природный пенициллины. Пенициллин получают путем микробиологического синтеза.

Исследование биосинтеза пенициллина с помощью меченых соединений позволило установить, что формирование молекулы осуществляется за счет содержащихся в питательной среде аминокислот (цистеина, валина) и соответствующих предшественников. Схема биосинтеза молекулы бензилпенициллина заключается в следующем:

Пенициллины за счет наличия в молекуле карбоксильной группы являются кислотами, представляющими собой кристаллические вещества, очень гигроскопичные и легко инактивирующиеся под действием кислот, щелочей и других факторов вследствие гидролиза лактамного цикла и образованием неактивной пенициллиновой кислоты:

В настоящее время из многочисленных известных природных пенициллинов медицинское применение имеют натриевая, калиевая, новокаиновая соли бензилпенициллина, бензатинбензилпенициллин и феноксиметилпенициллин. Полусинтетические пенициллины характеризуются наличием в молекуле ароматического или гетероциклического радикала. Из них наиболее широко применяют ампициллин, оксациллин, карбенициллина динатриевую соль, амоксициллин (табл.10.).

По физическим свойствам природные пенициллины и их синтетические аналоги представляют собой белые или почти белые кристаллические порошки без запаха. Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина слегка гигроскопичны. Карбенициллина динатриевая соль гигроскопична, а феноксиметилпенициллин негигроскопичен.

Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина, натриевая соль оксациллина, динатриевая соль карбенициллина очень легко или легко растворимы в воде. Новокаиновая соль бензилпенициллина, бензатинбензилпенициллин, феноксиметилпенициллин, амоксициллин и ампициллин мало или очень мало растворимы в воде. Натриевая и калиевая соли бензилпенициллина, феноксиметилпенициллин растворимы в этиловом и метиловом спиртах, новокаиновая соль бензилпенициллина мало в них растворима. В этаноле ампициллин практически нерастворим, натриевая соль оксациллина трудно растворима, а динатриевая соль карбенициллина медленно растворима. Натриевые и калиевые соли пенициллинов, бензатинбензилпенициллин практически нерастворимы в хлороформе и эфире. Феноксиметилпенициллин умеренно растворим в хлороформе, новокаиновая соль бензилпенициллина трудно в нем растворима, бензатинбензилпенициллин легко растворим в диметилформамиде. Амоксициллин нерастворим в бензоле и тетрахлорметане.

Химическая структура основных пенициллинов

Benzylpenicillin Sodium -.бензилпенициллина натриевая соль.

Benzylpenicillin Potassium -.бензилпенициллина калиевая соль.

Benzylpenicillin Procaine — бензилпенициллина новокаинова соль.

Benzathine Benzylpenicillin — бензатинбензилпенициллин (Бициллин-1).

Phenoxymethylpenicillinфеноксиметилпенициллин.

Ampicillin — ампициллин.

Oxacillin Sodium — оксациллина натриевая соль.

Carbenicillin Disodiuni — карбенициллина динатриевая соль.

Amoxicillin — амоксициллин.

Подлинность природных и синтетических пенициллинов подтверждают с помощью УФи ИК-спектрофотометрии. Устанавливают значения оптических плотностей растворов солей бензилпенициллина при длинах волн 280 и 263 нм. У феноксиметилпенициллина при 268 и 274 нм имеются максимумы поглощения, а при 272 нм — минимум, причем отношение оптических плотностей при длинах волн 268 и 274 нм. Для растворов ампициллина устанавливают значения оптических плотностей в максимумах 256, 261, 267 нм и минимумах 255, 260, 266 нм поглощения.

ИК-спектры природных и полусинтетических пенициллинов идентифицируют по совпадению с полосами поглощения соответствующих стандартных образцов в области 4000−400 см?¹. Подлинность бензилпенициллина натриевой, калиевой, новокаиновой солей и амоксициллина устанавливают также методом ТСХ на силикагеле Н или пластинках Сорбфил с последующим проявлением в парах йода.

Важная физическая константа пенициллинов — удельное вращение водных или спиртовых растворов. Все они вращают плоскость поляризованного света вправо.

Для установления подлинности ампициллина, бензатинбензилпенициллина, а также определения содержания в нем бензилпенициллина используют метод ВЭЖХ. Подлинность подтверждают, сравнивая время удерживания пика со стандартным образцом.

Химические реакции, используемые для испытаний подлинности пенициллинов, основаны на обнаружении в их молекулах различных функциональных групп, продуктов деструкции, атома серы, связанных аминов, катионов калия и натрия.

Для испытания подлинности пенициллинов и их полусинтетических аналогов используют цветную реакцию, основанную на разрыве в-лактамного цикла с образованием внутрикомплексной соли меди (II) с гидроксамовой кислотой, осадок зеленого цвета или железа (III) — красное или фиолетовое окрашивание:

Образование этих солей происходит только в определенных интервалах значении рН.

Во всех пенициллинах можно обнаружить органически связанную серу после превращения ее в сульфид-ион сплавлением с едкими щелочами. Сульфид-ион затем открывают по образованию красно-фиолетового окрашивания после добавления раствора нитропруссида натрия.

Соли бензилпенициллина испытывают на ион натрия или калия. Новокаиновую соль бензилпенициллина подвергают испытанию на первичные ароматические амины, а бензатинбензилпенициллин — на дибензилэтилендиамин. Последний извлекают эфиром и после его удаления действуют раствором дихромата калия и ледяной уксусной кислотой; образуется золотисто-желтый осадок. Извлеченный эфи-ром дибензилэтилендиамин можно идентифицировать по температуре плавления образующегося пикрата 214 °C.

Пенициллины отличают друг от друга по различной окраске продуктов реакции с хромотроповон кислотой в присутствии концентрированной серной кислоты. Образуются продукты реакции, имеющие желтое или желто-зеленое окрашивание.

Ампициллин благодаря наличию в молекуле остатка фениламиноуксусной кислоты дает положительную реакцию с нингидрином подобно аминокислотам, а при взаимодействии с реактивом Фелинга приобретает фиолетовое окрашива-ние.

Феноксиметилпенициллин отличают от других пенициллинов по отрицательной реакции с концентрированной сер-ной кислотой. Раствор остается бесцветным и после нагревания на водяной бане. Реактив Марки используют для идентификации феноксиметилпенициллина. Наличие в его мо-лекуле феноксиуксусной кислоты обусловливает реакцию гидролиза до фенола и гликолевой кислоты:

Затем за счет взаимодействия фенола с реактивом Марки происходит образование ауринового красителя, имеющего красное окрашивание. При нагревании на водяной бане наблюдается усиление интенсивности окраски. Другие пенициллины не образуют окрашенных продуктов при комнатной температуре, а при нагревании на водяной бане приобретают желтое или оранжево-желтое (ампициллин), темно-желтое (амоксициллин), красно-коричневое окрашивание (бензатинбензилпенициллин).

Соли бензилпенициллина дают положительную реакцию Витали-Морена подобно производным тропана. При выпаривании их с дымящей азотной кислотой и последующем прибавлении спиртового раствора гидроксида калия и ацетона появляется фиолетовое окрашивание. Если к раствору калиевой или натриевой соли бензилпенициллина прибавлять по каплям 25%-ный раствор хлороводородной кислоты, то в осадок выпадает свободный бензилпенициллин, растворимый в избытке хлороводородной кислоты, а также в этаноле, хлороформе, эфире. Соли бензилпенициллина при кипячении в 4% растворе гидроксида натрия гидролизуются с образованием натриевой соли фенилуксусной кислоты, которая после добавления избытка разбавленной серной кислоты обнаруживается по характерному запаху.

Для идентификации и фотоколориметрического определения солей бензилпенициллина, феноксиметилпенициллина, натриевой соли оксациллина используют реакцию, основанную на образовании полиметиновых красителей. Бензилпенициллин подвергают кислотному гидролизу до бензилпеницилленовой кислоты. Она вступает в реакцию сочетания с производным глютаконового альдегида, который образуется в результате расщепления пиридинового цикла под действием тиоцианата хлора.

В МФ описаны способы установления подлинности пенициллинов, основанные на использовании в качестве реактива пенициллиназы. Последняя, например, у бензилпенициллина новокаиновой соли вызывает изменение окраски раствора нейтрального красного.

Ряд испытание выполняют для установления степени чистоты природных и синтетических пенициллинов. По величине оптической плотности растворов определяют светопоглощающие примеси. Выбор длины волны и допустимые значения оптической плотности зависят от химической структуры испытуемого пенициллина. В некоторых пенициллинах устанавливают допустимое ФС содержание йодсорбирующих примесей (0,5−6%) методом обратного йодометрического определения в фосфатном или ацетатном буфере.

Природные и синтетические пенициллины испытывают на наличие воды по методу К. Фишера и устанавливают рН растворов при водных суспензий потенциометрически. В соответствии с требованиями ФС пенициллины и их полусинтетические аналоги подвергают испытаниям на прозрачность и цветность растворов, микробиологическую чистоту, токсичность, пирогеность, стерильность.

Методом ГЖХ в пенициллинах определяют содержание остаточных растворителей ацетона, метиленхлорида, изопропилового спирта, н-пропанола, изоамилацетата, которые используются в процессе получения и очистки. Испытания предусматривают ФС на бензатинбензилпенициллин, амоксициллин, ампициллин и оксациллина натриевую соль. В ампициллине тем же методом определяют примеси триметиламина до 0,05% и диметил анилина до 0,002%. В бензилпенициллина новокаиновой соли и карбенициллина натриевой соли методом ВЭЖХ определяют содержание бензилпенициллина натриевой соли, а в феноксиметилпенициллине тем же методом — содержание примеси феноксиуксусной кислоты до 0,5%. Метод ВЭЖХ используют также для количественного определения амоксициллина по стандартному образцу с использованием в качестве подвижной фазы ацетонитрила и спектрофотометрического детектора 230 нм.

Количественное определение пенициллинов выполняют химическими методами. В некоторых из них натриевой, ка-лиевой, новокаиновой солях бензилпенициллина, феноксиметилпенициллине и амоксициллине сумму пенициллинов определяют йодометрическим методом. Сущность способа заключается в том, что продукт инактивации пенициллина 1 М раствором гидроксида натрия при комнатной температуре — натриевую соль пенициллоиновой кислоты окисляют йодом. Процесс окисления необходимо проводить при рН 4−5 ацетатный буфер.

Схема инактивации и окисления на примере бензилпенициллина:

Определение суммы пенициллинов выполняют обратным йодометрическим методом. Избыток 0,01 М раствора йода оттитровывают раствором тиосульфата натрия той же концентрации после 20 мин пребывания ее в темном месте (индикатор крахмал). Одновременно проводят контрольный опыте тем же количеством пенициллина, не подвергнутого щелочному гидролизу, а также йодометрическое определение соответствующего ГСО.

Количественное определение натриевой, калиевой и новокаиновой солей бензилпенициллина выполняют гравиметрическим методом. Бензилпенициллин извлекают амилацетатом и количественно осаждают в виде N-этилпиперидиновой соли:

Осадок этилпиперидиновой соли бензилпенициллина промывают, высушивают до постоянной массы и взвешивают. Затем делают пересчет на соответствующую соль.

В новокаиновой соли бензилпенициллина определяют содержание новокаина спектрофотометрическим методом в водно-метанольном растворе при длине волны 290 нм. Содержание новокаина должно быть не ме-нее 39 и не более 42%. Определение можно выполнить нейтрализацией извлеченного хлороформом основания прокаина 0,1 М раствором серной кислоты.

В бензатинбензилпенициллине определяют дибензилэтилендиамина. Его предварительно количественно извлекают эфиром, эфир отгоняют до сухого остатка, который растворяют в ледяной уксусной кислоте и титруют 0,1 М раствором хлорной кислоты индикатор кристаллический фиолетовый или 1-нафтолбензеин.

Сумму полусинтетических пенициллинов в натриевой соли оксациллина и динатриевой соли карбенициллина определяют методом обратной нейтрализации. В его основе лежит количественно происходящий при нагревании на водяной бане процесс гидролиза 0,1 М раствором гидроксида натрия до образования производных пенициллоиновой кислоты:

Избыток гидроксида натрия оттитровывают 0,1 М раствором хлороводородной кислоты индикатор фенолфталеин.

Ампициллин количественно определяют методом титрования, подобно аминокислотам. Навеску растворяют в воде, добавляют разбавленный нейтрализованный раствор формальдегида и через 2 мин титруют раствором гидроксида натрия (индикатор фенолфталеин).

Известен меркуриметрический метод определения ампициллина с использованием в качестве титранта нитрата ртути (II) или хлорида ртути (II). Меркуриметрический метод (с потенциометрическим окончанием) рекомендован НД для количественного определения амоксициллина, содержание которого рассчитывают по разнице между общим количеством пенициллинов и содержанием продуктов разложения. Сумму пенициллинов определяют после щелочного гидролиза амоксициллина до образования производных пенициллонновой кислоты.

Активность пенициллинов устанавливают микробиологическим методом по антибактериальному действию на определенный штамм золотистого стафилококка. Одна единица действия соответствует активности 0,5988 мкг химически чистой натриевой соли бензилпенициллина 1670 ЕД в 1 мг. Микробиологический метод определения пенициллинов дает воспроизводимость результатов 5−10%. Этот метод приведен в ряде ФС как альтернативный вместе с химическим или спектрофотометрическим методом. Алкалиметрический метод определения суммы пенициллинов имеет удовлетворительную воспроизводимость, но дает завышенные результаты, так как одновременно титруются все примеси, взаимодействующие со щелочью.

Наиболее точные, сопоставимые с микробиологическим методом результаты дает спектрофотометрическое определение пенициллинов, основанное на их гидролизе до пеницилленовых кислот. Они имеют максимум светопоглошения при 320−324 или 335 нм. Присутствие ионов меди (II) повышает чувствительность реакции и воспроизводимость результатов определения. Этот способ определения рекомендован для количественной оценки полусинтетических пенициллинов: ампициллина, оксациллина, карбенициллина, диклоксациллина и др. Общая схема гидролиза пенициллинов в кислой сре-де с образованием пеницилленовых кислот может быть представлена следующим образом:

Феноксиметилпенициллин определяют спектрофотометрическим методом при длине волны 268 нм, используя в качестве растворителя раствор гидроксида натрия 4 мл 0,1 моль/л раствора на 500 мл воды. Параллельно в тех же условиях определяют ГСО феноксиметилпенициллина.

Для определения бензилпенициллина натриевой и калиевой соли, феноксиметилпенициллина, ампициллина и его натриевой соли МФ также рекомендовано спектрофотометрическое определение. Оно основано на взаимодействии раство-ра указанных пенициллинов при нагревании на водяной бане с имидазолом и хлоридом ртути (II). Светопоглощение полученного раствора измеряют при 325 нм относительно смеси реактивов. Фотоколориметрические методы определения природных пенициллинов основаны на реакциях образования окрашенных гидроксаматов железа или меди.

Пенициллины хранят по списку Б в сухом месте, при комнатной температуре. Упаковывают соли бензилпенициллина во флаконы, герметически закрытые резиновыми пробками, обжатыми алюминиевыми колпачками. На воздухе, при повышении температуры, в присутствии влаги, тяжелых металлов они быстро разлагаются. Калиевая и натриевая соли бензилпенициллина содержат в каждом флаконе по 125 000, 250 000, 500 000 и 1 000 000 ЕД; новокаиновая соль бензилпенициллина и бензатинбензилпенициллин — по 300 000, 600 000, 1 200 000 ЕД. Ампициллин хранят в банках оранжевого стекла вместимостью по 0,5 кг, а феноксиметилпенициллин, амоксициллин и оксациллина натриевую соль — в стеклянных банках или полиэтиленовых пакетах. Карбенициллина динатриевую соль хранят при температуре не выше +5°С, бензатинбензилпенициллин — не выше + 10? С, амоксициллин — при комнатной температуре, предохраняют от действия света.

Природные пенициллины применяют для лечения пневмонии, гонореи, сифилиса, раневых и гнойных инфекций, перитонита, дифтерии, скарлатины, ангин различной этнологии и инфекционных заболевании, вызванных чувствительными к пенициллину микроорганизмами. Полусинтетнческие аналоги имеют более широкий спектр антибактериального действия.

Лекарственные препараты пенициллинов отличаются друг от друга по продолжительности действия и по эффективности при различных путях введения. Натриевую и калиевую соли бензилпенициллина вводят главным образом внутримышечно и подкожно по 200 000−1 500 000 ЕД в сутки в 3−6 приемов. Новокаиновая соль бензилпенициллина при внутримышечном введении обеспечивает пролонгированное действие в течение 12−18 ч, а бензатинбензилпенициллин — 1−2 недели. Устойчивость феноксиметилпенициллина, ампициллина, оксациллина и амоксициллина в кислой среде желудочного сока позволяет применять их перорально. Феноксиметилпенициллин назначают внутрь по 0.2 г. ампициллин — по 0,25−0,5 г 4−6 раз в сутки, амоксициллин — по 0,5−1,0 г 3 раза в сутки. Оксациллина натриевую соль вводят внутрь по 0,25−0,5 г суточная доза 3,0 г или внутримышечно до 2,0−4,0 г в сутки. Карбенициллина динатриевую соль вводят внутримышечно по 4,0−8,0 г, а внутривенно капельно — до 20−30 г в сутки.