Преимущества и недостатки авторадиографии

Содержание Введение

1. История развития метода меченых атомов

1.1 Основные понятия и терминология.

1.1.2 Изотопные индикаторы

1.2.1 Стабильне изотопы.

1.2.2 Радиоактивные изотопы

1.3 Изотопные индикаторы в медицине, биологии и сельском хозяйстве

2. Авторадиография.

2.1.Преимущества и недостатки авторадиографии.

3. Сцентиллярные счетчики излучения

3.1 Сцинтилляции и сцинтилляторы

4.

Введение

радиоактивной метки в биологические препараты Заключение Список использованных источников меченый атом радиоактивный изотоп Введение Искусственно получаемые радиоактивные элементы нашли широкое применение в науке и технике. Одним из методов, позволяющих на практике использовать свойства радиоактивных элементов, является так называемый метод меченых атомов. Этот метод использует тот факт, что по химическим и многим физическим свойствам радиоактивный изотоп неотличим от устойчивых изотопов того же элемента. В то же время радиоактивный изотоп легко может быть опознан по своему излучению (с помощью, например, газоразрядного счетчика). Добавляя к исследуемому элементу радиоактивный изотоп и улавливая в дальнейшем его излучение, мы можем проследить путь этого элемента в организме, в химической реакции, при плавке металла и многом другом.

1. История развития метода меченых атомов Метод меченых атомов широко используется в аналитической практике. Метод радиоактивных индикаторов позволяет судить о поведении элементов в различных химических и биологических процессах, в том числе при их разделении и концентрировании в ходе анализа. Метод базируется на установленном Д. Хевеши, Ф. Панетом и К. Фаянсом факте, что радиоактивные элементы ведут себя точно так, как эти элементы в нерадиоактивном состоянии. Говоря современным научным языком, изотопные эффекты в большинстве химических и биологических процессов в первом приближении отсутствуют. Георг Хевеши — венгерский физикохимик, радиохимик родился в Будапеште, окончил в 1908 г. Будапештский университет, затем учился в Германии, в Берлинском и Райбургском университетах. Впоследствии работал в Цюрихском университете, в Высшей технической школе в Карлсруэ с Ф. Габером в Манчестерском университете с Э. Резерфордом, в Радиевом институте в Вене с Ф. Панетом. До 1920 г. работал в Будапештском университете, в 1918 г. стал там профессором Впоследствии работал в Копенгагенском (1920;1926), Фрайбургском (1926;1940), и Стокгольмском (с 1943 г.) университетах. Метод радиоактивных индикаторов был предложен Д. Хевеши и Ф. Панетом еще до Первой мировой войны (1913); определяя растворимость солей свинца, они использовали радиоактивный изотоп этого элемента. В 1932 г Д. Хевеши разработал метод изотопного разбавления и применил его для определения свинца в горных породах. Годом раньше Д. Хевеши обнаружил, что при облучении элементов рентгеновскими лучами возникает вторичное рентгеновское излучение — так был намечен путь к рентгенофлуоресцентному анализу. В 1936 г. Д. Хевеши (вместе с Х. Леви) разработал метод нейтронно-активационного анализа. Совместно с Д. Костером Д. Хевеши открыл гафний, объяснил особое положение иттрия в ряду редкоземельных элементов и т. д. в 1944 г ученый был удостоен Нобелевской премии. Ее присудили за работу по использованию изотопов как индикаторов при изучении химических процессов.

Химики-аналитики широко использовали метод радиоактивных индикаторов, созданный Д. Хевеши, для разработки приемов разделения и концентрирования микропримесей. Метод позволял быстро и надежно контролировать степень извлечения элемента при экстракции, ионном обмене, соосаждении и в других случаях. Радиоактивные индикаторы применяли также при изучении механизма химических реакций. Исследования были обеспечены наличием большого числа долгоживущих радионуклидов, удобных для измерения их радиоактивности.

В декабре 1957 г. в Москве состоялась большая конференция по применению радиоактивных изотопов в аналитической химии. Проходила она в ГЕОХИ АН СССР, в ней участвовало 450 человек, в том числе крупные аналитики из других стран — И. М. Кольтгоф (США), Г. Ирвинг (Эрвинг) из Великобритании, Р. Пришбл из Чехословакии и другие. Это была первая после войны аналитическая конференция в СССР с участием иностранных ученых. На конференции было много докладов о применении меченых атомов при разработке и использовании методов анализа. Например, А. В. Николаев (будущий академик), А. А. Сорокина и А. С. Масленникова сообщили об использовании изотопов при разделении редкоземельных элементов. В докладе И. П. Алимарина и Г. Н. Билимовича сообщалось об использовании изотопов 95Nb, 95Zr, 82Та при разработке методов отделения тантала от титана, циркония от ниобия, определяли выделенные элементы методом изотопного разбавления. Сродни методу радиоактивных индикаторов так называемый радиоуглеродный метод, который важен для датировки разного рода объектов. К примеру, что космические лучи, попадая в земную атмосферу, создают потоки вторичных частиц. В результате этого происходит превращение радиоактивного азота-15 в радиоактивный углерод-14. В момент возникновения атомы 14С, имеющие очень высокую энергию, сразу же вступают в реакцию с кислородом, образуя углекислый газ. Последний усваивается растениями и от них переходит к животным. В целом в биосфере поддерживается постоянная концентрация углерода-14. Эти факты были установлены к 1946 г. группой исследователей, в которую входил и американский физик У. Ф. Либби. Он задался вопросом: что происходит оадиоактивным углеродом после смерти организма. Поскольку обмен шеств прекращается, изотоп 14С в организм более не поступает. А содержавшийся в организме изотоп начинает распадаться: в соответствии периодом полураспада его количество уменьшается вдвое за 5 600 лет. Значит, по относительному содержанию углерода-14 в ископаемых останках можно судить об их возрасте. Идея проста, но для создания точного и удобного метода датирования потребовались большие усилия. Метод радиоуглеродной геохронологии позволяет определять возраст археологических объектов в пределах 200−50 000 лет. Для изотопного анализа используют масс-спектрометр, поэтому требуется лишь несколько граммов исследуемого вещества.

1.1 Основные понятия и терминология Радиоактивность (radioactivity) — это обозначение удивительного явления природы, открытого Беккерелем в конце XIX века, суть которого заключается в самопроизвольном спонтанном превращении атомных ядер некоторых элементов в другие, которое сопровождается выделением трёх видов «лучей». Природу лучей установили быстро: б-лучи — это двукратно ионизированные атомы гелия, в-лучи — это электроны, г-лучи — это жесткое коротковолновое электромагнитное излучение. Элементы, способные к таким превращениям стали называться радиоактивными, т. е. способными к этому превращению. В зависимости от типа излучения, радиоактивные атомы стали определять соответственно как б, в или г излучатели или источники. Правда, вскоре было установлено, что некоторые радиоактивные атомы излучают сразу два (а возможно, и три) вида лучей, поэтому такая классификация дополняется пояснениями — это «чистый» б-излучатель или имеется сопутствующее г-излучение. К первоначальным трём типам ядерных превращений (б, в и г — радиоактивный распад) добавились новые, однако, общие закономерности для всех остались неизменными. В конце ХХ века было рекомендовано термин «изотоп» заменить на «нуклид» и, соответственно, «радиоактивный изотоп» на «радионуклид». Особенно широкого распространения это нововведение не получило, и оба термина используются в научной литературе как синонимы.

Количественная характеристика радиоактивности получила у физиков название «активность» (activity). Так как физикам никто не давал монопольного права на термин «активность», то со временем выяснилось, что в разных областях науки под «активностью» понимают совсем разные понятия. Сравните: активность радиоактивного изотопа, химическая активность элемента или соединения, энзимологическая активность фермента, биологическая (например, антивирусная) активность препарата — всё это совершенно различные понятия. Сближение различных научных дисциплин ещё больше запутывает положение. Попробуйте охарактеризовать фермент, меченный радиоактивным изотопом углерода-14. Активность такого фермента — это его энзимологическая характеристика или радиоактивная? Поэтому в современной научной литературе (особенно биологической) все чаще термин «активность» для радиоактивных веществ заменяется термином «радиоактивность» .

За единицу активности (радиоактивности) радиоактивного вещества в Международной системе СИ принята скорость радиоактивного распада, равная 1 распаду в секунду, которая получила название беккерель — Бк (в английской версии Bq). Устаревшая, но по-прежнему используемая единица активности кюри — Ки (в английской версии Ci) — это активность препарата, эквивалентная активности 1 г металлического радия-226 и равная 3,7×1010 распадов в секунду, т. е. 3,7×1010 Бк.

Строго говоря, радиоактивный распад — это превращение ядра атома радиоактивного элемента, которое сопровождается выделением продуктов такого превращения. Например, электронный захват представляет собой поглощение электрона ядром с выделением г-кванта, и такой тип «радиоактивного распада» более точно следует называть «ядерным превращением». Впрочем, оба термина используются в литературе на равных, несмотря на предпочтительность «ядерного превращения» .

Основной закон радиоактивного распада описывается замечательной формулой:

Nt = N0e-лt

где:

Nt — количество распавшихся радиоактивных атомов;

N0 — начальное количество радиоактивных атомов;

е — основание натурального логарифма;

л — константа скорости радиоактивного распада;

t — время.

На практике для работы ею никто не пользуется, однако, из этой формулы следует сразу несколько довольно простых, но очень важных выводов и следствий, которые надо знать всем работающим с радиоактивными изотопами:

1) Количество радиоактивных атомов, распавшихся за некоторое время наблюдения, зависит только от их исходного количества и времени наблюдения (распада). Никакие другие параметры: астрономические, физические, химические, парапсихологические на радиоактивный распад не влияют. Константа скорости радиоактивного распада [ л ] (иногда ее называют константой распада) определяется только природой изотопа и для каждого изотопа имеет свою величину. Все попытки замедлить радиоактивный распад охлаждением (даже в жидком азоте) или ускорить распад нагреванием абсолютно бессмысленны. Можно влиять на стабильность химического соединения, меняя температуру его хранения, но количество радиоактивных атомов в препарате при этом не изменится.

2) Скорость радиоактивного распада меняется по экспоненте (т.е. нелинейно), и рассчитывать количество радиоактивного материала в препарате надо с учетом этого факта, пользуясь либо вышеприведенной формулой, либо соответствующими таблицами распада (что обычно и делают на практике).

3) Если в формуле радиоактивного распада Nt = ½ N0, т. е. распалась ровно половина радиоактивных атомов, содержащихся в препарате. Время этого процесса — константа Т12 — называется периодом полураспада. Физический смысл — время, за которое распадается половина радиоактивных атомов данного изотопа. Эта величина весьма полезна для работающих с радиоактивностью, т.к. позволяет быстро оценить «потери на распад» препарата.

4) Физический смысл константы скорости радиоактивного распада [ л ] — это активность 1 моля (или ммоля) 100% радиоактивного изотопа и соответственно размерность этой константы — Бк/моль (Bq/mol) или Ки/ммоль (Ci/mmol). То есть, это теоретически достижимая молярная активность (активность одного моля радиоактивного вещества), знание которой позволяет оценить чувствительность метода и качество радиоактивного препарата.

1.2 Изотопные индикаторы Изотопные индикаторы, вещества, имеющие отличный от природного изотопный состав и благодаря этому используемые в качестве метки при изучении самых разнообразных процессов. Роль изотопной метки выполняют стабильные или радиоактивные изотопы химических элементов, которые легко могут быть обнаружены и определены количественно. Высокая чувствительность и специфичность изотопных индикаторов позволяют проследить за ними в сложных процессах перемещения, распределения и превращения веществ в сколь угодно сложных системах, в том числе и в живых организмах.

Метод изотопных индикаторов основан на том, что химические свойства разных изотопов одного элемента почти одинаковы (благодаря чему поведение меченых атомов в изучаемых процессах практически не отличается от поведения других атомов того же элемента), и на лёгкости обнаружения изотопов, особенно радиоактивных. При использовании метода необходим учёт возможных реакций изотопного обмена, приводящих к перераспределению меченых атомов (следовательно, к потере соединением метки), а иногда и учёт радиационных эффектов, связанных с влиянием радиоактивных излучений на ход процесса. Изотоп, используемый в качестве метки, вводится в состав изучаемых соединений. Могут быть использованы как стабильные, так и радиоактивные изотопы.

Преимущество стабильных изотопов — их устойчивость и отсутствие ядерных излучений. Однако только небольшое число элементов имеет подходящие стабильные изотопы. Малая доступность последних и сравнительно сложная техника обнаружения составляют недостатки метода изотопных индикаторов с применением стабильных изотопов. Преимущество радиоактивных изотопов — возможность их получения практически для всех элементов периодической системы, высокая чувствительность, специфичность и точность определения, простота и доступность измерительной аппаратуры. Поэтому большинство исследований, использующих метод изотопных индикаторов, выполнено с радиоактивными изотопами.

Такие элементы, как водород, углерод, сера, хлор, свинец, имеют удобные для использования как стабильные — 2H, 13C, 34S, 35Cl, 37Cl, 204РЬ, так и радиоактивные изотопы — 3H, 11C, 14C, 35S, 36C1, 212РЬ. В качестве изотоповазота и кислорода чаще всего применяются стабильные 15N и 18O и другие. Стабильные изотопные индикаторы получают обогащением природных изотопных смесей путём многократного повторения операции разделения (перегонка, диффузия, термодиффузия, изотопный обмен, электролиз; см. Изотопов разделение), а также на масс-спектрометрических установках и при ядерных реакциях.

Для элементов, существующих в природе в виде одного изотопа (Be, F, Na, Al, P, I), в качестве меченых атомов используют только искусственные радиоактивные изотопы; примером часто применяемых радиоактивных изотоповслужат 3H, 14C, 32P, 35S, 45Ca, 51Cr, 59Fe, 60Co, 89Sr, 95Nb, 110Ag, 131I и др. Выбор радиоактивного изотопа определяется его ядерными характеристиками — периодом полураспада, типом и энергией излучения. Для индикации пригодны радиоактивные изотопы, период полураспада которых не очень мал, что позволяет работать в течение времени, необходимого для эксперимента, но и не очень велик, что даёт возможность работать с весьма малыми количествами индикатора.

1.2.1 Стабильные изотопы Стабильные изотопы — это изотопы, не подверженные радиоактивному распаду и, как следствие, не дающие радиоактивного излучения; работа с такими изотопами не требует специальных мер предосторожности и защиты. Отклонения от закона постоянства изотопного состава в большинстве случаев легко объяснимы. Главной причиной отклонения от постоянства изотопного состава для стабильных изотопов связана с природным фракционированием изотопов химических элементов. Незначительные различия физических свойств соединений изотопов становятся причиной столь же незначительных вариаций в изотопном составе, возникающих при различных природных процессах: испарении или замерзании вод, деятельности животных или растительных организмов, геологических процессах и т. п.

Соединения, имеющие одинаковый химический, но различный изотопный состав, называются изотопными разновидностями (или изотопно-замещёнными соединениями). Изотопные разновидности по своим физическим и физико-химическим свойствам различаются тем сильнее, чем больше относительные различия в массах тех изотопов, состав которых варьируется. Эти различия называются изотопными эффектами.

Применение стабильных изотопов некоторых лёгких элементов.

Водород: Изотоп водорода с массовым числом два (дейтерий) занимает особое место среди изотопов других элементов. Прежде всего, играет роль то обстоятельство, что только у водорода существует такое громадное различие между массами изотопов: в 2 раза для протия и дейтерия.

Пожалуй, ни один из изотопов других химических элементов не играет такой важной самостоятельной роли в области практических приложений. Наиболее важным соединением дейтерия является тяжелая вода D2O. В настоящее время тяжелая вода имеет исключительно важное значение как замедлитель нейтронов в ядерных реакторах. Развитие работ по атомной энергетике на первом ее этапе во многом обязано разработке способов получения тяжелой воды в больших масштабах. Некоторые свойства тяжелой воды были приведены выше.

Для исследовательских и препаративных целей используется ряд неорганических и органических соединений, в которых весь водород замещен на дейтерий: например, дейтеросерная кислота D2SO4, дейтерогидразин N2D4, дейтероуксусная кислота CD3COOD и CH3COOD, дейтеробензол C6D6 и др. Соотношения между свойствами дейтерированных и «обычных» соединений приблизительно такие же, как между D2O и H2O.

Дейтериевая вода в своей молекуле содержит два атома дейтерия, который несмотря на свою незначительную удельную массу на молекулярном уровне и вобщем количестве потребляемой воды делает отрицательную погоду, неблаготворно влияет на процессы жизнедеятельности. Вред привносит дейтерий. Он в настоящее время, также как и соединения, его содержащие, достаточно хорошо изучен, пожалуй, даже лучше многих других элементов таблицы Д. И. Менделеева, так как на тяжелую воду возник промышленный спрос. Изучено влияние дейтерия на жизнедеятельность организмов: выяснено, что в больших концентрациях для высших растений и животных — это яд.

Бор: Стабильные изотопы бора 10B и 11B, резко отличаясь по ядерно-физическим свойствам, широко используются в атомной науке и технике, а также связанных с ней отраслях.

Стабильный изотоп 10B используется в реакторостроении в виде карбида бора как составная часть стержней, регулирующих скорость ядерных процессов в реакторе, а также в форме раствора борной кислоты в теплоносителе первого контура. Изотоп 10B при малом удельном весе обеспечивает высоко-эффективную (превосходящую в сотни раз бетон) нейтронную защиту, что используется при создании малогабаритных реакторов, устанавливаемых на транспорте. Он также применяется в качестве антиактивационного покрытия, предотвращающего нейтронную активацию материалов, используемых в реакторостроении и ядерно-физических экспериментах.

Способность 10B трансформировать поток нейтронов в тяжелые ионизирующие частицы с длиной пробега, соизмеримой с размером живой клетки, используется в специальном приборостроении (при производстве, например, нейтронных счетчиков), а также в нейтронозахватной терапии злокачественных опухолей в медицине.

Стабильный изотоп 11B используется в ЯМР — спектроскопии, а также в реакторостроении при создании жаростойких, «прозрачных» по отношению к нейтронам конструкционных материалов (боридов циркония, иттрия, титана и их сплавов). В последние годы интерес к изотопночистому 11B возрос со стороны электронной промышленности, где химически чистый бор используется в качестве легирующего компонента при производстве полупроводниковых изделий. Этот интерес обусловлен возможностью использовать нейтроноактивационный метод анализа для определения в таком боре до 28 различных примесей на концентрационном уровне примерно 10 — 8%.

Углерод: На сегодняшний день редкий стабильный изотоп углерода 13С (природная концентрация 1,1%) нашёл достаточно широкое применение. Он используется для изучения механизма химических реакций и биохимических реакций в медицине. Особое значение тяжелый изотоп углерода 13С имеет для выяснения механизмов процессов, происходящих в живых организмах. Перспективной сферой применения изотопа углерода 13С (концентрация более 90 ат. %) является диагностика различных функциональных нарушений в организме: почечной недостаточности, нарушения обменных процессов печени, диабета, кислородного голодания сердечной мышцы, легочной недостаточности, метаболических нарушений, обусловленных дисфункцией эндокринных и других органов и т. д.

Разработан уникальный метод диагностики заболеваний с применением меченных изотопом 13С соединений. Это так называемые тесты дыхания. Препарат, принимаемый пациентом, претерпевает в организме изменения, связанные с протеканием биохимических реакций в разных органах. Через некоторое время препарат частично или полностью разлагается и выводится из организма. Содержащийся в препарате углерод в процессе реакций обмена окисляется и выводится в виде углекислого газа через легкие в выдыхаемом воздухе. Если изотопный состав содержащегося в препарате углерода отличен от природного, то появление в выдыхаемом воздухе углекислоты, содержащей углерод препарата, может быть зарегистрировано с помощью соответствующей аппаратуры. Имея информацию о путях и скоростях метаболических превращений препарата в исследуемом органе и вводя в него изотопную углеродную метку, можно сделать вывод о состоянии органа. Исследования такого рода, проводимые ранее в основном для решения научных биомедицинских задач, начали с недавнего времени использоваться в повседневной клинической практике.

Наибольшее распространение получил так называемый уреазный тест, призванный определять наличие в желудочно-кишечном тракте helicobacterpilory — бактерии, ответственной за возникновение подавляющего числа наиболее распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта — язвенных болезней и гастритов. Простота, надежность, быстрота проведения и безопасность тестов дыхания для пациентов позволяют делать оптимистический прогноз относительно этой диагностики. Определенным ориентиром здесь могут служить США — ежегодно здесь проводится около 2 млн. тестов с использованием препаратов, меченных изотопами углерода.

Теплопроводность алмаза на основе лёгкого наиболее распространённого изотопа углерода 12С (конц. 12С — 99,9 ат. %) в 1,5 раза выше теплопроводности алмаза природного изотопного состава (конц. 12С — 98,9 ат. %). Использование в электронике изотопномодифицированных алмазных плёнок на основе 12С позволяет существенно улучшить технические характеристики приборов и оборудования.

В научно-исследовательском центре курортологии и реабилитации внедрена программа диагностики заболеваний желудочно-кишечного тракта с помощью изотопов углерода. За научными терминами кроется простой и важный для пациентов смысл: теперь для обследования желудка не надо глотать зонд — достаточно выпить 50 грамм. Врач дает пациенту разработанный в России тест-комплект. Он содержит меченые атомы — изотопы углерода. Спустя 20 минут проводится повторный тест — уже после того, как препарат будет поглощен.

1.2.2 Радиоактивные изотопы Для элементов, существующих в природе в виде одного изотопа (Be, F, Na, Al, P, I), в качестве меченых атомов используют только искусственные радиоактивные изотопы; примером часто применяемых радиоактивных изотопов служат:

3H, 14C, 32P, 35S, 45Ca, 51Cr, 59Fe, 60Co, 89Sr, 95Nb, 110Ag, 131I и др.

Выбор радиоактивного изотопа определяется его ядерными характеристиками — периодом полураспада, типом и энергией излучения. Для индикации пригодны радиоактивные изотопы, период полураспада которых не очень мал, что позволяет работать в течение времени, необходимого для эксперимента, но и не очень велик, что даёт возможность работать с весьма малыми количествами индикатора. В атомной индустрии все возрастающую ценность для человечества представляют радиоактивные изотопы. Элементы, не существующие в природе. С помощью ядерных реакций можно получить радиоактивные изотопы всех химических элементов, встречающихся в природе только в стабильном состоянии. Элементы под номерами 43, 61, 85 и 87 вообще не имеют стабильных изотопов и впервые получены искусственно. Так, например, элемент с порядковым номером Z=43, названный технецием, имеет самый долгоживущий изотоп с периодом полураспада около миллиона лет. С помощью ядерных реакций получены также трансурановые элементы. О нептунии и плутонии вы уже знаете. Кроме них, получены еще следующие элементы: америций (Z=95), кюрий (Z=96), берклий (Z=97), калифорний (Z=98), эйнштейний (Z=99), фермий (Z=100), менделевий (Z=101), нобелий (Z-102), лоуренсий (Z= 103), резерфордий (Z=104), дубний (Z= 105), сиборгий (Z=106), борий (Z= 107), гассий (Z=108), мейтнерий (Z= 109), а также элементы под номерами 110, 111 и 112, не имеющие пока общепризнанных названий. Элементы начиная с номера 104 впервые синтезированы либо в подмосковной Дубне, либо в Германии.

Список радиоактивных изотопов, которые используются в современной жизни, вообще крайне ограничен самой природой. В состав органических соединений входят водород, углерод, кислород, азот, а также гораздо реже фосфор и сера. Следовательно, для получения немодифицированных меченых соединений круг возможных радионуклидов ограничен этими биогенными элементами. Радиоактивные изотопы кислорода и азота имеют совершенно неприемлемый для работы в современной жизни период полураспада — от нескольких минут до миллисекунд. Такие ультра короткоживущие изотопы (УКЖ) уже применяются в медицине и технике, однако их использование в физико-химической биологии весьма проблематично. Вообще, «идеальный радионуклид» для современной жизни должен отвечать следующим критериям:

1. Элемент должен входить в состав всех органических молекул. Это понятно, так как делает возможным введение «меченого атома» в любую молекулу.

2. Период полураспада «идеального радионуклида» 10ч100 дней. Это будет соответствовать теоретической молярной активности в диапазоне 1018ч1017 Бк/моль и сможет обеспечить высокую чувствительность метода.

3. Чистый в-излучатель с максимальной энергией излучения не более 0,4 Мэв. Это позволяет сравнительно просто детектировать радионуклид и в тоже время сохраняет высокое разрешение методов, связанных с авторадиографической детекцией меченых продуктов.

1.3 Изотопные индикаторы в биологии, медицине и сельском хозяйстве В биологии изотопные индикаторы применяют для решения как фундаментальных, так и прикладных биологических проблем, изучение которых другими методами затруднено или невозможно. Существенное для биологии преимущество метода меченых атомов состоит в том, что использование изотопных индикаторов не нарушает целостности организма и его основных жизненных отправлений. С применением изотопных индикаторов связаны многие крупные достижения современной биологии, определившие расцвет биологических наук во 2-й половине 20 в. С помощью стабильных и радиоактивных изотопов водорода (2H и 3H), углерода (13Cи 14C), азота (15N), кислорода (18O), фосфора (32P), серы (35S), железа (59Fe), йода (131I) и др. были выяснены и детально изучены сложные и взаимосвязанные процессы биосинтеза и распада белков, нуклеиновых кислот, углеводов, жиров и др. биологически активных соединений, а также химические механизмы их превращений в живой клетке.

Применение изотопных индикаторов привело к пересмотру прежних представлений о природе фотосинтеза, а также о механизмах, обеспечивающих усвоение растениями неорганических веществ — карбонатов, нитратов, фосфатов и др. С помощью изотопных индикаторов выполнено огромное число исследований в самых разнообразных направлениях биологии и биохимии. Одно из направлений включает работы по изучению динамики и путей перемещения популяций в биосфере и отдельных особей внутри данной популяции, миграции микробов, а также отдельных соединений внутри организма. Вводя в организмы с пищей или путём инъекций метку, удалось изучить скорость и пути миграции многих насекомых (москитов, мух, саранчи), птиц, грызунов и др. мелких животных и получить данные о численности их популяций. В области физиологии и биохимии растений с помощью изотопных индикаторов решен ряд теоретических и прикладных проблем: выяснены пути поступления минеральных веществ, жидкостей и газов в растения, а также роль различных химических элементов, в том числе микроэлементов, в жизни растений. Показано, в частности, что углерод поступает в растения не только через листья, но и через корневую систему, установлены пути и скорости передвижения ряда веществ из корневой системы в стебель и листья и из этих органов к корням. В области физиологии и биохимии животных и человека изучены скорости поступления различных веществ в их ткани (в том числе скорость включения железа в гемоглобин, фосфора в нервную и мышечные ткани, кальция — в кости).

Важная группа работ охватывает исследования механизмов химических реакций в организме. Так, во многих случаях удалось установить связь между исходными и вновь образующимися молекулами, проследить за «судьбой» отдельных атомов и химических групп в процессах обмена веществ, а также выяснить последовательность и скорость этих превращений. Полученные данные сыграли решающую роль при построении современных схем биосинтеза и метаболизма (метаболических карт), путей превращения пищи, лекарственных препаратов и ядов в живых организмах. К работам этой группы относится выяснение вопроса о происхождении кислорода, выделяемого в процессе фотосинтеза: оказалось, что его источником является вода, а не двуокись углерода. С другой стороны, применение 14CO2 позволило выяснить пути превращений двуокиси углерода в процессе фотосинтеза. Использование «меченой» пищи привело к новому представлению о скоростях всасывания и распространения пищевых веществ, об их «судьбе» в организме и помогло проследить за влиянием внутренних и внешних факторов (голодание, асфиксия, переутомление и т. д.) на обмен веществ.

Метод изотопных индикаторов позволил изучить процессы обратимого транспорта веществ через биологические мембраны. Было показано, что концентрации веществ по обе стороны мембраны остаются постоянными с сохранением градиентов концентрации, характерных для каждой из разделённых мембранами сред.

Метод изотопных индикаторов нашёл применение в исследовании процессов, решающую роль в которых играет передача информации в организме (проводимость нервных импульсов, инициация и рецепция раздражения и др.) Эффективность метода изотопных индикаторов в работах этого рода обусловлена тем, что исследования проводятся на целостных, интактных организмах, сохраняющих неповрежденной всю сложную систему нервных и гуморальных связей. Наконец, группа работ включает исследования статических характеристик биологических структур, начиная с молекулярного уровня (белки, нуклеиновые кислоты) и кончая надмолекулярными структурами (рибосомы, хромосомы и др. органеллы). Например, исследования относительной устойчивости белков и нуклеиновых кислот в 1H2O, 2H2O и в H218O способствовали выяснению природы сил, стабилизирующих структуру биополимеров, в частности роли водородных связей в биологических системах.

Важное значение при выборе изотопа имеет вопрос о чувствительности метода изотопного анализа, а также о типе радиоактивного распада и энергии излучения. Преимущество стабильных изотопов (2H, 18O, 15N и др.) — отсутствие излучений, часто оказывающих побочное воздействие на исследуемую живую систему. В то же время, сравнительно низкая чувствительность методов их определений (масс-спектроскопия, денситометрия), а также необходимость выделения меченого соединения ограничивают применение стабильных изотопов в биологии. Высокая чувствительность регистрации гамма-активных изотопов (59Fe, 131I и др.) позволила в живом организмеизмерить скорость кроветока, определить количество крови и время её полного кругооборота, исследовать работу желёз внутренней секреции. С помощью изотопных индикаторов в медицине были раскрыты механизмы развития (патогенез) ряда заболеваний; их применяют также для изучения обмена веществ и диагностики многих заболеваний. Изотопные индикаторы вводят в организм в крайне малых количествах, не способных вызвать какие-либо патологические сдвиги. Различные элементы неравномерно распределяются в организме. Аналогично им распределяются и изотопные индикаторы. Излучение, возникающее при распаде изотопа, регистрируют радиометрическими приборами, сканированием, авторадиографией и др. Так, состояние большого и малого круга кровообращения, сердечного кровообращения, скорости кровотока, изображение полостей сердца определяют с помощью соединений, включающих 24Na, 131I, 99MTc; для изучения лёгочной вентиляции и заболеваний спинного мозга применяют 99MTc, 133Xe; макроагрегаты альбумина человеческой сыворотки с 131I используют для диагностики различных воспалительных процессов в легких, их опухолей и при различных заболеваниях щитовидной железы. Концентрационную и выделительную функции печени изучают при помощи краски бенгал-роз с 131I, 198Au; функцию почек — при ренографии c 131I-гиппураном и сканированием после введения неогидрина, меченого 203Hg или 99MTc. Изображение кишечника, желудка получают, используя 99MTc, селезёнки — применяя эритроциты с 99MTc или 51Сr; с помощью 75Se диагностируют заболевания поджелудочной железы. Диагностическое применение имеют также 85Sr и 85P.

Изотопные индикаторы в сельском хозяйстве (3H, 14C, 22Na, 32P, 35S, 42K, 45Ca, 60Co, 65Zn, 99Mo и др.) широко используются для определения физических свойств почвы и запасов в ней элементов пищи растений, для изучения взаимодействия почвы и удобрений, процессов усвоения растениями питательных элементов из минеральных туков, поступления в растения минеральной пищи через листья и других вопросов почвоведения и агрохимии. Пользуются изотопными индикаторами для выявления действия на растительный организм пестицидов, в частности гербицидов, что позволяет установить концентрацию и сроки обработки ими посевов. Применяя метод изотопных индикаторов, исследуют важнейшие биологические свойства с.-х. культур (при оценке и отборе селекционного материала) — урожайность, скороспелость, хладостойкость. В животноводстве изучают физиологические процессы, протекающие в организме животных, проводят анализ кормов на содержание токсичных веществ (малые дозы которых трудно определить химическими методами) и микроэлементов. При помощи изотопных индикаторов разрабатывают приёмы автоматизации производственных процессов, например отделение корнеклубнеплодов от камней и комков почвы при уборке комбайном на каменистых и тяжёлых почвах.

2. Авторадиография Основное назначение авторадиографии — регистрация полос радиоактивно меченых препаратов (белков и НК) после электрофореза. Для этой цели используют медицинскую «неэкранированную» рентгеновскую пленку (в пленках с защитным слоем на поверхности поглощается часть излучения). Почернение рентгеновской пленки (после проявления) происходит как под действием электронов, так и у-излучения. Препараты, меченые тритием, ввиду малой проникающей способности его (3-электронов, лишь в случае очень высоких интенсивностей излучения удается регистрировать данным методом. Авторадиография препаратов, меченых S и С осуществляется вполне успешно. Однако пластинки ПААГ в этих случаях необходимо перед регистрацией радиоактивности полностью высушивать. В противном случае Р-электроны, испускаемые в глубине геля, не достигнут пленки. Сушат гель, уложив его на толстую фильтровальную бумагу (он прилипает и при сушке не съеживается), 1−2 часа в вакууме и с нагреванием или 36 часов на воздухе при комнатной температуре — до состояния тонкой, прочной и прозрачной пленки. Тем не менее, нежелательно, чтобы толщина влажного геля превышала 0,4 мм. Рентгеновскую пленку накладывают эмульсией прямо на гель. В такой постановке опыта Р-электроны углерода и серы проникают в слой эмульсии на глубину около 0,25 мм. Для хорошего прилегания пленки к гелю под крышку соответствующей кассеты с пружинными зажимами кладут прокладку из губчатой резины. Саму кассету заворачивают в черную бумагу. Экспозиция длится несколько дней. Затем следует, как обычно, проявление и фиксация.

Энергия Р-излучения радиоактивного фосфора достаточно велика, чтобы его авторадиографию можно было вести прямо с влажной пластины геля. Гель, покрытый пленкой, оставляют на одной из стеклянных пластин, заворачивают в тонкий полиэтилен и экспонируют, как было описано выше, в течение нескольких часов — лучше на холоде (-20°), с тем, чтобы помешать расплыванию полос в геле во время экспозиции за счет диффузии. Р-электроны радиоактивного фосфора могут проходить в материале рентгеновской пленки до глубины в 6 мм. Это означает, что большая часть их «прошивает» пленку, не передав всю свою энергию молекулам бромистого серебра и, следовательно, не самым лучшим образом регистрируются. Иногда, если интенсивность Р-излучения невелика (за малостью содержания), эти «пропадающие зря» электроны улавливают с помощью фосфоресцирующего экрана, который устанавливают по другую сторону пленки. Попавшие на экран Р-электроны вызывают его свечение и пленка регистрирует (не без некоторого размытия изображения) еще и светящуюся полосу на экране. Зато яркость почернения в этом случае может увеличиться в 5−8 раз.

Поскольку при использовании флюоресценции экрана возможна релаксация кристаллов бромистого серебра, распавшихся под действием света, экспозицию пленки лучше проводить в этом случае при — 70°. Для правильного совмещения пленки после проявления с исходным гелем, на нем до авторадиографии делают две пометки по углам радиоактивными чернилами.

2.1 Преимущества и недостатки авторадиографии Авторадиография весьма популярный метод детекции различных нуклеотидов. Но как и у любого метода у неё тоже существуют свои преимущества и недостатки.

Главное преимущество авторадиографии — простота и доступность. Выдержите (проэкспонируйте) образец с рентгеновской пленкой, затем проявите пленку в стандартных условиях — и получите картину распределения радионуклида по поверхности образца: геля, тонкослойной хроматограммы и т. д. Если полученная «картинка» вас не устраивает — можно повторить экспозицию с новой пленкой, увеличивая (или уменьшая) время по своему желанию. Обычно время экспозиции меняют в 2ч3 раза, так как изменение времени экспозиции на 20ч30% существенных изменений в картину не вносит. Весь сиквенс ДНК и РНК с радиоактивным фосфором использовал исключительно авторадиографию. Флюоресцентная метка практически полностью вытеснила радиоактивные изотопы из секвенирования, однако авторадиография остается широко применяемым методом детекции.

Главный недостаток авторадиографии — сложности с количественной оценкой. При визуальном определении даже интуитивно ясно, что интенсивность «почернения» пленки пропорциональна количеству радиоактивных атомов в этом месте. Но вопрос об этой «пропорциональности» нуждается в пояснении. Существует несколько типов сканеров, позволяющих довольно точно определять интенсивность «зачернения» пленки и, следовательно, сравнивать пятна инструментально, а не «на глаз». Оказалось, что диапазон активности препарата, в котором интенсивность «зачернения» пленки прямо пропорциональна количеству радиоактивных атомов, очень невелик и зависит от времени экспозиции образца с пленкой, типа пленки, природы радионуклида (тип распада и энергия излучения) и даже от режима обработки пленки. Например, для фосфора-32 за ночь экспозиции линейная зависимость «зачернения» пленки от активности образца находится в диапазоне 0,5ч25 Бк на мм2 (примерно 30ч1500 имп/мин). Дальнейшее увеличение активности образца, например, до 100 Бк на мм2 не приводит к большей интенсивности «зачернения» — всё уже «зашкалило» .

Поэтому, простой совет для начинающих работать с количественной авторадиографией. Сделайте несколько калибровок — нанесите ряд пятен диаметром 1ч1,5 мм с активностью 1 · 3 · 10 · 30 · 100 · 300 Бк, проэкспонируйте их с рентгеновской пленкой различное время и после обработки пленки просканируйте её на своем приборе. Вы сразу определите диапазон, в котором ваши последующие количественные измерения радиоавтографов будут корректными. Для разных радионуклидов такой диапазон различается очень существенно, но учитывать его надо в любом случае.

Для увеличения чувствительности авторадиографии (точнее, для уменьшения времени экспозиции) можно воспользоваться усиливающими экранами. Это весьма эффективно для фосфора-32 или йода-125, однако практически бесполезно для мягких (слабоэнергетических) в-излучателей. Использование экрана для фосфора-32 позволяет снизить время экспозиции в 2ч3 раза, но за это приходится «платить» ухудшением разрешения, которое происходит за счет «размывания зон» .

3. Сцинтилляционные счетчики Эффект сцинтилляции для количественного определения радионуклидов начинали использовать еще во времена Резерфорда, который визуально считал сцинтилляционные вспышки под микроскопом. За сто лет принципиальных изменений не произошло. Рядом с источником излучения помещают сцинтиллятор и ФЭУ (фотоэлектронный умножитель), который считает вспышки. Сцинтиллятор может быть твердым, а может быть и жидким (чаще, растворенным в жидкости). Во флакон (vial) с жидким сцинтиллятором добавляют тестируемый образец, и в этом случае можно эффективно измерять даже самое «слабое», низкоэнергетическое излучение.

При измерении активности (радиоактивности) любых образцов и для любых средств измерения необходимо помнить несколько простых, но важных правил:

Радиоактивный распад является классическим примером случайного, вероятностного природного процесса и, рассматривая измерение активности как регистрацию случайных событий, мы получаем математическую ошибку измерения активности:

n½/n x 100%

где n — число «событий» (в нашем случае распадов).

Например, для 400 зарегистрированных импульсов на любом приборе независимо от времени измерения (наблюдения) 4001/2 / 400×100% = 5%, т. е. ошибка 5%. Это означает, что чем больше число измерений (собственно счет), тем меньше математическая ошибка измерения. Более того, вопреки устоявшейся традиции, для снижения математической ошибки измерения надо считать не число зарегистрированных прибором распадов (импульсов) за единицу времени, а время, необходимое для «накопления нужного» числа импульсов — например, 10 000 имп. Тем не менее, во всем мире активность с помощью счетчиков измеряют как количество импульсов за единицу времени (обычно по 1 минуте).

Все счетчики имеют верхний предел измерения, после которого их точность падает, так как счетчик не успевает регистрировать — «захлебывается». Для сцинтилляционных счетчиков — это активность на уровне 106ч107 расп./мин. Некоторые типы счетчиков имеют встроенную блокировку и отказываются считать образцы, активность которых превышает установленную для данной модели. Оптимальная активность образца для точного измерения 104ч106 расп./мин.

Проводя количественные измерения, например, определяя концентрацию радионуклида в растворе, всегда делайте хотя бы 2, а лучше 3 измерения независимых аликвот и активность определяйте как среднюю из 2 — 3 измерений. Затраты времени на «лишние» процедуры будут с лихвой компенсированы отсечением случайных «выбросов». Разброс в измерениях, особенно у начинающих исследователей, может достигать 200% и более, хотя в норме не должен превышать обычную ошибку рутинного отбора аликвот.

Ни один измерительный прибор не регистрирует 100% всех «распадов» (decompositions) в измеряемом образце. Эффективность счета — это коэффициент, который связывает зарегистрированные прибором импульсы (counts) и реальные распады (decompositions). Поэтому для любого измерения распады/мин. (dpm — decompositions per min.) больше импульсов/мин. (cpm — counts per min.). Правда, для большинства радионуклидов, применяемых в life science, эффективность жидкостного сцинтилляционного счета составляет более 90%. Однако, тритий удается измерять с эффективность не более 50ч60%. Обычно эффективность счета для каждого радионуклида указывается в технической документации к прибору, и долгое время негласное соревнование между фирмами за более высокую эффективность счета трития было чуть ли не главным двигателем технического прогресса в этой области.

Все измерительные приборы имеют собственный «фон» — регистрируют какое-то количество импульсов без источника ионизирующего излучения (радиоактивного препарата). Природа фона различна: космическое излучение, электронный шум, содержание природных радионуклидов в помещении, где установлена измерительная аппаратура и т. д. Поэтому минимально достоверная величина активности, измеряемая прибором, увязывается с фоном и обычно принимается равной трехкратному превышению фона данного прибора. Если в вашем «эпохальном» эксперименте активность «главного» образца едва-едва превышает фон, попытайтесь увеличить время измерения (можно до 20 мин.) — тогда достоверность измерения возрастёт.

В большинстве случаев в life science абсолютные измерения активности не нужны, и гораздо важнее получить информацию об относительной активности образцов: распределение активности по гелю, хроматографической пластинке или по элюированным с колонки продуктам; доля субстрата, превратившегося в продукт под действием фермента; доля лиганда, связанного с рецептором; детекция продуктов метаболизма соединения, меченного радионуклидом, и другие аналогичные задачи. Поэтому очень важно, чтобы условия приготовления и измерения образцов в конкретном эксперименте были одинаковыми, тогда абсолютные погрешности в измерениях не окажут существенного влияния на биологические результаты.

Наиболее ярко эту относительность измерений иллюстрирует широкое использование минимониторов — приборов, предназначенных для определения загрязнения поверхностей рабочих столов, одежды и т. д. Небольшие карманные приборы, имеющие ионизационный счетчик (обычно это ионизационная камера или счетчик Гейгера), оказались очень удобными для детекции меченного фосфором-32 фрагмента ДНК в агарозном геле или меченного йодом-125 белка в ПААГ и т. п. Некоторые ухитряются по показаниям такого прибора оценивать включение меченых предшественников биосинтеза в биополимеры после разделения продуктов реакции, используют мониторы для измерения активности образцов на фильтрах, кусках фильтровальной или хроматографической бумаги и даже в пробирках. Это удобно и полезно для качественных и полуколичественных оценок, но следует помнить, что приборные ошибки в таких измерениях могут быть очень значительными и достигать 200—300%.

Жидкостные сцинтилляционные счетчики уже многие годы остаются главным инструментом для количественного измерения радионуклидов. Несмотря на разнообразие конструкций, с точки зрения пользователя, все они измеряют активность образцов, помещенных в специальный стеклянный или пластиковый флакон и заполненный жидким сцинтиллятором. Поскольку измерение активности сводится к подсчету вспышек света, жидкость во флаконе должна быть прозрачная для счета и гомогенная по составу. Все отклонения от этого требования снижают эффективность счета, причем иногда существенно. Образование осадка или двухфазной несмешивающейся жидкой системы, наличие образцов биологических тканей или фильтровальных материалов — все эти факторы снижают эффективность счета. То же самое касается добавок многих химических веществ: кислот, щелочей, концентрированных растворов сахаров, солей, мочевины и многое другое. Особенно это касается измерений трития, где разница в эффективности счета для гомогенного, почти идеального, образца и образца, нанесенного на хроматографический сорбент, может быть в 10ч30 раз и даже больше. Это необходимо учитывать, если при составлении баланса по активности вдруг куда-то исчезнет часть радиоактивного материала или откуда-то внезапно появится «лишнее» .

Составы сцинтилляторов весьма разнообразны и фирмы, производящие сцинтилляционные коктейли, часто не раскрывают их состав. Классический (едва ли не самым первый) жидкий сцинтиллятор — это толуольный раствор 2,5-дифенилоксазола (РРО) с добавкой 1,4-ди-[2-фенил-(5-окзазолил)]-бензола (РОРОР). Состав: 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л толуола. Не вдаваясь в подробности, следует подчеркнуть, что это — неводная система, а водные растворы считать в таком сцинтилляторе не принято. Для измерения водных проб к такому сцинтиллятору добавляют тритон Х-100 до 30% по объему.

Другим вариантом «водолюбивого» сцинтиллятора является диоксановый: 60 г нафталина, 4 г РРО, 0,2 г РОРОР, 200 мл спирта и до 1 л диоксан марки «сцинтиляционный». Впрочем, большинство исследователей сегодня успешно пользуются готовыми фирменными коктейлями, справедливо не задумываясь над их составом.

Важными источниками ошибок для жидкостного сцинтилляционного счета являются «засветка» сцинтилляционной жидкости и электризация счетных флаконов. Оба эффекта легко нейтрализуются во времени (не спешите сразу считать, дайте пробам постоять в темном пространстве прибора несколько минут), кроме того, электризация почему-то чаще проявляется на стеклянных флаконах, и реже — на одноразовых пластиковых.

Внедрение в технологию биоскрининга радиометрических методов анализа подвигло разработчиков на создание высокопроизводительных сцинтилляционных счетчиков для измерения активности в планшетах. Для радиоактивных изотопов фосфора прибор используется в модификации с внешним твердым сцинтиллятором, который и является детектором. Для трития твердый сцинтиллятор добавляют прямо в лунку планшета в виде специальных бусинок и, так как эти бусинки являются одновременно компонентом биохимической реакции, то связанный с «бусами» меченый тритием лиганд считается сцинтиллятором, а не связанный, находящийся в растворе, — не считается. С радиохимической точки зрения эффективность счета в таких измерениях очень низкая, но для биоскрининга важно относительное распределение меченых соединений в системе «связанный-несвязанный», а высокая производительность и простота операций оправдывают колоссальные затраты на реализацию таких методов.

3.1 Сцинтилляции и сцинтилляторы Основными характеристиками сцинтилляторов являются: световой выход, спектральный состав излучения и длительность сцинтилляций. При прохождении заряженной частицы через сцинтиллятор в нем возникает некоторое число фотонов с той или иной энергией. Часть этих фотонов будет поглощена в объеме самого сцинтиллятора, и вместо них будут испущены другие фотоны с несколько меньшей энергией. В результате процессов реабсорбции наружу будут выходить фотоны, спектр которых характерен для данного сцинтиллятора. Световым выходом или конверсионной эффективностью сцинтиллятора называется отношение энергии световой вспышки, выходящей наружу, к величине энергии Е заряженной частицы, потерянной в сцинтилляторе. Каждый сцинтиллятор испускает не моноэнергетические кванты, а сплошной спектр, характерный для данного сцинтиллятора. Очень важно, чтобы спектр фотонов, выходящих из сцинтиллятора, совпадал или хотя бы частично перекрывался со спектральной характеристикой ФЭУ. Степень перекрытия внешнего спектра сцинтилляции со спектральной характеристикой е (н) данного ФЭУ определяется коэффициентом согласования