Методы идентификации и типизации вирусов ящура

Ямщур — острое вирусное заболевание из группы антропозоонозов (инфекционных болезней животных, которыми болеет также и человек), характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полостей, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа, а у животныхмежкопытной щели.

Ящур довольно широко распространен среди животных. В ряде стран заболевание носит характер эпизоотии (эпидемий среди животных), повторяющихся через определенные промежутки времени. Наиболее подвержены инфекции молодые парнокопытные сельскохозяйственные животные (крупный рогатый скот, свиньи, козы, овцы, олени). От неё могут страдать также лошади, верблюды, собаки, кошки и грызуны. У животных, перенесших заболевание, и некоторых птиц установлено вирусоносительство, проявляющееся выделением возбудителя с испражнениями.

Инфекционный процесс у парнокопытных характеризуется тяжелым течением с вирусемией, афтозными высыпаниями и изъязвлениями в области слизистых оболочек полости рта, языка, носоглотки, носа, губ, на коже в межкопытных щелях, на вымени, иногда около рогов. Общая продолжительность болезни у животных — от 10 до 15 дней, продолжительность инкубационного периода — 2— 4 дня. При злокачественном течении ящура, особенно у коров, более чем у 50% заболевших животных наступает смертельный исход в течение 2—3 суток.

Взятие патологического материала.

Основной путь инфицирования людей — через сырое молоко больных животных и продукты его переработки, реже через мясо. У лиц, непосредственно контактирующих с больными животными, возможна прямая передача инфекции (при доении, уходе, лечении, убое), воздушно-капельный путь заражения (при дыхании, кашле животных), а также через предметы, загрязненные их выделениями. Описаны случаи внутрилабораторного инфицирования.

Отбор материала для прижизненной диагностике. В зависимости от вида инфекции у клинически больных животных берут соответствующий, специфический для данной болезни материал, соблюдая меры личной безопасности.

Моча чаще всего служит объектом исследования при подозрении на лептоспироз. У коров и свиноматок мочу можно брать непосредственно из мочевого пузыря с помощью катетера или собирать при естественном мочеиспускании в чистые пробирки, банки. Легче всего мочу получать после утреннего подъема животных, а у свиней — в любое время дня после 1 …2-часового лежания.

Кал берут из прямой кишки в стерильную посуду, которую закрывают плотной крышкой. При обнаружении на стенке прямой кишки слизи, утолщений или других патологических изменений дополнительно делают соскобы; их помещают в отдельную посуду.

Выделения из верхних дыхательных путей и ротовой полости собирают в посуду при естественном истечении или поступают так:

Крылья носа и переднюю часть носовых ходов обмывают водой, после чего выделения собирают стерильными тампонами из глубоких частей носа. Тампоны помещают в стерильные пробирки, содержащие по 0,5 мл стерильного физиологического раствора.

Материал из язв и ран получают методом соскоба на границе пораженной и здоровой тканей.

Отбор материала для посмертной диагностики. Патологический материал необходимо взять как можно раньше: не позднее 12ч после гибели животного зимой и 6 ч — в теплое время года, законсервировать или отправить в свежем виде. Аутолизированный пат-материал для выделения возбудителя непригоден.

Для вирусологического исследования материалом могут служить:

Кровь или ее сыворотка, смывы из носоглотки и другие жидкости организма, стенки и содержимое афт, папулы (узелки), везикулы (серозные пузырьки), пустулы (гнойные пузырьки), кусочки головного мозга, печени, легких, селезенки или кусочки других органов и тканей, в которых вирус предполагаемого заболевания содержится в наибольшем количестве.

Для гистологического исследования патматериал берут только от свежих трупов. В лабораторию отправляют кусочки площадью 3…4 см2, толщиной не более 1 см, при этом следят, чтобы в них вошли пораженные и граничащие с ними неизмененные участки ткани.

Трупы мелких животных, части трупов крупных животных и отдельные органы в свежем виде направляют для исследования в лабораторию только нарочным. Посылаемый материал тщательно упаковывают в плотный деревянный или металлический ящик, чтобы предупредить рассеивание возбудителя по пути следования.

Консервирование патологического материала. Полученные пробы отправляют в лабораторию в свежем виде; если невозможно отправить в течение ближайших 24…30 ч, то их фиксируют в консерванте.

Для вирусологического исследования материал консервируют 50% - м глицерином на стерильном физиологическом растворе Наилучший и простой метод сохранения биологических свойств вирусов в патматериале — охлаждение. Надежно закрытые (флаконы заворачивают в вату или упаковочную бумагу и плотно укладывают в термос, заполненный на 1/3 снегом или льдом. При этом в термосе в течение 12…24 ч удерживается температура 2 6 «С, при которой вирусы сохраняются практически без изменений.

Лабораторная диагностика.

Выделение вируса. Эффективность выделения вируса из патологического материала повышается при использовании методов очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий. Благодаря удобству выполнения, экономичности, а главное, возможности быстрого получения результатов, позволяющих одновременно определить типовую и вариантную принадлежность эпизоотического вируса, чаще всего применяют РСК или РДСК. Однако, когда доставленное количество вирусного материала недостаточно для исследования или РСК дает отрицательный результат или неспецифическую задержку гемолиза, то ставят биопробу на КРС (не менее 2 голов) в возрасте 18 мес, вводя 0,1 мл суспензии полученного материала в несколько точек слизистой оболочки языка и мякишей конечностей; общий объем испытуемого материала 2−3 мл. Появление афт на месте введения материала с последующим подтверждением в РСК свидетельствует о наличии ВЯ. Однако метод дорог и связан с опасностью выноса вируса за пределы учреждения. Поэтому в диагностической практике он применяется очень редко. Чаще для биопробы используют мышат-сосунков 4−6-дн возраста, морских свинок массой не менее 500 г и первичную культуру клеток почек телят, поросят, ягнят, щитовидной железы КРС и перевиваемые клетки — ВНК-21, IB-RS-2. Биопроба на мышах удобна и экономична. ИД50 испытуемого штамма на мышатах-сосунах и крупном рогатом скоте одинаковы. Мышата-сосуны более чувствительны к вирусу ящура, чем морские свинки. Однако необходимо иметь в виду, что оценка результатов титрования на мышатах-сосунках нередко затруднительна.

Морские свинки легко заражаются при интрадермальном введении вируссодержащего материала в плантарную поверхность задних лапок методом тунелирования в дозе 0,2−0,5 мл. Заражают не менее 5 голов. Первичные поражения обычно появляются через 2−5 дн (по мере созревания). Вторичные поражения — везикулы в ротовой полости — обычно развиваются при заражении штаммами, адаптированными к морским свинкам.

Для выделения вируса чаще всего используют культуру первично-трипсинизированных клеток почек свиней или телят. Наблюдение за инфицированными культурами клеток ведут 7 дн, микроскопируя их ежедневно. Специфическая дегенерация клеток при подтверждении её специфичности в РСК свидетельствует о наличии ВЯ в испытуемом материале.

Индикация и идентификация вируса В качестве экспресс-метода в настоящее время широко применяется ПЦР. Эго быстрый и чувствительный метод обнаружения ВЯ в тканях путем энзиматической амплификации РНК гена полимеразы.

РСК по 100%-ному гемолизу. Применяется для определения типов и подтипов (вариантов) ВЯ, вызвавших заболевание животных, а также для проверки производственных штаммов ВЯ при изготовлении вакцин и лабораторных штаммов в научноисследовательской работе.

Антигенное родство ® более 70% свидетельствует о том, что штаммы по антигенным свойствам идентичны друг другу и относятся к одному и тому же варианту, от 10 до 70% - к различным вариантам (подтипам) и менее 10%- к различным типам.

РСК по 50%-ному гемолизу. Успешно применяют в работе научно-исследовательских лабораторий и учреждений биологической промышленности. Разработан способ изучения иммунного статуса вакцинированных против ящура животных в РСК. Он позволяет специалистам на уровне областных ветлабораторий проводить мониторинг за иммунным состоянием стад в простой и достоверной реакции.

РПГА. Это простой, ускоренный, чувствительный метод идентификации ВЯ. По чувствительности реакция превосходит общепринятый метод типировання ВЯ в РСК в 8−16 раз. Сущность её заключается в том, что нагруженные АТ эритроциты агглютинируются при контакте с ящурным АГ гомологичного типа.

Типирование ВЯ Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета. Испытание перекрестного иммунитета на КРС с целью определения типовой принадлежности полевого штамма ВЯ проводится лишь в том случае, если по лабораторным тестам обнаруживается новый тип ВЯ, ранее не встречавшийся в стране. Определение типа ВЯ методом перекрестного иммунитета возможно и на морских свинках.

Штаммы считают идентичными, если вакцина предохраняет животных от развития генерализованного процесса при заражении используемыми штаммами. В случае иммунологического отличия штаммов вакцинированные животные, инфицированные гетерологичным штаммом, заболевают генерализованной формой ящура.

При определении в культуре леток типа ВЯ его относят к тому типу, сыворотка против которого предотвращает ЦПД. Разработан вариант универсальный эритроиммуноадсорбции (УЭИА), позволяющий определять АГ ВЯ в более высоких титрах, чем в РСК и РПГА.

ИФА. Высокоэффективен для выявления как 146S-, так и 12Б-компонентов ВЯ. Этот метод в 500 раз чувствительнее РСК при исследовании проб афтозного эпителия. Установлена высокая степень специфичности и чувствительности ELISA для идентификации и типирования ВЯ всех 7 серотипов в эпителиальных тканях. Установлена высокая чувствительность сэндвич-варианта ИФА (на основе щелочной фосфатазы), который по эффективности превосходит в 207−219 раз, а с хромогенными субстратами — в 4−64 раза.

ИФА может быть пригодной в системе лабораторной диагностики ящура при исследовании диагностических штаммов. Для выявления АТ к ВЯ в ИФА можно использовать пробы крови, высушенной на фильтровальной бумаге. Первоначальный объем гепаринизированной крови равен 7,65 мкл.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика Ретроспективная диагностика с целью определения типа и варианта ВЯ, вызвавшего в прошлом заболевание животных, основана на идентификации АТ в РПСК, РДП и РРИД, НРИФ, реакции серозащиты на мышатах и PH в культуре клеток.

Для достоверного выявления АТ и определения их типовой специфичности пробы сыворотки крови должны быть взяты не ранее 7 дн с момента появления у животных признаков везикулярного заболевания или проведения вакцинации. На исследование следует направлять 5−10 проб сыворотки от каждой возрастной группы. На партию проб сыворотки, направляемой для исследования, оформляют сопроводительный документ.

Выявление, идентификация типовой специфичности и количественное определение АТ к ВЯ в РРИД, РПСК, РНСК и НИФ могут проводиться в условиях обычных ветеринарно-диагностических лабораторий и не требует создания более строгого санитарного режима, поскольку проводятся с неинфекционными материалами.

Для обнаружения ингибиторных (неполных) АТ применяют РНСК (или РПСК). Эти АТ отличаются высокой авидностью. Они формируют комплекс АГ-АТ, не адсорбирующий комплемент. Связываясь с АГ быстрее полных АТ, они блокируют его, но не связанный при этом комплемент в присутствии гемолитической сыворотки вызывает лизис эритроцитов. Ингибиторные АТ обнаружены сейчас при многих инфекциях, в том числе при ящуре. Данная реакция применяется для определения типов ВЯ по сывороткам переболевших животных, а также для обнаружения постинфекционных и поствакцинальных АТ.

Типироваиие ВЯ по сывороткам переболевших животных в РДП. В реакции используют: АГ из очищенного и концентрированного лапинизированного В Я типов 0, А, С и др.; сыворотки от переболевших ящуром животных (не пригодны для исследования в РДП сыворотки крови животных, дважды переболевших ВЯ различных типов), типоспецифические сыворотки; агаровая среда.

Постановка реакции: в центральные лунки 7-ми 6-угольных систем на агаровых пластинках помещают соответствующие АГ типов 0, А, С и др. В периферические лунки помещают пробы испытуемых и контрольных сывороток. Затем пластинки выдерживают во влажной камере при 37 °C. Реакцию учитывают через 16, 24, 48 и 72 ч после постановки. Положительная реакция характеризуется образованием одной или двух четких линий преципитации между лункой с АГ и сывороткой. ВЯ относят к тому типу, с АГ которого испытуемая сыворотка дает положительную реакцию. В случае обнаружения в сыворотках преципитирующих АТ к 2 и более типам вирус относят к тому типу, с АГ которого испытуемые сыворотки дают наибольший процент положительных реакций.

РРИД. Сущность её заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля. Реакция является типоспецифичной, позволяет провести исследования по типированию и количественному определению постинфекционных и поствакцинальных АТ.

Компоненты реакции: 1) антигены эталонные 7 типов ВЯ и других везикулярных болезней (ВБС 0−72 и Т-75, ВЭС А-48 и С-72, ВС Индиана и Нью-Джерси); 2) сыворотки эталонные 7 типов ВЯ и других везикулярных болезней (ВБС 0−72 и Т-75, ВЭС А-48 и С-72, ВС Индиана и Нью-Джерси); 3) агар белый или импортный фирм «Серва» или «Дифко», азид натрия или кислота карболовая, вода дистиллированная, БФР с pH 7,2−7,4. АТ, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому серотипу, с АГ которого они дали положительную реакцию. Их предельным титром считают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция. Титры сыворотки, полученные от вакцинированных животных, зависят от активности использованной вакцины, кратности и сроков ее применения и физиологических характеристик животного (возраст, вид). У 1- кратно вакцинированного против ящура взрослого КРС обычно титры через 30−90 дн после введения вакцины находятся в диапазоне 1:20—1:80, а после 2-кратной иммунизации в эти же сроки титр возрастает до 1:80−1:160. Титр у молодняка, как правило, в 2−3 раза ниже, чем у взрослых животных. У свиней и овец титры ниже, чем у КРС. После переболевания животных титры значительно выше, чем после вакцинации, и обычно превышают 1:160.

Встречный ИЭФ. Может быть с успехом использован для серотипирования ВЯ. Чувствительность его такая же, как и РДП, но учет результатов производится через 1,5 ч, тогда как реакция иммунодиффузии требует не менее 24 ч.

НИФ. При ящуре позволяет проводить дифференциацию АТ переболевших животных от вакцинированных. В справочнике «Диагностика вирусных болезней животных», 1992 г. приводится подробная методика постановки данной реакции при ящуре. Выявление в НИФ специфического свечения свидетельствует о наличии в испытуемой сыворотке постинфекционных антител, т. е. о переболевании животного ящуром.

С помощью РНГ, А определяют напряженность поствакцинального иммунитета у КРС. Установлена корреляция результатов, полученных при РПГА и PH. С помощью монАТ в PH или ELISA определяют не нейтрализуемые варианты ВЯ. В зависимости от чувствительности к монАТ все варианты ВЯ разделены на 3 группы. Варианты 1-й группы имели мутации преимущественно в области 140−160 VP1; варианты 2-й и 3-й групп мутируют в области 204 VP1 и 70, 139, 195 VP3 соответственно. Определены две большие АГ зоны вируса: чувствительная и нечувствительная к трипсину (VP1 140−160 и VP3 соответственно).

Реакция серозащиты на мышатах-сосунах. Используется для определение типа ВЯ по сывороткам животных-реконвалесцентов. Для постановки реакции используют эталонные (адаптированные к организму 4−7-дн мышат-сосунов) штаммы ВЯ различных типов. Штаммы должны быть типоспецифическими и иметь титр на мышатах-сосунах не ниже 7 lg в 1 г.

ВЯ, вызвавший заболевание животных, относят к тому типу, при заражении которым привитые сывороткой мышата остались живы. Необходимым условием достоверной оценки реакции серозащиты является обязательная гибель контрольных мышат, которым введен вирус, в то время как контрольные мышата, которым вводили только испытуемую сыворотку, должны выжить.

PH в культуре клеток. Для постановки PH необходимо иметь 24 пробирки культур клеток. Отсутствие ЦПД в пробирках, в которые внесена смесь вируса с сывороткой, при четко выраженном ЦПД в контрольных пробирках, указывает на наличие в исследуемой сыворотке АТ против данного типа ВЯ. Специфичность ЦПД можно установить путем исследования в РСК культуральной жидкости, полученной из пробирок с выраженным ЦПД. вирусный интоксикация патологический везикулезный Дифференциальная диагностика. При дифференциальной диагностике ящура необходимо исключить ВС, ВБС, ВЭС, катаральную лихорадку овец. Для дифференциальной диагностики в лабораториях используют диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью, для ящура и ВБС.

Иногда в материале от людей, подозреваемых в заболевании яшуром, выделяли возбудителя энтеровирусной инфекции человека — вирус Коксаки серотипа В. Вирус вызывал видимое ЦПД в перевиваемых культурах клеток в течение 24 ч, имея икосаэдрическую форму, размером 20−30 нм и вызывал гибель мышат при интрацеребральном заражении.