Введение. 
Разработка технологии культивирования и применения клеток кожи в лечении длительно незаживающих ран

Актуальность проблемы. Термические поражения, огнестрельные ранения, обширные механические повреждения, гнойно-некротические заболевания представляют серьезную медицинскую и социально — экономическую проблему (Брюсов П.Г., Хрупкин В. И., 1997).

В настоящее время широкое развитие механизации и автоматизации, рост тяжелой индустрии и химической промышленности, а также широкое использование электрической и атомной энергии в науке и промышленности способствуют значительному увеличению ожогов (Дмитриенко О. Д., 1991), механо — термических поражений (Микаелян А. А. и др., 1990; Шаховец В. В. и др., 1991; Джитова И. Г. и др., 1998), гнойно-некротических осложнений и заболеваний (Кузин М.И. и др., 1987; Любарский М. С., 1989; Ефименко Н. А., Нуждин О. И., 1998).

Нет сомнения, что в ответ на массивную травму в организме развивается множество патологических процессов, которые захватывают практически все органы и системы, приводят к выраженному нарушению гомеостаза, срыву адаптационных механизмов (Ерюхин И.А., 1997). Что способствует развитию глубокой депрессии как клеточного, так и гуморального иммунитета (Назаров И.П. и др., 1994), а это приводит к нарушению местных репаративных процессов и развитию инфекционных осложнений (Шкроб Л.О. и др., 1990; Шляпников С. А. и др., 1997).

Проблема регуляции воспалительных и репаративных процессов весьма актуальны в современной хирургии (Зиганшина Л.Е., Зиганшин А. У, 1996; Лавров В. А. и др., 1998).

Нарушение процессов тканевой репарации, особенно у лиц пожилого возраста, ослабленных, имеющих иммунные нарушения, часто замедляет заживление ран (Bideau J.C., Echinard C., Damour O., 1992). Даже небольшие по глубине и площади раны из-за выраженных нарушений трофики могут с трудом поддаваться лечению, формируя контингент больных с длительно незаживающими ранами после ожогов, огнестрельных ранений и вскрытия флегмон (Ханин А.Г., Суховеров А. С., 1997; Нузов Б. Г. и др., 1998). Несмотря на то, что для их лечения предложен широкий выбор способов лечения, проблема остается актуальной (Басов В.З., 1997; Поято Т. В. и др., 1998). кожа клетка иммунный трансплантация Большое значение имеет поиск новых методов лечения ран любого генеза во время катастроф и стихийных бедствий, где данная патология занимают одно из ведущих мест (Дмитриева Т.Б., Гончаров С. Ф., 1998).

Лечение обширных ожогов — одна из наиболее трудноразрешимых проблем комбустиологии. Существующие биологические и синтетические материалы могут быть использованы лишь в качестве временного закрытия ожоговых ран (Purdue G. F. et al., 1997). Известные способы аутодермопластики не всегда приемлемы, поскольку существует дефицит донорской кожи, особенно, у детей, у септических больных (Hanshmungh J.F. et al., 1997). Кроме того, аутодермопластика может расцениваться как операция риска и являться дополнительной травмой (Соколов В.А., Бурмистров В. М., 1995; Caruso D.M. et al, 1996).

В связи с этим исследования, направленные на поиск новых способов восстановления кожного покрова имеют большое практическое и научное значение.

Наиболее перспективным представляется метод выращивания клеток кожи больного и самой кожи в лабораторных условиях с последующей трансплантацией их на рану (Каншин Н.Н., Воленко А. В., Магомедов М. К. и др. 1989; Островский А. А., Меламед В. Д., Смотрин С. М., 1990; Туманов В. П., и др., 1990; Малахов С. Ф. и др., 1992; Алейник Д. Я., 1994, Колокольцова Т. Д. и др. 1997; Rennekampff Y. O et al., 1996; Lin R.Y., Adzick N.S., 1996).

Однако широкому клиническому использованию трансплантатов клеточных структур препятствуют трудности, связанные с длительными сроками выращивания и большими затратами на их получение (Алексеев А.А. и др., 1998, Юрченко Н. Д. и др., 1998).

Решить данную проблему можно, используя в лечении ожоговых ран культивированные аутои аллоклетки (Eming S.A. et al., 1996).

Одним из наиболее перспективных направлений является, применение в ожоговой терапии фетальных тканей человека (Гребенникова Н.В. и др., 1995; Сергеев В. Г., 1996). Перспективность данного направления исследований обусловлена высоким потенциалом жизнеспособности фетальных клеток (Куликов В.И., Сухих Г. Т., Молнар Е. М., 1996; Lin R.Y., Adzick N.S., 1997). В последние годы много публикаций появилось по использованию эмбриональной ткани и клеток в онкологии, травматологии (Кулаков В.И. и др., 1996; Родионов С. Ю. и др., 1996), нейрохирургии (Брюховецкий А.С., Ушаков С. О., 1996; Ярыгин В. Н. и др., 1997), эндокринологии (Скалецкий Н.Н., Шумаков В. И., 1996). Изучение возможности использования эмбриональных клеток кожи открывает новое перспективное направление. Разработка технологии применения эпидермальных клеток фетуса человека, заранее аттестованных и заложенных на хранение в ампулах в достаточном количестве, позволит обеспечить стандартным клеточным материалом тяжелообожженных при чрезвычайных ситуациях (Алейник Д.Я., 1994; Васильев А. В., Логинов Л. П. и др. 1994; Блинова М. И., Парамонов Б. А., 1996).

Заживление раны — сложнейший биологический процесс, в котором участвуют не только клеточные элементы соединительной ткани, но и многочисленные факторы иммунной системы, в том числе и цитокины (Ковальчук Л.В., Ганковская Л. В., 1995). При сбалансированном соотношении регенерации и воспаления происходит оптимальное заживление раны. При иммуносупрессивном состоянии нарушаются регенераторные процессы, развиваются воспалительные реакции. Раны заживают с частыми осложнениями. Использование цитокинов заданной специфичности, дает возможность корригировать репаративные процессы в ране (Потапнев М.П., 1995; Черных Е. Р., 1996).

Изучение иммунологических аспектов, влияющих на репаративные процессы в ране и восстановление кожного покрова, признается фундаментальным направлением (Шкроб Л.О., и др., 1990; Ковальчук Л. В., Ганковская Л. В., 1996; Ганова Л. А. и др. 1996).

Целью исследования являлась разработка технологии культивирования и применения клеток кожи в лечении длительно незаживающих ран и изучение особенности течения репаративных процессов при их применении.

Задачи исследования:

• 1. Изучить возможности культивирования клеток ауто — и аллокожи в лабораторных условиях для эффективного лечения дефектов кожи.
• 2. Оценить состояние клеточного звена иммунной системы у больных с длительно незаживающими ранами и его влияние на репаративные процессы в ране.
• 3. Исследовать репаративные процессы в ране при трансплантации на нее культивированных клеток кожи.
• 4. Изучить эффективность воздействия на репаративные процессы в ране при использовании клеток кожи эмбриона.
• 5. Изучить особенности репаративного процесса в длительно незаживающих ранах при аппликационном применении цитокинов.
• 6. Провести сравнительную оценку клинической эффективности новых технологий в лечении длительно незаживающих ран в сравнении с контрольной группой.

Научная новизна исследования Разработаны способы выращивания культуры клеток на целлофановой подложке и в геле.

Впервые применена методика транспортировки культуры клеток в геле, что позволяет перевозить материал на большие расстояния и сохранять жизнеспособный материал в течение недели.

Выявлено, что у больных с длительно незаживающими ранами имеется снижение функциональной активности нейтрофилов в ране.

Изучено влияние культивированных фибробластов на репаративные процессы в длительно незаживающей ране и доказано, что они активизируют регенерацию и увеличивают скорость эпителизации.

Доказанно, что культивированные клетки обладают бактерицидностью. Особенно большим санирующим потенциалом обладают культивированные фибробласты эмбриональной ткани.

Изучены особенности течения III фазы воспаления при трансплантации клеток кожи эмбриона и доказана их эффективная функция в ангиогенезе и быстром восстановлении раны грануляционной тканью и эпителием.

Изучены репаративные процессы в длительно незаживающей ране при аппликации цитокинов и доказано их эффективное влияние на эпителизацию раны, что позволяет принципиально изменить течение воспалительного процесса и регенерации при многих заболеваниях.

Результаты, полученные по применению эмбриональных клеток человека, открывают новые возможности лечения путем использования штаммов диплоидных клеток кожи человека, аттестованных и заложенных на хранение.

Разработаны подходы к созданию и применению банка клеток кожи человека, потенциально пригодных для терапии ожогов в клинике и при чрезвычайных ситуациях.

Практическая значимость исследования.

• 1. Разработан способ забора, транспортировки, хранения, получения и культивирования клеток кожи.
• 2. Получено три формы фасовки культивированных фибробластов: на микроносителях, целлофановой подложке и в геле, что позволяет применять их в разных условиях с учетом дальности и длительности доставки до больного.
• 3. Разработано три новых способа местного лечения длительно незаживающих ран.
• 4. Применение культивированных фибробластов позволяет сократить потребности аутокожи при обширных ожогах, за счет использования кожных лоскутов с большим коэффициентом перфорации.
• 5. Предложенные способы лечения позволяют закрыть дефект кожи до 200 см² без оперативного вмешательства, за счет усиления краевой эпителизации.
• 6. При применение новых способов лечения, длительность стационарного лечения больных сокращается в 2- 3 раза.

Положения выносимые на защиту:

• 1. В лабораторных условиях возможно культивирование большого количества аутои аллофибробластов для эффективного использования в лечении обширных ран.
• 2. Наибольшим пролиферативным потенциалом обладают фибробласты эмбриона, что позволяет хранить их в банке клеток кожи в режиме «до востребования».
• 3. Разработаны способы культивирования, транспортировки клеток кожи на микроносителях, на целлофановой подложке и в геле.
• 4. В длительно незаживающей ране у 24% пациентов выявлена сниженная функциональная активность нейтрофилов, в результате чего бактериальная инфекция может вызывать увеличение глубины ожога и препятствовать процессу заживления ран.
• 5. Главным фактором в патогенезе хронического воспаления является несостоятельность (первичная или вторичная) фагоцитарной системы, что требует искусственной активации мононуклеарных клеток для разрыва цепи хронического воспаления.
• 6. Трансплантация культивированных клеток кожи позволяет разорвать патогенез хронического воспаления за счет активации фагоцитарной активности мононуклеарных клеток, увеличения продукции факторов роста и макромолекул внеклеточного матрикса.
• 7. Применение культивированных фибробластов, эмбриональных клеток и цитокинов позволяет активизировать процесс репаративной регенерации и ускорить в 2 — 3 раза заживление раны по сравнению с возможностями традиционных методов.