Высокоэффективная жидкостная хроматография лекарственных препаратов

Хроматография была открыта М. С. Цветом в 1903 г. в виде колоночного жидкостно-адсорбционного метода. В этом методе использовались адсорбенты с размером зерен более 50—100 мкм, элюент проходил через колонку самотеком за счет силы тяжести, проточных детекторов не было. Разделение происходило медленно, в течение нескольких часов, и в таком режиме жидкостная хроматография не могла быть использована для аналитических целей.

Хроматография — метод разделения смесей веществ, основанный на последовательном многократном перераспределении компонентов смеси между несмешивающимися неподвижной и подвижной фазами, движущимися относительно друг друга. В качестве неподвижной фазы, как правило, выступает твердая или жидкая субстанция со специально подобранными или направленно сформированными физико-химическими свойствами. Подвижной фазой может быть газ, и тогда эту разновидность называют газовой хроматографией (ГХ), либо — жидкость, и соответственно, такая хроматография называется жидкостной (ЖХ). В жидкостной хроматографии неподвижной фазой является твердый сорбент, через который с определенной скоростью движется подвижная жидкая фаза — элюент.

Отличительной особенностью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3—5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). Высокоэффективная жидкостная хроматография — наиболее эффективный метод анализа органических проб сложного состава.

Почти все существующие методы анализа органических соединений непосредственно приложимы лишь к индивидуальным соединениям или простейшим смесям. Так, одновременное раздельное определение 2—3 соединений титриметрическими или спектрофотометрическими методами осуществимо лишь в редких случаях, когда свойства определяемых соединений в достаточной степени различаются.

При разработке титриметрических и спектральных методик требуется немало труда, чтобы доказать специфичность метода, выявить условия и примеси, мешающие выполнению анализа. Хроматография, объединяющая в одном эксперименте разделение и анализ, почти лишена этих недостатков, и поэтому ее применение для анализа сложных смесей предпочтительней.

Процесс анализа пробы делится на 2 этапа:

разделение пробы на составляющие компоненты;

детектирование и измерение содержания каждого компонента.

Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы.

Компоненты пробы, введенной в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени.

Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок можно управлять степенью разделения анализируемых веществ.

Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки.

Температура хроматографической колонки может быть комнатной, что позволяет хроматографировать белки, аминокислоты и другие термически нестойкие соединения. Молярная масса разделяемых веществ может достигать ~2000. На рис. 1 показана принципиальная блок-схема жидкостного хроматографа.

Резервуар 1 для растворителя из нержавеющей стали или другого материала может иметь в аналитическом варианте объем около 1 л. Насос 2 служит для подачи жидкой фазы из резервуара 1 под повышенным давлением. Он обеспечивает подачу жидкости со скоростью до 10 мл/мин при высоком давлении на входе в колонку — до 100−500 атм. Между насосом и колонкой устанавливается фильтр с диаметром пор около ~10 мкм.

В микроколоночных жидкостных хромотографах применяют насос низкого давления до 10−20 атм.

Для ввода анализируемой пробы служит устройство 3. При давлении жидкости, превышающем ~120 атм., ввод пробы шприцем затруднителен, поэтому используют специальные многоходовые краны. Объем вводимой пробы может составлять 0.05−50 мкг.

Аналитическую хроматографическую колонку 4 обычно делают из нержавеющей стали или толстостенного стекла, длиной ~10−25 см (может быть и больше), с внутренним диаметром 3−8 мм. Предпочтительны прямые колонки.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют колонки меньшей длины с внутренним диаметром 1−2 мм и даже меньше.

Устройство для ввода пробы и хроматографическая колонка находятся в воздушном или водяном термостате 5, которых поддерживает заданную температуру с точностью до 0.1 °C.

Рабочая температура термостатирования лежит между температурами замерзания и кипения жидкой ПФ (подвижной фазы), чаще всего в диапозоне от 20 до 50 °C.

Система 6 включает детектор специального типа. Применяют спектрофотометрические (с постоянной или переменной длиной волны), рефрактометрические, адсорбиционно-термометрические, флуориметрические детекторы и некоторые другие.

Детекторы бывают двух типов. Детекторы первого типа реагируют на изменение свойств растворителя (например, показателя преломления). Детекторы второго типа реагируют на свойства растворенного вещества, например, спектрофотометрические детекторы, обладающие высокой чувствительностью и селективностью.

Сигнал от детектора преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем на бумаге в виде хроматограммы, аналогичной хроматограмме в ГЖХ.

В ВЭЖХ используют как нормально-фазовый, так и обращенно-фазовый варианты. В первом случае полярность НФ больше полярности ПФ, во втором, наоборот, полярность НФ меньше полярности ПФ.