Методы направленного мутагенеза

Методы направленного мутагенеза

Мутагенез — внесение изменений в нуклеотидную последовательность ДНК (мутаций). Различают естественный (спонтанный) и искусственный (индуцированный) мутагенез.

Естественный мутагенез.

Естественный, или спонтанный, мутагенез происходит вследствие воздействия на генетический материал живых организмов мутагенных факторов окружающей среды, таких как ультрафиолет, радиация, химические мутагены.

Механизмы мутагенеза.

Последовательность событий, приводящая к мутации (внутри хромосомы) выглядит следующим образом. Происходит повреждение ДНК. Если повреждение ДНК не было корректно, оно приведет к мутации. В случае если повреждение произошло в незначащем фрагменте ДНК, или если повреждение произошло в значащем фрагменте и, вследствие вырожденности генетического кода не произошло нарушения, то мутации образуются, но их биологические последствия будут незначительными или могут не проявиться. Мутагенез на уровне генома также может быть связан с инверсиями, полиплоидией, и анеуплоидией, удвоением, утроением (множественной дупликацией) и т. д., некоторых хромосом.

В настоящее время существует несколько подходов, использующихся для объяснения природы и механизмов образования точечных мутаций. В рамках общепринятой модели считается, что единственной причиной образования мутаций замены оснований являются спорадические ошибки ДНК-полимераз. В настоящее время такая точка зрения является общепринятой. Уотсон и Крик предложили модель спонтанного мутагенеза. Они объяснили появление спонтанных мутаций замены оснований тем, что при соприкосновении молекулы ДНК с молекулами воды могут изменяться состояния оснований ДНК. Образование мутаций замены оснований объяснялось образованием пар. Предполагается, что одной из причин образования мутаций замены основания является 5-метилцитозина.

Искусственный мутагенез.

Искусственный мутагенез широко используют для изучения белков и улучшения их свойств (направленной эволюции).

Направленный мутагенез.

Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом. Для направленного мутагенеза клонированных генов используют разные экспериментальные подходы:

• — в одних случаях вносят изменения в специфические сайты клонированного гена (сайт ­ специфический мутагенез);
• — в других — случайным образом изменяют короткий фрагмент кло­нированного гена (случайный мутагенез). Одним из наиболее простых методов внесения мутаций в клонированный ген является сайт ­ специфический мутагенез.

Традиционная схема сайт ­ специфического мутагенеза сводится к следующему: мутагенез нуклеотидный дезоксирибонуклеиновый.

• — фрагмент ДНК, в котором необходимо получить мутацию, переводят в однонитевую форму на каком либо векторе;
• — синтезируют, размером 7−21 п. н. (синтез — линкеров, адаптеров, промоторов — проводят химическим способом, наращивая их цепочки путем присоединения определенных звеньев к заданной последовательности). При этом исследователь может получить на нем различные точечные, которые должны находиться в центральной части нуклеотида;
• — получают замкнутое кольцо ДНК, нуклеазой S1 убирают незавершенные продукты синтеза;
• — кольцевой ДНК трансформируют E. coli. После трансформации и последующего акта репликации потомство анализируют на наличие клеток дикого типа и мутантов (их соотношение должно быть равным 1:1). Выход мутантов можно увеличить, если суммарную ДНК, выделенную из фагов, повторно использовать для синтеза in vitro c помощью тех же синтетических праймеров. Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олиго нуклеотидных праймеров.

Синтезируют «вырожденные» праймеры, т. е., такие, в одном из сайтов которых находятся разные нуклеотиды. При использовании таких праймеров после ПЦР образуется набор мутантных штаммов с различными нуклеотидными заменами в специфическом сайте. Таким образом, в данном сайте происходят разные аминокислотные замены, в результате которых могут случайно синтезироваться белки с полезными свойствами. Если ни один из образующихся белков не обладает нужными свойствами, процедуру надо начинать сначала, т. е., синтезируют новый набор «вырожденных» праймеров, другой области гена.

Если работа увенчалась успехом, то молекулы встраивают в соответствующий плазмидный вектор. Этот подход позволяет получить измененные гены со случайными мутациями.

Сегмент — направленный мутагенез.

Так, К. Чу с соавторами (1979 г.) обрабатывали определенные ЈcoRIфрагменты ДНК вируса простого герпеса и затем вводили их в чувствительные клетки животных одновременно с неповрежденной ДНК вируса дикого типа. Похожие эксперименты выполнили Т. Волкер и М. Шоу (1980 г.), но в данном случае мутагеном обрабатывались целиком гибридные плазмиды, содержащие fig/II-фрагменты генома фага Т4. Затем за счет рекомбинации in vivo фрагменты ДНК встраивались в соответствующие им районы фагового генома. В результате получены мутанты фага по локализованным областям ДНК.

Однако использование молекул РНК в качестве носителей групп имеет ряд ограничений. В частности, при этом исключается возможность получения мутаций в районах генома. Кроме того, выделить мРНК, транскрибированные с отдельных генов, в большинстве случаев довольно сложно. С другой стороны, набор, позволяет получать фрагменты ДНК практически из любого участка изучаемого генома. Решение данной задачи значительно упрощается при использовании ПЦР. Другой подход к получению направленных мутаций разработан в лаборатории К. Вейссмана (1978 г.). Мутагенного эффекта достигали путем включения в синтезируемую цепь ДНК аналогов нуклеотидов.

После репликации in vivo за счет измененного спаривания с аналогами получали мутантные последовательности. В качестве объекта исследования авторы взяли кДНК /3-глобина кролика, клонированную в составе плазмиды рМВ9. При этом каждая из цепей ДНК разрывалась примерно с одинаковой частотой, и в результате формировалось два типа молекул с ником в той или иной цепи. Получающийся при этом широкий спектр мутантов позволяет проводить исследование структурно-функциональной организации изучаемого локуса. Недостатки данного подхода состоят в том, что с его помощью сложно получить мутант со строго определенными заменами нуклеотидов и нельзя ввести в ДНК заранее запланированные делеции и вставки. Эти возможности обеспечивает нуклеотид — направленный (сайтспецифический) мутагенез.