Сравнительный анализ методик, используемых при идентификации веществ

В настоящее время фармацевтический рынок полон фальсифицированнх ЛС. Поэтому, чтобы не допустить некачественную продукцию в продажу проводят идентификацию. В исследуемых фармакопеях приводятся различные методы идентификации данной группы ЛС [17].

Представители андрогенных гормонов

Таблица 2 — Сравнительная характеристика методов идентификации метилтестостерона.

Идентификация метилтестостерона по МФ проводится по следующим методикам:

• 1. ИК-спектроскопия. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом метилтестостерона СО, илиспектру сравнения метилтестостерона.
• 2. Проводят испытание методом ТСХ, используя в качестве адсорбента кизельгур и импрегнируя пластинку в смеси 10 объемов пропиленгликоля и 90 объемов ацетона путем погружения ее на 5 мм ниже поверхности жидкости. После того как фронт растворителя пройдет не менее 16 см, вынимают пластинку из хроматографической камеры и выдерживают ее при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Используют импрегнированную пластинку в пределах 2 ч с момента приготовления, проводя хроматографирование в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют смесь 80 объемов циклогексана и 20 объемов толуола. Наносят отдельно на пластинку по 2 мкл каждого из двух растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих: (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца метилтестостерона СО в 1 мл. Проводят хроматографирование до прохождения фронта растворителя на 15 см. Вынимают пластинку из хроматографической камеры, дают ей высохнуть на воздухе до удаления растворителей, нагревают при 120 °C в течение 15 мин, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают при 120 °C в течение 10 мин. Дают охладиться и оценивают хроматограмму в дневном свете и ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, полученное с раствором А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности пятну, полученному с раствором Б.
• 3. Температура плавления около 165 °C [10].

Идентификация метилтестостерона по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

1. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора метилтестостерона в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора метилтестостерона полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

Рисунок 1 — Спектр в УФ-области метилтестостерона.

2. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения метилтестостерона, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром высушенного метилтестостерона эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

Рисунок 2 — Инфракрасный спектр пропускания метилтестостерона.

3. Температура плавления 163- 1680С [11].

Идентификация метилтестостерона по Европейской и Британской фармакопеям проводится по следующим методикам:

А. Температура плавления: 162 ° C до 168 ° C.

В. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной области спектра.

С. ТСХ. В качестве сорбента используют силикагель F254, нанесенный на пластинку. В качестве подвижной фазы используют смесь безводной уксусной кислоты, петролейного эфира и бутилацетата (1:30:70). Наносят на пластинку отдельно по 5 мкл каждого из 2 растворовв смеси 1 части метанола и 9 частей хлороформа, содержащих (А) 0,2 г испытуемого вещества в 10 мл и (Б) 20 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 10 мл. После того как растворитель достигнет высоты более 2/3 от пластины, извлекают пластинку из хроматографической камеры и сушат на воздухе. Оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм), а также путём опрыскивания насыщенным раствором дихромата калия в смеси 30 объемов воды и 70 объемов серной кислоты, затем рассматривают при дневном свете. Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б [12, 13].

Идентификация метилтестостерона по фармакопее США проводится по таким же методикам, что и в Японской фармакопее (ИКи УФ-спектроскопия).

Таблица 3 — Сравнительная характеристика методов идентификации тестостерона энантата.

Идентификация тестостерона энантата по МФ проводится по следующим методикам:

• 1. ИК-спектроскопия. Инфракрасный спектр соответствует спектру, полученному со стандартным образцом тестостерона энантата СО, или спектру сравнения тестостерона энантата.
• 2. ТСХ. В качестве сорбента используют кизельгур и смесь объемов жидкого парафина и 90 объемов петролейного эфира для импрегнирования пластинки путем погружения ее на глубину около 5 мл в жидкость. После того как растворитель достигнет высоты по крайней мере 16 см, извлекают пластинку из хроматографической камеры и оставляют ее при комнатной температуре до полного испарения растворителей. Используют импрегнированную пластинку в течение 2 ч, проводят хроматографию в том же направлении, что и импрегнирование. В качестве подвижной фазы используют смесь 4 объемов ледяной уксусной кислоты и 6 объемов воды. Наносят на пластинку отдельно по 2 мкл каждого из 2 растворов в смеси 9 объемов хлороформа и 1 объема метанола, содержащих (А) 1,0 мг испытуемого вещества в 1 мл и (Б) 1,0 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 1 мл. Проводят хроматографию до прохождения фронтом растворителя отметки 12 см. После извлечения пластинки из хроматографической камеры дают ей высохнуть на воздухе до испарения растворителей, нагревают 5—10 мин при 120 °C, опрыскивают раствором 4-толуолсульфоновой кислоты в этаноле и затем нагревают 10 мин при 120 °C. Дают остыть и оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (365 нм). Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б.
• 3. Суспендируют 5 мг испытуемого вещества в 2,0 мл смеси предварительно охлажденных 2 объемов серной кислоты (~1760 г/л) ИР и 1 объема этанола (~750г/л) ИР, затем помещают в водяную баню; появляется зеленовато-желтая флуоресценция, которая сменяется оранжевой, в то время как стенки пробирки окрашиваются в дихроичный синий цвет, сменяющийся красным ниже определенной глубины [10].

Идентификация тестостерона энантата по Японской фармакопее проводится по следующим методикам:

• 1. Нагревают 25 мг тестостерона энантата с 2 мл раствора гидроксида калия в метаноле (1 к 100) с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 часа, охлаждают и добавляют 1 мл воды. Собирают полученный осадок путём всасывания, промывают водой до тех пор пока последняя промывка не получится нейтральной, и сушат осадок в эксикаторе (в вакууме фосфора (V) оксида) в течение 4 часов: осадок плавится между 151° C и 157 °C.
• 2. УФ-спектроскопия. Определяют спектр поглощения раствора тестостерона энантата в этаноле (1:100.000) и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром эталонного раствора тестостерона энантата, полученного таким же образом, как раствор образца: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны.

Рисунок 3 — Спектр в УФ-области тестостерона энантата

3. ИК-спектроскопия. Определяют инфракрасный спектр поглощения тестостерона энантата, предварительно высушив, и сравнивают спектр с эталонным спектром или спектром высушенного тестостерона энантата эталонного стандарта: оба спектра имеют одинаковую интенсивность поглощения при той же длине волны [11].

Рисунок 4 — Инфракрасный спектр пропускания тестостерона энантата Идентификация тестостерона энантата по Европейской и Британской фармакопеям проводится по следующим методикам:

А. Температура плавления: от 34 ° C до 39 ° C.

В. Инфракрасная абсорбционная спектрофотометрия С. ТСХ. В качестве сорбента используют силикагель F254, нанесенный на пластинку. В качестве подвижной фазы используют смесь воды, ацетонитрила, 2-пропанола (20:40:60). Наносят на пластинку отдельно по 5 мкл каждого из 2 растворовв смеси 10 частей метанола и 90 частей метиленхлорида, содержащих (А) 5 мг испытуемого вещества в 10 мл и (Б) 5 мг стандартного образца тестостерона энантата СО в 10 мл. После того как растворитель достигнет высоты 15 см, извлекают пластинку из хроматографической камеры и сушат на воздухе, а затем при 100 ° С в течение 10 мин, дают остыть. Оценивают хроматограмму в ультрафиолетовом свете (254 нм), а также путём опрыскивания спиртовым раствором серной кислоты, нагревают при 120 ° С 10 мин, дают остыть, затем рассматривают при дневном свете. Основное пятно, которое дает раствор А, соответствует по положению, внешнему виду и интенсивности основному пятну, которое дает раствор Б.

D. К 25 мг испытуемого образца добавляют 2 мл 10 г / л раствора гидроксида калия в метаноле и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Добавляют 10 мл воды, подкисляют разбавленной соляной кислотой до тех пор, пока лакмусовая бумажка не станет красной. Фильтруют и промывают осадок небольшим количеством воды. Остаток после сушки при 60 ° С и при давлении, не превышающем 0,7 кПа, в течение 3 ч имеет температуру плавления от 150 ° С до 153 ° С [12, 13].

Идентификация тестостерона энантата по фармакопее США имеет одинаковые методики, что и в Японской фармакопее (ИКи УФ-спектроскопии). Фармакопея США имеет также схожую методику проведения реакции с раствором гидроксида калия в метаноле, как и в Европейской фармакопее. Однако отличие состоит в том, что температура плавления образовавшегося осадка по фармакопее США имеет пределы от 1510 до 1570С [14].