Возможности флуоресцентного метода

Флуориметрия — один из эмиссионных аналитических методов и относится к фотометрическим методам. Позволяет обнаруживать микрои нанограммовые количества анализируемых веществ с достаточной точностью, что используется в анализе примесей. Наличие двух характерных максимумов (в спектре возбуждения и в спектре излучения флуоресценции) увеличивает избирательность определения. Изменение цвета и выхода флуоресценции при смене растворителя и рН используется для идентификации и исследования структурных особенностей молекул.

Во флуоресцентном анализе растворов обычно используются следующие свойства:

• а) способность к флуоресценции самого соединения в зависимости от свойств растворителя (рН, диэлектрическая проницаемость);
• б) возникновение или изменение флуоресцентных свойств в присутствии катионов металлов (хелатообразование);
• в) образование флуоресцирующих ассоциатов;
• г) возникновение или изменении флуоресценции флуорогенного метчика при присоединении к нему определяемого соединения;
• д) возникновение флуоресценции в процессе взаимодействия исследуемого соединения и реагента в результате образования нового соединения с высоко поглощающей устойчивой структурой;
• е) возникновение флуоресценции в результате присоединения к исследуемому соединению «флуорофора» — группировки, повышающей поглощающую и излучающую способность;
• ж) возникновение флуоресценции в результате электронных перегруппировок внутри молекулы без изменения ее формулы (окислительно-восстановительные процессы);
• з) «тушение» собственной флуоресценции одного вещества в присутствии другого.

Современная аналитическая химия располагает широким выбором методик проведения флуоресцентного анализа, применяемых в различных областях медицинской науки для контроля содержания лекарственных веществ в различных объектах. Тем не менее, флуоресцентный метод имеет ряд недостатков, основными из которых можно считать низкий порог концентрационного тушения и необходимость использования стандартных образцов при проведении анализа флуоресцирующих соединений. Эти недостатки существенно ограничивают использование флуориметрии в фармацевтической и биофармацевтической практике, не позволяя проводить флуоресцентные определения в растворах веществ, имеющих концентрацию более 15−20 мкг/мл. Необходимость разбавления анализируемых проб приводит к увеличению систематических ошибок анализа и заметно снижает экспрессность методик. 16,51,54,55,59].

В работах, посвященных проблеме возникновения тушения при флуоресцентных исследованиях, как правило, приводится классификация различных видов тушения, их механизмы и условия проведения флуориметрических определений, которые позволяют избежать процесса тушения. Наиболее приемлемы две основных теории возникновения концентрационного тушения.

Первая теория показывает, что при увеличении количества частиц анализируемого вещества происходит увеличение взаимодействия между этими частицами и, соответственно, вероятность безизлучательных энергетических переходов. Такое изменение в энергетике молекул уменьшает квантовый выход флуоресценции.

В основу второй теории положен миграционный механизм концентрационного тушения, весьма важным условием, которого является значительное перекрывание спектров поглощения и излучения анализируемого вещества. Согласно этой теории возможна индукционно резонансная передача энергии, т. е. процесс безизлучательной передачи энергии облегчается тем, что строение высшего Ьо энергетического уровня возбужденной молекулы, близко к строению низшего Si уровня излучающей молекулы. [54,55,57,58].

Хотя явление концентрационного тушения основательно изучено и описано различными исследователями, подходы и направления к преодолению порога концентрационного тушения сводятся, как правило, к разбавлению растворов или измерению флуоресценции с поверхности анализируемой пробы. Новый подход к решению этой проблемы состоит в контролируемом изменении интенсивности возбуждающего светового потока или изменении толщины поглощающего/излучающего слоя жидкости. 56,63].

Поглощение света, безусловно, является необходимым условием флуоресценции, но в тех случаях, когда поглощение раствора слишком высоко, световой поток не проходит через него и не может служить источником возбуждения. Как известно, при высоких концентрациях участки раствора, расположенные ближе к источнику возбуждения, поглощают большее количество света, чем дальше расположенные. Интенсивность освещения раствора и, соответственно, излучение прогрессивно убывают по мере удаления от источника (внутреннее экранирование).

Процесс флуоресценции веществ подчиняется законам светопоглощения, как и все оптические методы анализа: интенсивность проходящего через раствор вещества светового потока уменьшается согласно закону Бера — Ламберта:

I = I0 -kcl (1),.

где: I — интенсивность светового потока, проходящего через раствор;

Iоинтенсивность падающего света;

К — коэффициент поглощения раствора;

С — концентрация вещества;

I — длина пути светового потока в поглощающем растворе вещества.

Интенсивность флуоресценции (испускаемой во всех направлениях) зависит от количества поглощаемого флуоресцирующим объектом света и квантового выхода флуоресценции :

F = I0 (1 — 10-D) (2),.

где: F — общая интенсивность флуоресценции;

D — оптическая плотность раствора.

При малых величинах D" 0,1 формула (2) имеет следующий вид:

F = 10 ф (1 — (1 — D + D2/2' - D3/3' In), (3).

Или.

F = I0 D (4).

Таким образом, зависимость F от D (с учетом значения квантового выхода и интенсивности возбуждающего света) является линейной, что более удобно для экспериментальных исследований. Переход к линейной зависимости позволяет рассчитывать концентрацию флуорофоров по законам светопоглощения.

Однако необходимо вычислить минимальное значения оптической плотности раствора D0, при которых ошибка измерения интенсивности флуоресценции не превышает некоторой заданной величины.

Как правило, линейная зависимость флуоресценции от концентрации раствора наблюдается до тех пор, пока количество флуоресцирующего вещества не становится настолько большим, что раствор начинает поглощать значительное количество возбуждающего света. Боуен и Уокс показали, что для получения линейной зависимости раствор должен поглощать менее 5% возбуждающего света. Поэтому Dn = 2,0×0,05 = 0,1, то есть предел линейной зависимости флуоресценции от концентрации определяется достижением оптической плотности D = 0,1.

Поскольку D = KCL, то одной и той же оптической плотности могут соответствовать различные концентрации в зависимости от толщины поглощающего слоя. Следовательно, использование кювет с различной толщиной рабочего слоя позволяет применять флуориметрию для измерения высоких концентраций без предварительного разбавления проб. При практическом использовании этого приема выявлена закономерность, связывающая изменения толщины рабочего слоя кюветы и предела обнаружения методики: при уменьшении рабочего слоя в 2 раза верхний пределе линейности калибровочного графика увеличивается в среднем в 1,4 раза.

Измерения отношения интенсивности флуоресценции вещества к интенсивности облучающего пробу светового потока (F/I0) позволяет определять величину, подобную оптической плотности в спектрофотометрии. Эта величина зависит только от концентрации исследуемых веществ при использовании стандартных кювет, что позволяет стандартизовать измерения флуоресценции и избавится от необходимости использования стандартных растворов Характер и интенсивность флуоресценции вещества зависят не только от его структуры, но и от растворителя.

Те вещества, которые в твердом состоянии флуоресцируют фиолетовым светом, в растворе должны быть лишены флуоресценции в видимой части спектра. В большинстве случаев спектр флуоресценции вещества при его растворении немного смещается в сторону более коротких длин волн. Однако смена растворителя также вызывает неоднозначные изменения флуоресцентных свойств растворов.

Зависимость флуоресценции от природы растворителя в одних случаях выражается в незначительном смещении полосы или ее максимума. В других — к исчезновению, или проявлению флуоресцентных свойств. Так производные антрацена в н-гексане имеют характерный спектр флуоресценции и не флуоресцируют в воде и спиртах.

Наиболее сильно проявляется зависимость флуоресценции от рН растворителя, особенно, если вещество обладает выраженными кислотными или основными свойствами. Области флуоресценции нейтральной молекулы и ионизированной молекулы значительно различаются.

Взаимодействия между молекулами растворенного вещества и растворителя обычно разделяют на следующие типы: 1) между диполями, 2) между электронными системами, 3) химические взаимодействия. При каждом из трех типов взаимодействия могут усиливаться флуоресцентные свойства растворов, если взаимодействие приводит к стабилизации структуры растворенного вещества. 51,59,83].